Name: Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die CRISPR-Cas9-basierte Erzeugung definierter heterozygoter und homozygoter Mutationen in humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung für Krankheitsforschung.

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Diese Forschung wurde durch Fördermittel des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health durch Die Stipendien U01HL099656 (P.G. und D.L.F.) und U01HL134696 (P.G. und D.L.F.) unterstützt.

1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA)
HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2).
<ol><li>Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist, und identifizieren Sie 3-4 23 bp Sequenzen, die in das Format 5'-G(N19)NGG-3' passen. Diese Sequenzen sollten sich innerhalb von 20 bp der Interessenregion befinden. HINWEIS: Targeting kann auf den Sinnes- oder Anti-Sinn-Strang durchgeführt werden.</li>
	<li>Bewerten Sie die gRNA-Sequenzen auf genomische Redundanz und Off-Target-Wahrscheinlichkeit mit einer Ressource wie CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Integrieren Sie die 20 bp Zielsequenz (mit Ausnahme des protospaceer angrenzenden Motivs oder PAM) in zwei 60-Mer-Oligonukleotide wie gezeigt (Sequenzen sind 5' bis 3' und Rot und Grün sind umgekehrte Ergänzungen, wie in Abbildung 1Cdargestellt).</li>
	<li>Bestellen Sie die beiden 60 bp Oligonukleotide beim Lieferanten der Wahl. Sobald die Oligonukleotide empfangen sind, setzen Sie jeweils eine Endkonzentration von 100 M in ddH2O aus. Machen Sie einen Arbeitsbestand von 10 M.</li>
	<li>Anneal die beiden Oligonukleotide und erzeugen Sie ein 100 bp dsDNA Fragment mit DNA-Polymerase (Tabelle der Materialien). Kombinieren Sie 5 l von 10 'M vorwärts Oligonukleotid und 5 'L von 10 'M Reverse Oligonukleotid in einem Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Streifenrohr und inkubieren bei 95 °C für 5 min. Kühlen Sie die Reaktion für 10 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Richten Sie die PCR wie in Tabelle 1beschrieben ein. PcR-Verstärkung in einem thermischen Cycler unter Verwendung der in Tabelle 2beschriebenen Parameter durchführen.</li>
	<li>Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Ethidiumbromid (EtBr) Agarose-Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Verbrauchen Sie das 100 bp Band (Abbildung 3A), visualisiert auf einem LED-Leuchtkasten, aus dem Gel mit einer Rasierklinge und reinigen Sie mit einem Gel Extraktionskit (Materialtabelle).</li>
</ol>2. Design von PCR-Primern zum Screening
<ol><li>Führen Sie das Screening der bearbeiteten DNA mit Vorwärts- und Reverse-PCR-Primern durch, die speziell entwickelt wurden, um eine 400-500 bp-Region des Gens von Interesse zu verstärken (Tabelle 2). Verwenden Sie DNA isoliert aus jeder Kontroll-iPSC-Leitung, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen.</li>
	<li>Visualisieren Sie PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) Gel nach Elektrophorese bei 80-100 V für 1 h. HINWEIS: Die Sequenzierung der bearbeiteten Klone erfolgt mit einem verschachtelten Primer, der nach Bestätigung des Screening-Primers-Sets entworfen wurde. Beispiele werden zur Sequenzierung an eine kommerzielle Quelle gesendet.</li>
</ol>3. Vorbereitung des gRNA_cloning Vektorplasmids
<ol><li>Um den Klonvektor linearisieren zu können, nehmen Sie ein 1,5 ml Zentrifugenrohr und fügen Sie 1-5 g DNA des gRNA_cloning-Vektors zusammen mit 4 l des Afl II-Restriktionsenzympuffers und 1,5 l des Afl-II-Restriktionsenzymshinzu. Bringen Sie die Reaktion auf 24 l ddH2O. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren nach oben und unten. Bei 37 °C über Nacht (O/N) inkubieren.</li>
	<li>Elektrophorese auf einem 1% Agarose-Gel bei 80-100 V für 1 h und Verbrauchbandbreiten (erwartete Bandgröße beträgt 3519 bp).</li>
	<li>Extrahieren und reinigen sie wie in Schritt 1.6.</li>
</ol>4. Montage des gRNA-Vektors
<ol><li>Richten Sie Reaktionen ein und montieren Sie DNA-Fragmente mit dem Montagesatz (Materialtabelle) bei 1:5 Verhältnissen von AflII verdaut gRNA Klonvektor zu 100 bp gel gereinigten Einsatz, wie in Tabelle 3beschrieben.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei 50 °C für 15 min. Verdünnen Sie die Reaktion 1:3 in ddH2O und verwenden Sie 3 l für die bakterielle Transformation, wie vom Hersteller vorgeschrieben (Materialtabelle). Plattenzellen auf Kanamycin LB/Agar-Platten.</li>
	<li>Wählen Sie 3-5 Kolonien pro gRNA. Impfen Sie jede Kolonie in 4 ml LB und wachsen Sie O/N bei 37 °C in einem orbitalen Schüttelinkubator.</li>
	<li>Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Miniprep-Plasmid-Isolationskit und sequenzieren Sie jede gRNA mit den folgenden Primern, um ein erfolgreiches Klonen zu gewährleisten: Weiter: GTACAAAAAAAGCAGGTTAAAGG; Umgekehrt: TGCCAACTTTGTACAAGAAAAGCT.</li>
</ol>5. Test gRNA Schneideffizienz
<ol><li>Platten-HESCs auf bestrahlten murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) in einer 6-Well-Platte, wie zuvor beschrieben21. Wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, bereiten Sie den in Tabelle 4beschriebenen Transfektionsmaster-Mix vor.</li>
	<li>Durch Pipettieren mischen und bei RT 15 min inkubieren. Tropfenweise zu den Zellen hinzufügen und bei 37 °C für 48 h brüten (mit einem Medienwechsel nach 24 h).</li>
	<li>Erntezellen zum Sortieren nach 48 h.<ol>
<li>Entfernen Sie MEFs enzymatisch (Tabelle der Materialien) mit einer 3 min RT Inkubation.</li>
		<li>Spülzellen 1x mit hESC-Medium (Tabelle 5) und in hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid (Materialtabelle )kratzen.</li>
		<li>Pelletzellen bei 300 x g für 3 min und resuspendieren in 0,5 ml hESC-Medium + 10 M Y-27632 Dihydrochlorid.</li>
		<li>Filtern Sie in ein 5 ml-Rohr durch eine 35 m Zell-Siebkappe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS), Gate auf lebenden Zellen und sortieren die grünen fluoreszierenden Protein (GFP) positive Zellen.</li>
	<li>Übertragen Sie maximal 1,5 x 104 sortierte Zellen direkt in eine 10 cm2 Schale, die mit 1:3 Kellermembranmatrix (Materialtabelle) und bestrahlten MEFs in hESC-Medium (Tabelle 5) mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet ist.</li>
	<li>Täglich mit dem hESC-Medium (Tabelle 5) ohne Y-27632-Dihydrochlorid wechseln und Klone nach 10-15 Tagen manuell pflücken, wenn die Kolonien einen Durchmesser von 1 mm haben.<ol>
<li>Mit einer P200 Pipette und einem Mikroskop einen einzelnen Klon sorgfältig kratzen und Zellen in die Pipette ziehen.</li>
		<li>Dispergieren Sie die Zellen durch sanfte Pipettierung 3-4x in einer 96-Well-Platte im Medium mit der Kolonie erstellt.</li>
		<li>In PCR-Streifenröhren zum Sieben und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 min. Wählen Sie 20 Kolonien pro gRNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Klon-Screening
<ol><li>Isolieren Sie die DNA, indem Sie Zellpellets in 20 L Proteinase-K-Puffer(Tabelle 5) (1 h bei 55 °C und 10 min bei 95 °C) und kräftig wirbeln. Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min und den Überstand sammeln.</li>
	<li>Führen Sie die Screening-PCR (Abschnitt 2) in einem Gesamtvolumen von 20 l mit einem Master-Mix aus Primern durch, die den Interessenbereich verstärken sollen, und 5 l der Proteinase K-Digest. Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Zelllinie isoliert wurde, die als Kontrolle bearbeitet wurde.</li>
	<li>Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach 1 h Elektrophorese bei 70-90 V auf einem 2,5% (w/v) Agaro-Gel (Abbildung 3B,C). Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.</li>
</ol>7. Präzise Genombearbeitung in pluripotenten Stammzellen mit einsträngiger Oligo-DNA (ssODNs)
<ol><li>Design 100 bp ssODNs zentriert um die effizienteste gRNA-Sequenz bestimmt, um die beste Schneideffizienz zu haben.</li>
	<li>Verhindern Sie eine erneute Spaltung des rekombinierten ODN durch die Einführung von stillen Mutationen in der gRNA-Sequenz. Eine einzelne stille Mutation in der PAM-Sequenz ist ausreichend, aber wenn nicht möglich, funktionieren 3-4 stille Mutationen. ANMERKUNG: Um das Screening von gezielten Klonen zu erleichtern, ist die Einführung einer Restriktionsstelle innerhalb von 20 bp der gRNA-Sequenz ideal.</li>
	<li>Entwerfen Sie ein ODN mit den gewünschten Basisänderungen, um die Mutation des Interesses zu erzeugen, und einen ODN ohne die Basisänderung(n). ANMERKUNG: Diese Änderungen sollten nicht mehr als 20 bp von der vorhergesagten CRISPR/CAS9-Schnittstelle sein, da die Rekombination in größeren Entfernungen erheblich abfällt.</li>
	<li>Bestellen Sie die beiden ssODNs vom Anbieter der Wahl und suspendieren Sie in Wasser, um 1 g/ l Lagerzujer zu machen. Lagerbestände bei -20 °C.</li>
</ol>8. Transfektions-Setup
<ol><li>Um die ssODN und die CRISPR-CAS9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer O/N-Inkubation eine Konfluenz von 70-80% zu erreichen.</li>
	<li>Richten Sie die Transfektionsreaktion wie in Tabelle 6beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie für 15 min bei RT. Fügen Sie das Transfektionsreaktionsgemisch tropfenweise zu den Zellen hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen nach 48 h auf die Zellensortierung vor, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben.</li>
	<li>Wählen Sie Kolonien 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen mit einer 200-L-Pipette. Übertragen Sie 100 l Zellen in einen Brunnen einer 24 oder 48 Wellplatte, die zuvor mit Gelatine und bestrahlten MEFs in hESC-Medium mit Y-27632-Dihydrochlorid beschichtet war. Verwenden Sie die verbleibenden 100 l für die DNA-Isolierung, wie in Abschnitt 6 beschrieben.</li>
</ol>9. Überprüfung auf Mutationen in einzelnen Kolonien
<ol><li>Um die erfolgreiche Integration des ssODN zu überprüfen, nehmen Sie 5 l DNA, die aus jeder Kolonie isoliert ist, um PCR mit den in Abschnitt 2 entworfenen Screening-Primern durchzuführen. Reinigen Sie die PCR-Produkte (Materialtabelle) und bereiten Sie die Restriktionsenzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der ssODN erstellt wurde. HINWEIS: Diese Verdauung umfasst auch den Restriktionsenzympuffer und die vom Hersteller empfohlene Konzentration des Restriktionsenzyms in einem Volumen von 40 l.</li>
	<li>Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für 1-3 h.</li>
	<li>Visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte auf einem 1,5% (w/v) EtBr Agarose Gel elektrophoresed bei 80-100 V für 40 min. Wenn eine erfolgreiche Integration der ssODN stattgefunden hat, sequenziumen spezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer.</li>
</ol>

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<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
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<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
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<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Zellwac...

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird1,2 ,3,4. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen5,6. Um jedoch zu verstehen, wie eine bestimmte Veränderung mit einem bestimmten Phänotyp verbunden ist, ist die Verwendung einer gepaarten isogenen Kontrolle und mutierter Zelllinien wichtig, um die Linien-zu-Linienvariabilität7,8zu steuern. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen wurden verwendet, um Insertions- oder Deletionsmutationen (Indels) in verschiedenen genetischen Modellen, einschließlich Primärzellen, zu erzeugen; aber diese Nukleasen können umständlich zu bedienen und teuersein 9,10,11,12,13,14. Die Entdeckung der gruppierten regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CAS9 Nuklease hat das Feld aufgrund der Effizienz in der Indelbildung in praktisch jeder Region des Genoms, der Einfachheit der Anwendung und der Senkung der Kosten revolutioniert15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Eine Herausforderung bei der Verwendung der CRISPR-CAS9-basierten Genom-Editing-Technologie war die Erzeugung oder Korrektur spezifischer Mutationen in einem Allel, ohne eine Indelmutation im zweiten Allel20zu erzeugen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, diese Herausforderung zu überwinden, indem zwei einsträngige Oligonukleotid (ssODN) Reparaturvorlagen verwendet werden, um die Indelbildung im zweiten Allel zu reduzieren. Beide ssODNs sind so konzipiert, dass sie stille Mutationen enthalten, um ein erneutes Schneiden durch die CAS9-Nuklease zu verhindern, aber nur eine enthält die Veränderung des Interesses. Diese Methode erhöht die Effizienz der Erzeugung einer spezifischen heterozygoten genetischen Veränderung, ohne induzieren Indelbildung im zweiten Allel. Anhand dieses Protokolls zeigen Gen-Editing-Experimente an sechs unabhängigen genomischen Standorten die genaue Einführung der gewünschten genomischen Veränderung in einem Allel ohne Indelbildung im zweiten Allel und treten mit einer Gesamteffizienz von 10 % auf. Das beschriebene Protokoll wurde von Maguire et al.21angepasst.

<table><tbody><tr><td>5-ml-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappe für das Zellsieb</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturschalen aus Polystyrol</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII-Restriktionsendonuklease</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS) Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB Agarplatten mit 50 μa; g/ml Kanamycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine Stem Reagenz</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>murine embryonale Fibroblasten (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin Gel-Extraktions- und PCR-Clean-up-Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttel-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP Vektor</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Streifenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA-Polymerase und 5&fach; Phusion Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM elektrokompetente Escherichia coli Zellen</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid/ROCK-Inhibitor (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung definierter genomischer modifikationen mit crispr-cas9 in humanen pluripotenten stammzellen

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.

Generierung von gRNAs und Screening für Indels
Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISPS-...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Die Untersuchung der Genfunktion und Krankheit wird durch die Auszucht der menschlichen Bevölkerung behindert. Die unterschiedlichen genetischen Hintergründe patientenspezifischer und kontrollierbarer iPS-Zelllinien können die Differenzierungseffizienz und Phänotypen in einem gegebenen funktionellen Test beeinflussen. Die Verwendung genetisch identischer oder isogener Linien, bei denen der einzige Unterschied darin besteht, dass die besondere Mutation von Interesse entscheidend ist, um diese Probleme zu überwinden.Viele menschliche Krankheiten werden durch heterozygote Mutationen verursacht, die mit dem CRISPR-Cas9-System nur schwer zu erzeugen sind. Dies ist auf die Erzeugung von Indelmutationen im nicht zielgerichteten Allel zurückzuführen, die bei sehr hoher Frequenz auftreten können. Unsere Technik überwindet dieses Problem, indem sie zwei Reparaturvorlagen verwendet, von denen nur eine die Mutation des Interesses birgt.Jeder Forscher, der diese Technik ausprobiert, sollte in der menschlichen pluripotenten Stammzellkultur versiert sein. Die Video-Demonstration der Kolonie-Picking wird hilfreich sein, um die richtige Größe und Morphologie sowie Technik für die Kommissionierung und Dassiebung zu zeigen. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Leo Cardenas sein.Zu Beginn, Platte menschliche ESCs auf bestrahlte MEFs in einer 6-Well-Platte. Bereiten Sie den Transfektionsmaster-Mix vor. Durch Pipettieren mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, dann fügen Sie die Transfektion Master-Mix tropfen klug zu jedem Brunnen mit Zellen und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Wechseln Sie die Medien alle 24 Stunden. Um die Zellen zu ernten, bebrüten Sie zunächst die Zellen mit Triple E für drei Minuten bei Raumtemperatur, um MEFs enzymatisch zu entfernen.Fügen Sie 0,5 Milliliter HESC-Medium mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer hinzu. Pelletzellen bei 300 mal g für drei Minuten und re-suspend in 0,5 Milliliter des menschlichen ESC-Mediums mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zell-Siebkappe in ein Fünf-Milliliter-Rohr.Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, Gate auf lebenden Zellen und sortieren Sie die grünen fluoreszierenden protein-positiven Zellen. Als nächstes übertragen Sie maximal 1,5 mal 10 auf die vier sortierten Zellen direkt in eine 10-Zentimeter-Schale, die mit einer bis drei Kellermembranmatrix und bestrahlten MEFs und menschlichem ESC-Medium mit ROCK-Hemmer beschichtet ist. Täglich mit dem menschlichen ESC-Medium ohne ROCK-Hemmer das Medium wechseln.Nach 10 bis 15 Tagen haben kolonien einen Durchmesser von etwa einem bis zwei Millimetern. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine P200-Pipette, um vorsichtig einen einzelnen Klon zu kratzen und Zellen in die Pipette zu ziehen. Dispergieren Sie die Zellen in einem Brunnen einer 96-Well-Platte, indem Sie drei- bis viermal in dem mit der Kolonie erstellten Medium sanft pipetieren.Dann pflücken Sie 20 Kolonien für jede Führungs-RNA und geben Sie in PCR-Streifenröhren zum Screening aus. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Jetzt, inkubieren Zellpellets in 20 Mikroliter Proteinase K Puffer, um DNA und Wirbel kräftig zu isolieren.Zentrifuge bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Führen Sie als Nächstes die PPCR der bearbeiteten DNA durch. Fügen Sie in die Röhren 20 Mikroliter einer Master-Mischung, einschließlich Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, entwickelt, um die Region des Interesses zu verstärken, sowie fünf Mikroliter der Proteinase K Digest.Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Kontroll-iPSC-Leitung isoliert ist, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen. Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach einer Stunde Elektrophorese bei 70 bis 90 Volt bei einem Volumen-Agarose-Gel von 2,5 % volumenmäßig. Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.Um die einsträngige Oligo-DNA und die CRISPR-Cas9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer nächtlichen Inkubation 70 bis 80 % Konfluenz zu erreichen. Richten Sie die Transfektionsreaktion wie beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipetten und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Dann fügen Sie die Transfektion Reaktion Mischung Tropfen klug zu den Zellen. Bereiten Sie die Zellen nach 48 Stunden wie bisher auf die Zellensortierung vor. Etwa 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um Kolonien in PCR-Streifenröhren und in einen Brunnen einer 12-Well-Platte zu pflücken, die mit Gelatine und MEFs vorbeschichtet ist.Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellen auf jeden Brunnen einer 24- oder 48-Well-Platte, die zuvor mit Gelatine beschichtet war und bestrahlte MEFs im menschlichen ESC-Medium mit ROCK-Hemmer. Verwenden Sie die restlichen 100 Mikroliter für die DNA-Isolierung. Um die erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA zu überprüfen, nehmen Sie fünf Mikroliter DNA, die aus jeder Kolonie isoliert sind, um PCR mit den zuvor entwickelten Screening-Primern durchzuführen.Reinigen Sie die PCR-Produkte und bereiten Sie die 40 Mikroliter reparierender Enzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der Einstrang-Oligo-DNA erstellt wurde. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für ein bis drei Stunden. Dann visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte, die mit einem Ladefarbstoff auf einem Volumenvon 1,5% Gewicht von Ethidiumbromid Agarose Gel, Elektrophorese bei 80 bis 100 Volt für 40 Minuten hinzugefügt.Wenn eine erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA stattgefunden hat, sequenzspezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer. In dieser Studie wurde für die RNA-Führung ein 100-Basispaar-Band aus einem 1,5%agarose Gel entfernt. Nach der Zelltransfektion wurde die Validierung des RNA-Schnitts mit einem 2,5%agarose Gel visualisiert.Ein PCR-Produkt mit 180 Basenpaaren zeigte eine ungeschnittene Steuerung und verschiedene Klone mit Bandverschiebungen, die auf die Indelbildung hindeuten. Verschiedene Führungs-RNAs hatten unterschiedliche Schnitteffizienzen. Um ein erneutes Schneiden der bearbeiteten Allele durch CRISPR-Cas9 zu vermeiden, wurde die PAM-Sequenz mit einer G-zu-A-Stummmutation modifiziert.Eine stille Mutation in der PAM-Sequenz erzeugte eine eindeutige Einschränkungssite, die eine erfolgreiche Integration in ein oder zwei Allele ermöglicht. Genombearbeitete Stammzelllinien können in nachgelagerten Differenzierungen und funktionellen Assays verwendet werden, um die Wirkung einer bestimmten Mutation auf die menschliche Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von isogenen Zelllinien mit einer spezifischen heterozygoten oder homozygoten Mutation, die in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten involviert ist.Diese Krankheitsmodelle ebnen den Weg für die Entwicklung neuer zellulärer Therapien und bieten Plattformen für die Arzneimittelentdeckung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video demonstriert eine Technik der Zinkfinger-Nuklease-basierten Genomeditierung in menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). Da hPSCs potenziell in verschiedene Zelltypen differenziert werden können, ist diese Technologie hilfreich für patientenspezifische in vitro pathologische und pharmakologische Studien.

Zinkfinger-Nuklease-basierte Genomeditierung: Eine Technik zur Modifikation des Genoms in menschlichen pluripotenten Stammzellen durch doppelsträngigen homologieabhängigen Reparaturmechanismus

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Das Protokoll beschreibt Methoden zur CRISPR-basierten Epigenom-Editierung (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in humanen Zelllinien unter Verwendung von Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion.

CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion

Lernen Sie die CRISPR-Cas9-basierte Erzeugung definierter heterozygoter und homozygoter Mutationen in humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung für Krankheitsforschung.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

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