Digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von Indel-Mutationen in Zielgenen

Die digitale Tröpfchen-PCR weist Indel-Mutationen nach – zufälliges Einfügen oder Löschen von Nukleotiden in die DNA. Dies wird erreicht, indem die Probe in winzige Tröpfchen aufgeteilt und die DNA in jedem Tröpfchen unabhängig voneinander amplifiziert wird.

Um die ddPCR durchzuführen, entnehmen Sie eine DNA-Probe, die Wildtyp- und Mutantenvariationen des Zielgens enthält. Laden Sie die Probenmischung und das Öl in unterschiedliche Kammern der Tröpfchengeneratorkammer, die den mikrofluidischen Kanal enthält.

Die Probe und das Öl fließen schnell durch die engen Kanäle, emulgieren an der Verbindungsstelle und werden in mehrere Tröpfchen aufgeteilt, die jeweils einige DNA-Moleküle enthalten.

Nehmen Sie nun eine PCR-Platte mit dem Puffer, der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, dNTPs, thermostabile DNA-Polymerase und zwei Sonden enthält, die mit verschiedenen Fluorophoren und Quenchermolekülen markiert sind. Jede Sonde ist spezifisch für einen bestimmten Alleltyp – Wildtyp oder Mutant.

Übertragen Sie die Tröpfchen auf die PCR-Platte. Legen Sie die Platte in einen Thermocycler und führen Sie die Reaktion durch. Bei der Denaturierung trennen sich die DNA-Stränge. Bei Glühtemperatur glühen die Primer und Sonden an die Template-DNA.

Die Sonde mit grünen und orangefarbenen Fluorophoren bindet an die Wildtyp- bzw. mutierte DNA-Sequenz. Später verlängert die DNA-Polymerase die Primer, spaltet die Fluorophor- und Quenchermoleküle von der Sonde ab und erzeugt ein Fluoreszenzsignal.

Analysieren Sie das amplifizierte Produkt. Die Tröpfchen mit grüner Fluoreszenz enthalten die Wildtyp-DNA-Sequenz, während die orangefarbene Fluoreszenz auf die Indel-Mutation hinweist.