Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 ^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Der axonale Transport kann durch Visualisierung der segmentalen Nerven der Larven untersucht werden. Ein drittes Stadium Drosophila. Die Larve wird zunächst präpariert, wobei das ZNS freigelegt wird, ohne die Sehlappen, das Ganglion ventralis und die Nervus segmentalis zu beschädigen.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Lava in Formaldehyd zu fixieren, bevor sie über Nacht mit dem primären Antikörper und eine Stunde lang im Dunkeln mit dem sekundären Antikörper inkubiert wird. Die Lava wird dann auf einen Glasschieber montiert und mit axonalen Transportdefekten versehen. Die Proteinlokalisation und Proteinverteilung kann durch Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in den axonalen Transport geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Synapse und Muskelmorphologie angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es anfangs schwierig ist, diese zulässige Dissektion durchzuführen, insbesondere um die segmentalen Nerven und Muskeln des Gehirns intakt zu halten. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie einmal Dissektionspuffer-Fixiermittel, einmal PBT und 5%ige BSA-Lösung vor.

Wie in der vor der Sektion gezeigten Tabelle beschrieben, sammeln Sie ein sauberes Paar Bizeps Nummer fünf, eine saubere Fächerschere mit gerader Klinge und Stecknadeln, um die Sektion zu beginnen, und verwenden Sie einen Mikrolöffel, um wandernde Stücke zu sammeln. Dritte Sternlarven mit einem spezifischen Genotyp auf einer Petrischale. Waschen Sie dann die Larven, indem Sie sie in einer mit deionisiertem Wasser gefüllten Petrischale abspülen, um das gesamte Futter loszuwerden.

Lege dann eine Lava mit der Rückenseite nach oben auf die S-Guard-Schale. Stecke die Lava an der Vorder- und Rückseite fest. Enden Geben Sie mit einer feinen Schere einen Tropfen des einmaligen Sezierpuffers auf die fixierte Lava.

Schneide die Lava an der dorsalen Mittellinie in der Nähe des hinteren Endes ab. Schneide mit der Schere die Lavakutikula vom hinteren Ende bis zum vorderen Ende durch. Geben Sie einen Tropfen neuen einmaligen Sezierpuffer auf die sezierte Lava.

Wähle mit einer Stecknadel eine seitliche Kante der Nagelhaut in der Nähe der Mitte der Lava aus und stecke die Nagelhaut mit einer anderen Stecknadel fest. Stecknadel. An der zweiten seitlichen Kante der Nagelhaut, zwei Stifte werden auf jeder lateralen Seite verwendet, wie in der Abbildung gezeigt. Entfernen Sie nun vorsichtig den Darm und die Fettkörper und die Traia, so dass nur das Gehirn mit den beiden Sehlappen und den ventralen Ganglien übrig bleibt.

Nachdem die segmentalen Nerven befestigt sind, werden als nächstes Fixierungen und Antikörperfärbungen durchgeführt, wobei die Larven an der Schutzschale befestigt sind. Inkubieren Sie die sezierten Larven 30 Minuten lang in 50 Mikrolitern Fixiermittel. Wechseln Sie das Fixiermittel alle 15 Minuten nach der Fixierung und spülen Sie die Larven 30 Minuten lang einmal mit PBT aus.

Wenn der Puffer alle 10 Minuten ausgetauscht wird, ist es wichtig zu beachten, dass die Larven immer in Puffer getaucht werden sollten. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie sie in der 5%igen BSA-Lösung auf die entsprechende Konzentration verdünnen. Die optimalen Konzentrationen sind für verschiedene Antikörper unterschiedlich.

Baue eine Feuchtkammer, indem du eine Plastikschale mit Kim auskleidest. In Wasser eingeweicht abwischen. Ersetzen Sie das letzte Mal PBT.

Mit der vorbereiteten Primärantikörperlösung spülen und am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in der Feuchtkammer inkubieren. Spülen Sie die sezierten Larven 30 Minuten lang in einmaligem PBT, indem Sie den Puffer alle 10 Minuten austauschen. Bereiten Sie den Sekundärantikörper vor, indem Sie ihn in der 5%igen BSA-Lösung auf die entsprechende Konzentration verdünnen.

Und wickeln Sie die Feuchtkammer in Folie ein, da einige Sekundärantikörper lichtempfindlich sind. Inkubieren Sie die Larven mit der Sekundärantikörperlösung eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Wenn die Inkubation mit dem Sekundärantikörper abgeschlossen ist, spülen Sie die Larven 30 Minuten lang in einmaligem PBT, indem Sie den Puffer alle 10 Minuten austauschen, und fahren Sie mit dem Montieren und Visualisieren der präparierten Larven fort, bevor Sie die Lava auf den Objektträger montieren.

Bereiten Sie die Folie vor, indem Sie zwei vertikale Linien Nagellack in der Mitte verteilen, mit einem Raum, der groß genug ist, dass ein Deckglas darauf sitzen kann, wie in der Abbildung gezeigt. Lassen Sie den Nagellack vollständig trocknen, wenn der Nagellack getrocknet ist. Platzieren Sie einen Tropfen Montagepuffer in den Raum zwischen den vertikalen Nagellacklinien auf der Folie, wie in diesem Bild gezeigt.

Die Rutsche ist nun bereit für die Montage. Entnehmen Sie die Larven nach dem letzten Mal PBT. Spülen Sie die seitlichen Stifte aus einer Lava ab und entfernen Sie sie vorsichtig.

Achte darauf, dass du die Nagelhaut nicht vorsichtig zerreißt. Entferne die beiden restlichen Stifte und nimm die Lava mit einer Pinzette auf und lege sie auf den vorbereiteten Objektträger. Achte darauf, dass die Lava nicht umkippt und ventral ausgerichtet ist.

Legen Sie mit der Seite nach oben vorsichtig einen Deckzettel darauf und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, wie hier abgebildet. Die Larven sind nun bereit für die Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Dieses repräsentative Bild zeigt eine Wildtyp-Lava, die mit Antikörpern gegen das synaptische vesikale Protein, das Cystin-String-Protein, gefärbt ist.

Die Segmentnerven der Lava sind glatt gefärbt. Hier. Eine Motorprotein-mutierte Lava wurde mit Antikörpern gegen CSP gefärbt. Die segmentalen Nerven zeigen massive Ansammlungen, die sich hell für CSP abfärben.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die segmentalen Nerven, die mit dem Gehirn verbunden sind, zu erhalten und die Muskeln intakt zu halten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man seziert. Fixieren Sie eine Immunfärbung am dritten und beginnen Sie mit der Untersuchung des axonalen Transports der Larvensegmentnerven mit einem Fluoreszenzmikroskop.