Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Während der humoralen Immunantwort proliferieren durch Antigen aktivierte B-Zellen und sezernieren Antikörper, während die Reaktion fortschreitet. Die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp wird durch die vielfältigeren IgG-, IgA- oder IgE-Isotypen ersetzt, um Proliferation und Klassenwechsel zu bewerten. In vitro werden milzige B-Zellen aus einer Versuchsmaus mittels magnetischer Zellseparation isoliert.

Die Zellen werden mit dem fluoreszierenden Farbstoff CFSE gefärbt, um die Proliferation zu überwachen, die durch die Behandlung mit bakteriellem LPS stimuliert wird. LPS induziert außerdem die Klassenwechselrekom­bination zum Isotyp IgG3, die zusammen mit der Proliferation mittels Durchflusszytometrie überwacht werden kann. Heute zeige ich Ihnen eine Technik zur Isolierung und Aktivierung reiner splenischer B-Zellen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Klassenwechselrekom­bination und Proliferation in vitro zu untersuchen, und eignet sich ebenfalls dazu, zentrale Fragen im Bereich der B-Zell-Immunität zu beantworten, darunter die Funktion und Regulation der aktivierungsinduzierten Zytidin-Deaminase.

Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus mit 70 % Ethanol zu benetzen. Die Maus sollte acht bis zwölf Wochen alt sein. Um die vollständige Reifung des Immunsystems sicherzustellen, verwenden Sie sterile Scheren, um einen Schnitt durch die Haut und die Muskulatur des linken Hypochondriums des Abdomens zu machen. Entfernen Sie die Milz mithilfe von Schere oder Pinzette vom umliegenden Gewebe.

Schneiden Sie die Probe anschließend in drei große Stücke in PBS. Zerreiben Sie dann vorsichtig die Milz mit dem Gummikolben eines Ein-Milliliter-Spritzenkolbens durch ein 70-Mikron-Zellsieb in PBS. Achten Sie darauf, eine Druckbewegung und keine Reibbewegung zu verwenden.

Da das Mahlen zum Bruch größerer proliferierender Zellen führen kann, die Zellen bei maximal 350 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Anschließend das Pellet in PBS resuspendieren.

Zählen Sie die resuspendierten Zellen mithilfe eines Hämozytometers in einem sterilen Polystyrolröhrchen mit fünf Milliliter Volumen. Bereiten Sie eine Suspension von eins mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter in PBS mit 5 % normalem Rattenserum vor. Pro Röhrchen können maximal zwei Milliliter zugegeben werden.

Danach 50 Mikroliter EP-Negativselektion. Maus-B-Zell-Anreicherungs-Cocktail für jedes Milliliter Zellen. Dann verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie 15 Minuten lang in den Kühlschrank.

Geben Sie pro Milliliter Zellen 100 Mikroliter EP-Biotin-Selektionscocktail hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie nach der Inkubation mit dem EP-Magnetnanopartikel-Biotin-Selektionscocktail-Mix für 15 Minuten in den Kühlschrank, und fügen Sie pro Milliliter Zellen 100 Mikroliter hinzu. Pipettieren Sie die Mischung, verschließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie für fünf Minuten in den Kühlschrank.

Füllen Sie die Lösung mit PBS auf 2,5 Milliliter auf und geben Sie sie in ein Magnetgefäß. Stellen Sie das Gefäß fünf Minuten lang auf den Magneten, drehen Sie den Magneten im Gefäß um und gießen Sie die Lösung schnell in ein neues Polystyrolgefäß. Schütteln Sie das Gefäß nicht, da die negativ selektierten Zellen magnetisch an den Gefäßwänden gebunden sind. Um die Reinheit der Zellsuspension weiter zu erhöhen, stellen Sie das neue Zellgefäß erneut fünf Minuten lang auf den Magneten und gießen Sie die Suspension danach erneut in ein neues Gefäß.

Dieser Schritt kann die Gesamtzellausbeute verringern. Die Reinheit der B-Zellen kann durch die Durchflusszytometrie-Analyse von B-Zell-Oberflächenmarkern beurteilt werden. Nach der Anreicherung sollten mehr als 95 % der Zellen B zwei 20 positiv sein.

Suspendieren Sie die isolierten Zellen in warmer PBS, die mit 0,1 % BSA ergänzt wurde, bei einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aus einer fünfmillimolaren Stammlösung der CFSE-Farbstofflösung, die in sterilem Dimethylsulfoxid verdünnt wurde. Geben Sie zwei Mikroliter pro Milliliter Zellen im Reaktionsgefäß hinzu. CFSE wird verwendet, um die Zellteilung stimulierter Zellen zu überwachen.

Ein für den Isotypwechsel entscheidender Prozess. Eine Endkonzentration von 10 Mikromolar ist optimal für die Färbung primärer B-Zellen. 10 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.

Beachten Sie, dass CFSE lichtempfindlich ist und nach Möglichkeit im Dunkeln aufbewahrt werden sollte. Nach der Inkubation quenchern Sie die Färbung, indem Sie ein gleiches Volumen an Rinderserum zu Ihren Zellen hinzufügen und diese auf Eis inkubieren. Um die Zellen fünf Minuten lang zu waschen, müssen Sie die Röhrchen mit Kulturmedium auffüllen; mindestens das Fünffache des ursprünglichen Mediumvolumens muss zugegeben werden, um die Viskosität des Rinderserums auszugleichen und sicherzustellen, dass die Zellen ein Pellet bilden; anschließend zentrifugieren Sie bei 350 G. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal erneut mit Kulturmedium; die Zellen sind nun bereit für die Stimulierung.

Stellen Sie das in-vitro-B-Zell-Kulturmedium her, indem Sie RPMI 1640 mit 10 % fetalem bovinem Serum und 50 Mikromolar Beto me capita Ethanol ergänzen. Bereiten Sie anschließend das Stimulationsmedium vor, indem Sie LPS in einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Portionieren Sie 125 Mikroliter des Stimulationsmediums in jedes Loch einer flachen 96-Loch-Gewebekulturplatte.

Bereiten Sie die mit CFS E gefärbten B-Zellen in Kulturmedium ohne LPS in einer Endkonzentration von 3,2 × 10⁶ Zellen pro Milliliter vor. Geben Sie 125 µl der Zellsuspension in die Vertiefungen, die das Stimulationsmedium enthalten, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Jede Vertiefung enthält nun 400.000 Zellen bei einer endgültigen LPS-Konzentration von 25 µg/ml.

Dies gewährleistet optimale Bedingungen für die Zellproliferation und den Klassenswitch. Obwohl diese Werte nach Bedarf angepasst werden können, inkubieren Sie die Zellen 72 bis 96 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach 48 Stunden sind unter dem Mikroskop deutlich sichtbare Zellhaufen aus proliferierenden B-Zellen zu erkennen, die zur Beurteilung des Klassenswitches dienen.

Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit einem Milliliter Färbe-Puffer, um unspezifische Antikörperfärbungen zu vermeiden. Pellettieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 350 ×g. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 100 Mikrolitern Färbe-Puffer mit 5 % normalem Mausserum und einem Mikrogramm FC-Block pro eine Million Zellen und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis, ohne zu waschen. Fügen Sie einen fluoreszenzmarkierten Anti-US-IgG3-Antikörper in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro eine Million Zellen hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis, waschen Sie die Zellen zweimal und resuspendieren Sie sie in zwei bis 300 Mikrolitern Färbe-Puffer.

Die Zellen sind nun bereit zur Analyse per Durchflusszytometrie. CFSE wird optimal mit einem Argon-Ionen-Laser bei 492 Nanometern angeregt und emittiert bei 517 Nanometern. Das Anregungs- und Emissionsspektrum des IgG-drei-Antikörpers hängt von seinem konjugierten fluoreszierenden Farbstoff ab.

Nach der magnetischen Anreicherung sollte die Zellsuspension wie eine homogene Population ununterscheidbarer kleiner runder Zellen aussehen. Nach 48 bis 72 Stunden Stimulation werden isolierte Zellhaufen vergrößerter proliferierender Zellen deutlich sichtbar sein. Ein großer Teil der nicht proliferierenden Zellen erscheint klein und granulär, da sie Apoptose durchlaufen.

CSR kann normalerweise auf den höchsten Stufen zwischen 72 und 96 Stunden nach der Stimulation nachgewiesen werden, bevor die meisten Zellen zu sterben beginnen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen mehrere Zellteilungen durchlaufen haben, wobei umgeschaltete Zellen in der späteren Tochterzellpopulation auftreten. Nach diesen Protokollen können andere Techniken wie RNA- und AI-vermittelte Gen-Knockdowns verwendet werden, um den Effekt eines beliebigen Gens auf die Funktion einer ID und den Prozess der Klassenwechselrekom­bination zu untersuchen.