Name: Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die Induktion und Analyse der Class Switch Rekombination in isolierten murinen B-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von B-Zell-Proliferation und Antikörper-Isotypwechsel in vitro.

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Wir sind dankbar für die Martin-Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Publikation wird durch einen Zuschuss von der Canadian Institute of Health Research (MOP-89783) unterstützt. AM wird durch einen Canada Research Chair Tier II-Award unterstützt.

Schritt I: Isolierung von Milz B-Zellen über magnetische Anreicherung <ol><li> Experimentelle Mäuse sollten im Alter von 8-12 Wochen in voller Reifung des Immunsystems zu gewährleisten. </li><li> Euthanize der Maus durch Genickbruch und genießen in 70% Ethanol. Chirurgisch entfernen Sie die Milz durch einen Einschnitt durch die Haut und Muskulatur der linken Hypochondrium des Bauches und schneiden Sie es in drei großen Stücken in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sicherstellen, dass alle Werkzeuge und Reagenzien sind steril. </li><li> Mit dem Gummi Ende einer 1 ml Spritze Kolben, der Milz sanft Maische durch ein 70 um Zellsieb in PBS. Achten Sie darauf, eine schiebende Bewegung statt einer Schleifmaschine Bewegung als Schleifen zum Bruch von größeren (dh proliferierende) Zellen führen kann. </li><li> Spin down die Zellen bei nicht mehr als 350 g für 5 Minuten und das Pellet in PBS. Zählen Sie die resuspendierten Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Eine Suspension von 1x10 8 Zellen / ml in PBS mit 5% normalem Rattenserum in einer sterilen 5 ml Polystyrol Röhrchen mit einer Kappe (maximales Volumen von 2 ml pro Röhrchen). </li><li> Add 50 ul EasySep Negative Selection Maus B-Zell-Enrichment-Cocktail für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 15 Minuten. </li><li> 100 l EasySep Biotin Selection Cocktail für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 15 Minuten. </li><li> Add 100 L EasySep Magnetische Nanopartikel (sicher Nanopartikel sind gut gemischt und die Lösung homogen ist) für jeden mL der Zellen. Pipette die Mischung, Kappe der Rohre, und in den Kühlschrank stellen für 5 Minuten. </li><li> Top die Lösung bis 2,5 ml mit PBS und in einen EasySep Magnet für 5 Minuten. Kehren Sie die Magnet-und Rohr-und gießen schnell in eine neue Polystyrol-Röhrchen. Schütteln Sie die Röhre als negativ ausgewählten Zellen wird magnetisch auf der Rohrwandungen gebunden zu sein. </li><li> Zur weiteren Erhöhung der Reinheit der Zellsuspension kann das Rohr in den Magneten für weitere 5 Minuten wieder eingesetzt werden und in eine neue Röhre. Dies kann die gesamte Zelle Erholung. </li><li> B-Zell-Reinheit kann durch durchflusszytometrische Analyse der B-Zell-Oberflächenmarker beurteilt werden. Nach Anreicherung wir konsequent sehen einer Reinheit von&gt; 95% B220-positiven Zellen. </li></ol> Step II: CFSE Zellfärbung <ol><li> Resuspendieren der isolierten Zellen in warmen PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml ergänzt. </li><li> Bereiten Sie einen 5mm Stammlösung von CFSE (verdünnt in sterile Dimethylsulfoxid) und fügen 2μL für jeden ml der Zellen in die Röhre. Die Endkonzentration von 10 &amp;mgr; m ist optimal für die Färbung von primären B-Zellen. </li><li> Bei 37 ° C für 10 Minuten im Dunkeln (Anmerkung: CFSE ist lichtempfindlich und sollte im Dunkeln, wenn möglich gehalten werden). </li><li> Quench der Fleck durch Zugabe eines gleichen Volumens von bovinem Kälberserum Ihre Zellen und Inkubation auf Eis für 5 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Zellen im Rückgriff auf die Röhrchen mit Kulturmedium (siehe Schritt III für Rezept) und Zentrifugation bei 350 g. Beachten Sie, dass mindestens 5-mal das Volumen umgerechnet Medien hinzugefügt werden müssen, um die Viskosität des bovinem Kälberserum entgegenzuwirken und für die Zellen, um ein Pellet zu produzieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen noch zweimal in Kulturmedium. Die Zellen sind nun bereit für die Stimulation. </li></ol> Step III: Cell Stimulation mit LPS <ol><li> Bereiten Sie Ihre in vitro B-Zell-Kulturmedium durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum und 50 uM β-Mercaptoethanol /. </li><li> Bereiten Sie Ihre Stimulation Medium durch Zugabe von LPS in einer Endkonzentration von 50μg/mL. Aliquot 125 ul der Stimulation Medium in jede Vertiefung einer Flachboden 96-Well-Gewebekulturplatten. </li><li> Bereiten Sie Ihre CFSE-gefärbte B-Zellen in Kulturmedium ohne LPS in einer Endkonzentration von 3,2 x 10 6 Zellen / ml. Add 125 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen mit Ihrem Stimulation mittel-und Mix durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Jedes der gut enthält jetzt 4 x 10 5 Zellen in eine endgültige LPS Konzentration von 25 ug / mL. Dies sorgt für eine optimale Niveau der Zellproliferation und Klassenwechsel, obwohl Änderungen dieser Werte können aus beliebig. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 72 bis 96 Stunden. Nach 48 Stunden wird Cluster von großen proliferierenden B-Zellen deutlich sichtbar unter dem Mikroskop. </li></ol> Schritt IV: Durchflusszytometrische Analyse der Klassenwechsel <ol><li> Wenn Sie bereit sind, bei Klassenwechsel aussehen, entfernen Sie Ihre Zellen von ihrer Kultur Bedingungen und waschen Sie sie zweimal in 1 ml Färbepuffer (PBS mit 2% bovinem Kälberserum). </li><li> Um nicht-spezifische Antikörper-Färbung von Ihren Zellen, Pellet die Zellen durch Drehen sie sich bei 350 g und Gründerzentren verhindernte sie in 100 &amp;mgr; Färbepuffer mit 5% normalem Maus-Serum und 1 g des FcBlock per106 Zellen für 15 Minuten auf Eis. Zellen blockieren sollten auf Eis durchgeführt werden. </li><li> Ohne Waschen Sie Ihre Zellen, fügen 1 g pro 10 6 Zellen eines fluoreszenzmarkierten anti-Maus IgG3-Antikörper und damit die Zellen für 30 Minuten auf Eis Fleck. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und Resuspendieren in 200-300 ul Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. </li><li> CFSE ist optimal bei 492 nm angeregt (das von einem Argon-Ionen-Laser) und emittiert bei 517 nm. Die Anregungs-und Emissionsspektrum des IgG3-Antikörper ist abhängig von seiner Konjugat Fluoreszenzfarbstoff. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Nach magnetische Anreicherung, sollte die Zellsuspension wie eine homogene Population von ununterscheidbar kleine runde Zellen (Abbildung 1A) zu suchen. Nach 48-72 Stunden der Stimulation, wird isolierten Clustern von vergrößerten proliferierenden Zellen deutlich sichtbar (Abbildung 1B). Ein großer Anteil der nicht-proliferierenden Zellen erscheinen klein und körnig, wie sie Apoptose. CSR kann in der Regel auf der höchsten Ebene zwischen 72 und 96 Stunden nach Stimulation erkannt werden, bevor die meisten der Zellen bis 7 beginnen zu sterben. In diesem Stadium sollten die Zellen eine Reihe von Zellteilungen mit eingeschaltet Zellen, die in der späteren Tochter Zellpopulation unterzogen haben. Ein Vertreter durchflusszytometrischen Grundstück von CFSE Verdünnung und Oberflächenexpression von IgG3 nach 96 Stunden LPS-Stimulation ist in Abbildung 2 zu sehen. Tabelle 1. Isotyp Wechsel Cocktails. Hinweis: Stimulant Konzentration Werte sind nur Empfehlungen. Titrationen kann notwendig sein. <table border="1"><tbody><tr><td> Gewünschte Isotyp </td><td> Stimulation Cocktail </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) und IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) und IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) und IFN-γ (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2b und IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) und IL-5 (1,5 ng / mL) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Isolation und LPS-Stimulation von Milz-B-Zellen. (A) Magnetisch Milz B-Zellen vor LPS-Stimulation angereichert. (B) 48 Stunden nach Stimulation mit 25 pg / ml LPS. Zellen sind als Cluster in einem Hintergrund von Strahlen und apoptotische Zellen gesehen. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Proliferation und die Klasse wechseln Rekombination nach 96 Stunden. (A) CFSE Verdünnung für LPS stimulierten Zellen nach 96 Stunden in Kultur. Jeder unabhängige Peak repräsentiert eine Verdünnung in CFSE Fluoreszenz entspricht einem unabhängigen Zellteilung. (B) IgG3 Ausdruck zeigt die Entstehung einer IgG3 positive Bevölkerung nach mehreren Runden der Zellteilung.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

Das Protokoll skizzierten bietet einen Standard-Test, um AID Expression und Funktion während des Unterrichts Schalten von primären murinen B-Zellen zu analysieren. Dieses Protokoll verwendet bakterielle LPS zu induzieren Wechsel von IgM zu IgG3, obwohl Änderungen an der Stimulation Medien gemacht zu veranlassen, auf andere Isotypen (zusammengefasst in Tabelle 1 8, 9). Wir haben festgestellt, dass für noch nicht bekannte Gründe, fetales Kälberserum kann das Niveau der Klasse Wechse...

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus-B-Zell-Anreicherungskit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Zellproliferationskit</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Kälberserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Kulturmedium RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Kälberserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Normales Mausserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>Reinierter Rat Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Maus IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion und beurteilung der class schalter rekombination in purified murine b-zellen

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humorale Immunität ist der Zweig des Immunsystems durch B-Zellen gehalten und vermittelt durch die Sekretion von Antikörpern. Bei B-Zell-Aktivierung, erfährt der Immunglobulin-Locus eine Reihe von genetischen Veränderungen, die Bindekapazität und Effektor-Funktion der sekretierten Antikörper verändern. Dieser Prozess wird durch eine genomische Rekombination Veranstaltung als Klasse-Schalter Rekombination (CSR), in denen die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp für einen IgG, IgA, IgE oder substituierten bekannt ist hervorgehoben. Jeder Isotyp besitzt verschiedene Effektor-Funktionen wodurch CSR entscheidend für die Aufrechterhaltung der Immunität. Die Diversifizierung der Immunglobulin-Locus wird durch das Enzym activation-induced Cytidindeaminase (AID) vermittelt. Eine schematische Video beschreibt diesen Prozess im Detail ist online verfügbar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID-Aktivität und der CSR-Weg werden häufig bei der Beurteilung der B-Zell-Funktion und humoralen Immunität in Mäusen untersucht. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen präsentiert eine Methode der B-Zell-Isolierung von murinen Milz und nachfolgende Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren Klasse Umstellung auf IgG3 (für andere Antikörper-Isotypen siehe Tabelle 1). Darüber hinaus ist das fluoreszierende Zellfärbung Farbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) verwendet werden, um die Zellteilung der stimulierten Zellen, ein Prozess von entscheidender Bedeutung für Schalt-1, 2 Isotyp zu überwachen. Die Regulierung der AID und der Mechanismus, durch den CSR auftritt, sind noch unklar und somit in vitro-Klasse-Schalter Assays bieten eine zuverlässige Methode zur Prüfung dieser Prozesse in verschiedenen Mausmodellen. Diese Assays wurden bereits im Zusammenhang mit der Gen-Mangel mit Knockout-Mäusen 3 verwendet. Darüber hinaus können in vitro Schalten von B-Zellen durch virale Transduktion vorangestellt werden, um die Genexpression durch RNA-Zuschlag oder Transgenexpression 4-6. Die Daten aus dieser Art von Experimenten haben unser Verständnis der AID-Aktivität, die Auflösung der CSR-Reaktion und Antikörper-vermittelte Immunität in der Maus beeinflusst.

Nach Antigen Exposition unterziehen Subpopulationen von aktivierten B-Zellen ein Verfahren, wie class switch Rekombination (CSR) bekannt, dass Antikörper-Isotypen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen zu produzieren. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen erklärt, wie CSR induziert und analysiert werden können<em&gt; In-vitro-</em&gt; Für die Zwecke des Studiums B-Zell-Funktion.

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Die humorale Immunität ist der Teil des Immunsystems, der von B-Zellen aufrechterhalten und durch die Sekretion von Antikörpern vermittelt wird. Nach der Aktivierung der B-Zellen...

Während der humoralen Immunantwort proliferieren durch Antigen aktivierte B-Zellen und sezernieren Antikörper, während die Reaktion fortschreitet. Die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp wird durch die vielfältigeren IgG-, IgA- oder IgE-Isotypen ersetzt, um Proliferation und Klassenwechsel zu bewerten. In vitro werden milzige B-Zellen aus einer Versuchsmaus mittels magnetischer Zellseparation isoliert.Die Zellen werden mit dem fluoreszierenden Farbstoff CFSE gefärbt, um die Proliferation zu überwachen, die durch die Behandlung mit bakteriellem LPS stimuliert wird. LPS induziert außerdem die Klassenwechselrekom­bination zum Isotyp IgG3, die zusammen mit der Proliferation mittels Durchflusszytometrie überwacht werden kann. Heute zeige ich Ihnen eine Technik zur Isolierung und Aktivierung reiner splenischer B-Zellen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Klassenwechselrekom­bination und Proliferation in vitro zu untersuchen, und eignet sich ebenfalls dazu, zentrale Fragen im Bereich der B-Zell-Immunität zu beantworten, darunter die Funktion und Regulation der aktivierungsinduzierten Zytidin-Deaminase.Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus mit 70 % Ethanol zu benetzen. Die Maus sollte acht bis zwölf Wochen alt sein. Um die vollständige Reifung des Immunsystems sicherzustellen, verwenden Sie sterile Scheren, um einen Schnitt durch die Haut und die Muskulatur des linken Hypochondriums des Abdomens zu machen. Entfernen Sie die Milz mithilfe von Schere oder Pinzette vom umliegenden Gewebe. Schneiden Sie die Probe anschließend in drei große Stücke in PBS. Zerreiben Sie dann vorsichtig die Milz mit dem Gummikolben eines Ein-Milliliter-Spritzenkolbens durch ein 70-Mikron-Zellsieb in PBS. Achten Sie darauf, eine Druckbewegung und keine Reibbewegung zu verwenden.Da das Mahlen zum Bruch größerer proliferierender Zellen führen kann, die Zellen bei maximal 350 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Anschließend das Pellet in PBS resuspendieren.Zählen Sie die resuspendierten Zellen mithilfe eines Hämozytometers in einem sterilen Polystyrolröhrchen mit fünf Milliliter Volumen. Bereiten Sie eine Suspension von eins mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter in PBS mit 5 % normalem Rattenserum vor. Pro Röhrchen können maximal zwei Milliliter zugegeben werden.Danach 50 Mikroliter EP-Negativselektion. Maus-B-Zell-Anreicherungs-Cocktail für jedes Milliliter Zellen. Dann verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie 15 Minuten lang in den Kühlschrank.Geben Sie pro Milliliter Zellen 100 Mikroliter EP-Biotin-Selektionscocktail hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie nach der Inkubation mit dem EP-Magnetnanopartikel-Biotin-Selektionscocktail-Mix für 15 Minuten in den Kühlschrank, und fügen Sie pro Milliliter Zellen 100 Mikroliter hinzu. Pipettieren Sie die Mischung, verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie für fünf Minuten in den Kühlschrank.Füllen Sie die Lösung mit PBS auf 2,5 Milliliter auf und geben Sie sie in ein Magnetgefäß. Stellen Sie das Gefäß fünf Minuten lang auf den Magneten, drehen Sie den Magneten im Gefäß um und gießen Sie die Lösung schnell in ein neues Polystyrolgefäß. Schütteln Sie das Gefäß nicht, da die negativ selektierten Zellen magnetisch an den Gefäßwänden gebunden sind. Um die Reinheit der Zellsuspension weiter zu erhöhen, stellen Sie das neue Zellgefäß erneut fünf Minuten lang auf den Magneten und gießen Sie die Suspension danach erneut in ein neues Gefäß.Dieser Schritt kann die Gesamtzellausbeute verringern. Die Reinheit der B-Zellen kann durch die Durchflusszytometrie-Analyse von B-Zell-Oberflächenmarkern beurteilt werden. Nach der Anreicherung sollten mehr als 95 % der Zellen B zwei 20 positiv sein.Suspendieren Sie die isolierten Zellen in warmer PBS, die mit 0,1 % BSA ergänzt wurde, bei einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aus einer fünfmillimolaren Stammlösung der CFSE-Farbstofflösung, die in sterilem Dimethylsulfoxid verdünnt wurde. Geben Sie zwei Mikroliter pro Milliliter Zellen im Reaktionsgefäß hinzu. CFSE wird verwendet, um die Zellteilung stimulierter Zellen zu überwachen.Ein für den Isotypwechsel entscheidender Prozess. Eine Endkonzentration von 10 Mikromolar ist optimal für die Färbung primärer B-Zellen. 10 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.Beachten Sie, dass CFSE lichtempfindlich ist und nach Möglichkeit im Dunkeln aufbewahrt werden sollte. Nach der Inkubation quenchern Sie die Färbung, indem Sie ein gleiches Volumen an Rinderserum zu Ihren Zellen hinzufügen und diese auf Eis inkubieren. Um die Zellen fünf Minuten lang zu waschen, müssen Sie die Röhrchen mit Kulturmedium auffüllen; mindestens das Fünffache des ursprünglichen Mediumvolumens muss zugegeben werden, um die Viskosität des Rinderserums auszugleichen und sicherzustellen, dass die Zellen ein Pellet bilden; anschließend zentrifugieren Sie bei 350 G. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal erneut mit Kulturmedium; die Zellen sind nun bereit für die Stimulierung.Stellen Sie das in-vitro-B-Zell-Kulturmedium her, indem Sie RPMI 1640 mit 10 % fetalem bovinem Serum und 50 Mikromolar Beto me capita Ethanol ergänzen. Bereiten Sie anschließend das Stimulationsmedium vor, indem Sie LPS in einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Portionieren Sie 125 Mikroliter des Stimulationsmediums in jedes Loch einer flachen 96-Loch-Gewebekulturplatte.Bereiten Sie die mit CFS E gefärbten B-Zellen in Kulturmedium ohne LPS in einer Endkonzentration von 3,2 × 10⁶ Zellen pro Milliliter vor. Geben Sie 125 µl der Zellsuspension in die Vertiefungen, die das Stimulationsmedium enthalten, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Jede Vertiefung enthält nun 400.000 Zellen bei einer endgültigen LPS-Konzentration von 25 µg/ml.Dies gewährleistet optimale Bedingungen für die Zellproliferation und den Klassenswitch. Obwohl diese Werte nach Bedarf angepasst werden können, inkubieren Sie die Zellen 72 bis 96 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach 48 Stunden sind unter dem Mikroskop deutlich sichtbare Zellhaufen aus proliferierenden B-Zellen zu erkennen, die zur Beurteilung des Klassenswitches dienen.Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit einem Milliliter Färbe-Puffer, um unspezifische Antikörperfärbungen zu vermeiden. Pellettieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 350 ×g. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 100 Mikrolitern Färbe-Puffer mit 5 % normalem Mausserum und einem Mikrogramm FC-Block pro eine Million Zellen und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis, ohne zu waschen. Fügen Sie einen fluoreszenzmarkierten Anti-US-IgG3-Antikörper in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro eine Million Zellen hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis, waschen Sie die Zellen zweimal und resuspendieren Sie sie in zwei bis 300 Mikrolitern Färbe-Puffer.Die Zellen sind nun bereit zur Analyse per Durchflusszytometrie. CFSE wird optimal mit einem Argon-Ionen-Laser bei 492 Nanometern angeregt und emittiert bei 517 Nanometern. Das Anregungs- und Emissionsspektrum des IgG-drei-Antikörpers hängt von seinem konjugierten fluoreszierenden Farbstoff ab.Nach der magnetischen Anreicherung sollte die Zellsuspension wie eine homogene Population ununterscheidbarer kleiner runder Zellen aussehen. Nach 48 bis 72 Stunden Stimulation werden isolierte Zellhaufen vergrößerter proliferierender Zellen deutlich sichtbar sein. Ein großer Teil der nicht proliferierenden Zellen erscheint klein und granulär, da sie Apoptose durchlaufen.CSR kann normalerweise auf den höchsten Stufen zwischen 72 und 96 Stunden nach der Stimulation nachgewiesen werden, bevor die meisten Zellen zu sterben beginnen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen mehrere Zellteilungen durchlaufen haben, wobei umgeschaltete Zellen in der späteren Tochterzellpopulation auftreten. Nach diesen Protokollen können andere Techniken wie RNA- und AI-vermittelte Gen-Knockdowns verwendet werden, um den Effekt eines beliebigen Gens auf die Funktion einer ID und den Prozess der Klassenwechselrekom­bination zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in...

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Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Hier wird ein Test zur Quantifizierung der somatischen Hypermutation innerhalb des Immunglobulin-Schweren-Ketten-Gen-Lokus mithilfe von Keimmittel-B-Zellen aus Denperas-Pflastern der Maus vorgestellt.

Analyse der somatischen Hypermutation im JH4-Intron von Keimzentrums-B-Zellen aus Maus Peyers Patches

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Lernen Sie die Induktion und Analyse der Class Switch Rekombination in isolierten murinen B-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von B-Zell-Proliferation und Antikörper-Isotypwechsel in vitro.

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

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