Name: Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Lernen Sie die effiziente CRISPR/Cas9-Genomeditierung in Danio rerio für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht Forschern aller Erfahrungsstufen, gezielte Gen-Knockouts zu erzeugen und zu identifizieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (R21CA182197, j.o.), Ralph W. und Grace M. Showalter Research Trust, und durch die Purdue Agrarwissenschaft und Erweiterung für wirtschaftliche Entwicklung (AgSEED) Programm. Sanger-Sequenzierung-Daten wurden von der Purdue Genomics Core Facility unterstützt durch P30 CA023168 erworben. Mary Witucki wurde von der Purdue University Center für Cancer Research Sommer Undergraduate Research Program unterstützt durch die Carroll County Cancer Association unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir danken Benjamin Carter, Ellen Denning und Taylor Sabato für kritische Rückmeldungen auf das Manuskript. Wir danken der Fakultät für Biochemie für die Unterstützung dieser Arbeit und dem Center for Zebrafisch-Forschung an der Purdue University für ihr Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Zu guter Letzt danken wir der Purdue Genomics Core Facility und Beiträge von Phillip San Miguel in Bezug auf die NGS-Dienste.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gen Knockouts im Zebrafisch vertebrate Modellsystem CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Reihe von Protokollen wurden zuvor beschrieben CRISPR-vermittelten Genom Engineering im Zebrafisch15,25,26,50,51,52durchzuführen. Dieses Protokoll baut auf bisherigen Bemühungen durch die Kombination von eine Reihe von einfachen aber reproduzierbar konsequente experimentelle Techniken, insbesondere HMA und NGS mehrerer heterozygot Fisch, erstelle ich eine einfache, wirtschaftliche, und experimentell robuste Protokoll für CRISPR-vermittelten Mutagenese im Zebrafisch, die geeignet für Labore mit Personal mit einer Reihe von Ausbildung und Erfahrung, sowie die Lehre Labors ausgestattet ist.
Empfehlungen für Design und die Synthese des Guide RNAs sind in diesem Protokoll enthalten. Eine wichtige Überlegung im Guide RNA-Design ist die Minimierung der Ziel-Effekte. Mehrere Vorhersage Algorithmen wurden entwickelt, um Benutzern CRISPR-Berechnung Werkzeuge mit benutzerfreundlichen grafischen Schnittstellen zugreifen, die Vorhersagen, sowohl die Aktivität des Handbuchs auf Ziel und die Chance des Ziel-Effekte34, 35,36. Ein besonderen Vorteil des Zebrafisch-Systems ist gesenkten Preise der Ziel-Effekte, weil die Cas9 in die Embryonen injiziert wird und daher Ausdruck flüchtig ist, die bei Mäusen nachweislich zu einer verminderten Ziel Effekte53führen. Dennoch wurden Ziel Effekte nachgewiesen, im Zebrafisch54auftreten. Eine Möglichkeit zur Steuerung für Ziel-Effekte besteht darin Phänotyp Gründer Zebrafisch, die durch zwei unabhängige Guide RNAs, die auf das gleiche gen erzeugt worden sein, da diese Führungen wäre sehr wahrscheinlich, dass verschiedene Ziel-Websites betreffen. Eine alternative Methode zum Ziel Auswirkungen zu minimieren, die nicht in diesem Protokoll beschrieben wird ist die Verwendung von einem mutierten Cas9, die Einzelstrang Pausen am Ziel DNA, erzeugt, die mit hohem Wirkungsgrad repariert werden. Paarung DNA Kerben in der Nähe von einander, die das Gegenteil ergänzen Stränge führt effektiv Indel Bildung an den gewünschten Ort und Ziel-Effekte55,56minimiert.
Zusätzlich verschiedene Sätze von Ziel-Effekte, können verschiedene SgRNAs unterschiedliche Mutagenese der gewünschte Ziel57,58,59haben. Dieses Protokoll verwendet HMA zur Analyse der Effizienz der Mutagenese von einer bestimmten SgRNA mit Heteroduplex Band Bildung33,40. Heteroduplex Bänder entstehen durch Hybridisierung des PCR-generierte DNA-Stränge, die Abweichungen enthalten, und können mit Gelelektrophorese leicht behoben werden. Im Gegensatz zu anderen üblichen Methoden, Indel Bildung zu messen wie die T7-Endonuklease Assay oder hochauflösende schmelzen Analyse25,26, HMA erfordert keine teure Enzym nicht übereinstimmende DNA schneiden, und erfordert keine komplizierte Analyse von PCR schmelzen Kurven. Wichtig ist, ermöglicht mit HMA, um hohe Raten von Indel Bildung in der injizierten Bevölkerung zu überprüfen auch die Ermittler zu minimieren die Anzahl der Fische für die nachfolgende Produktion Knock-out-Linien, das reduziert die Kosten für die Ermittlung einer Mutation mit der gewünschten Eigenschaften.
Die relative Leichtigkeit erzeugen CRISPR-basierte Indels ermöglicht die Erstellung von Multiple Allele mehrere Gene auf einmal. Web-basierte Software ist verfügbar für die Analyse der einzelnen Mutationen von heterozygoten Fische mit Sanger der PCR Produkte49sequenzieren. In dem Fall, wo drei oder mehr CRISPR-mutierten Allele analysiert werden, ist NGS, die Natur der Indel zu charakterisieren wahrscheinlich kostengünstiger, die Art der Indel als dieser Ansatz charakterisieren sein einen Pool von bis zu 50 verschiedene Allele bei o charakterisiert werden können NCE (siehe Tabelle der Materialien)60,61,62. Diese Größenvorteile wäre wahrscheinlich besonders nützlich in einer grundständigen Laborumgebung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dieses Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Erzeugung von reproduzierbar hochwertige CRISPR-Reagenzien (insbesondere SgRNA), so dass weniger Erwachsene Fische müssen erstellt und analysiert, um erfolgreich zu identifizieren, die mutierten Allele von Interesse, die auch reduziert den Zeit- und Kostenaufwand die gewünschten Linien zu erzeugen. Wichtig ist, hat dieses Protokoll so konzipiert, dass es von Labors mit begrenzten Ressourcen, mutierten Zebrafisch auf erschwingliche Weise zu produzieren angewendet werden kann. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass dieser Ansatz eignet sich für Studenten und damit die Möglichkeiten zur aus- und Weiterbildung von Studenten praktische Erfahrungen im Erbgut CRISPR-basierte Bearbeitung interessiert baut.

Die Erhaltung der molekularen Maschinerie in Eukaryoten zugrunde liegt die Macht der Verwendung Modellorganismen für die Forschung. Viele dieser Modellsysteme erleichtern die Verwendung von Reverse-gentechnische Ansätze wie gezielte gen Knockouts, den Beitrag eines gen-Produktes um einen biologischen oder Krankheit Prozess zu charakterisieren. Gen Störung Techniken in Organismen wie dem Zebrafisch haben sich historisch auf gezieltes einbringen von Frameshift-Mutationen verlassen, die durch ungenaue Reparatur von DSB1,2entstehen. Wenn ein DSB in das Genom eingebracht wird, ist die DNA-Läsion durch einen der beiden Wege, die universell in fast allen Arten von Zellen und Organismen vorhanden sind repariert: nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)3,4 . Die Ungenauigkeit der NHEJ Maschinen produziert häufig Indels von verschiedenen Längen5,6,7,8,9. Einführung von Frameshift-Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens kann ein vorzeitiges Stopcodon produzieren, die oft das Gen nicht funktionsfähig macht.
Frühen Genom engineering Strategien im Zebrafisch Förderung Indels enthalten Meganucleases, Zinkfinger-Nukleasen und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen, die DNA-Protein Interaktionen um eine Nuclease auf einen bestimmten genomische gezielt genutzt Ziel, wo es ein DSB10,11,12,13,14,15eingeführt. Diese Technologien sind jedoch oft schwierig, gelten aufgrund der aufwändige und komplexe Technik musste eine Nuklease zu generieren, die die DNA Reihenfolge des Interesses richtet sich an. Im Gegensatz zu bisherigen Strategien verlassen CRISPR-basierte gen bearbeiten nicht auf Protein-DNA-Wechselwirkungen für die Zielgruppenadressierung. Stattdessen CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease über eine RNA-Leitfaden richtet sich das Nukleotid base pairing Interaktionen verwendet, um gezielt eine genomische Website Interesse16,17,18,19 ,20,21. Aufgrund der Einfachheit der Gestaltung einer RNS ist Guide mit der gewünschten Basis Paarung Interaktionen für die Zielgruppenadressierung es relativ einfach, die Cas-Endonuklease an den gewünschten Ort zu richten. Typ II CRISPR-System wurde vor allem weit entwickelt für Genom-editing-Anwendungen durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der Verwendung von einem einzigen multidomain Cas-Nuklease (Cas9), die Interaktion mit DNA Endonuklease Aktivität stimulieren erfordert und von einer einzigen Führer RNS (SgRNA) nutzen, um es auf den cognate DNA-Sequenz18Ziel. Voraussetzungen die Sequenz für das targeting von verwandten SgRNA sind gut verstanden19, und die gewünschte SgRNA wird leicht durch in Vitro Transkription generiert. Die Einfachheit und Robustheit der CRISPR/Cas9 Ansatz erleichtert die gezielte gentechnische Veränderung im Zebrafisch und eine Vielzahl von anderen Organismen.
Die verbesserte Fähigkeit zu übernehmen hat gezielte Genom-Bearbeitung im Zebrafisch als Folge entwickeln CRISPR-basierte Reagenzien erheblich erhöht die Möglichkeit, Prozesse Sinnbild für Wirbeltiere Organismen wie Entwicklung der das zentrale Nervensystem zu studieren System. Das Zebrafish Genom enthält Orthologe von 70 % der Protein-kodierenden Gene im menschlichen Genom sowie 84 % der Gene im Zusammenhang mit Krankheiten im Menschen22gefunden. Zebrafisch Entwicklung weist mehrere wichtige Eigenschaften, die seine Verwendung in umgekehrter genetische Studien zu verbessern: die Embryonen sind in große Gelege gelegt, nach außen zu entwickeln, von der Mutter, so dass sie offen für genetische Manipulation durch Mikroinjektion und Erwachsenen Zebrafisch geschlechtsreif mit 3 Monaten, so dass für die rasche Ausbreitung der gewünschten Linien23.
Zahlreiche Protokolle stehen zur Verfügung, die beschreiben eine Vielzahl von Ansätzen zu generieren und zu identifizieren CRISPR-abgeleitete Indels im Zebrafisch24,25,26,27,28,29 ,30,31. Aber viele dieser Verfahren sind zeitintensiv, benötigen Zugriff auf teure Ausrüstung und können schwierig sein, für Labors mit begrenzten Kompetenzen. Die hier beschriebenen Schritte bieten eine einfache, robuste und wirtschaftliche CRISPR/Cas9-Strategie zu Ingenieur Zebrafisch ko-Linien. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines hocheffizienten Kit SgRNAs mit DNA-Oligonukleotide (Oligos) zu synthetisieren, ähnlich wie andere Ansätze, die zuvor beschriebenen32. Das beschriebene Protokoll umfasst zwei Schritte insbesondere, die Analyse der CRISPR mutiert erheblich vereinfachen: Schritt für Schritt Verwendung der PCR-basierter HMA33 , leicht feststellen, das Vorhandensein von Genom-Modifikationen und Sequenzierung Analyse der heterozygot Zebrafisch, schnell und einfach die Natur mehrere Indels auf wirtschaftliche Weise zu bestimmen. Darüber hinaus sind schrittweise Anleitungen für robuste Auswahl, zuverlässige Produktion und Injektion des Guide RNAs enthalten. Die hier angegebenen Schritte veranschaulichen eine robustere, relativ kostengünstige Protokoll, die Laborpersonal mit ein Spektrum an Fachwissen zur Identifizierung des Gens Knockouts im Zebrafisch beitragen kann.

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA-Analysesoftware. http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA-Analysesoftware. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA-Analysesoftware. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR-Primer-Design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>RNASE-freie Technik</td><td></td><td></td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>RNase-freiem Wasser Synthese von Guide-RNAs</td><td>jeder Marke</td><td></td><td>. Thermo Fisher und Qiagen führen beide geeignetes Wasser.</td></tr><tr><td>Rnasefreies Ethanol</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Ethanol in molekularbiologischer Qualität ist RNASE-frei. Fischer, VWR verkaufen geeignetes Ethanol.</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01 Cas9</td><td>Protein mit nukleärem Lokalisierungssignal.</td></tr><tr><td>Spezifische Oligos anvisieren</td><td>Integrierte DNA-Technologien (IDT)</td><td></td><td>Synthetisieren Sie Guide-RNAs.</td></tr><tr><td>PCR-Primer, die die Führungs-RNA-Schnittstelle flankieren</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Verwendung für die Heteroduplex-Analyse, 100-300 bp Produkt.</td></tr><tr><td>PCR-Primer flankieren Führungs-RNA-Schnittstelle</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Zur Sequenzierung von CRISPR-Allelen verwenden, Produkt empfohlen 300-600 bp.</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA-Synthesekit</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>In-vitro-Transkrib-Guide-RNAs.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>RNasefreier Puffer für die Elektrophorese von Nukleinsäuren.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Loading DNA für die Elektropherese.</td></tr><tr><td>5M Ammoniumacetat</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Aufreinigungsreagenz für die Aufreinigung von Guide-RNAs.</td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof, nukleasefrei)</td>Jede <td>Marke</td><td></td><td>Cleanup-Reagenz für die Aufreinigung von Guide-RNAs. Materialien in molekularer Qualität sind RNase-frei.</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für die Synthese und Reinigung von Guide-RNAs.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher 10328011</td><td></td><td>Beseitigt RNase-Kontaminationen von Oberflächen, Geräten und Glaswaren.</td></tr><tr><td>DNA-Leiter, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Molekulargewichtsstandards für die Gelelektrophorese von DNA.</td></tr><tr><td>DNA-Leiter, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Molekulargewichtsstandards für die Gelelektrophorese von DNA.</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Einzelstrang-RNA-Marker zur Überprüfung, ob sgRNA in voller Länge synthetisiert wurde</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting Polyacrylamide Gel.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Gegossenes Polyacrylamid-Gel.</td></tr><tr><td>40% Polyacrylamid (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Gießgel aus denaturiertem Polyacrylamid.</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Gießen von denaturierendem Polyacrylamid-Gel.</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Loading guide RNA auf denaturierendes Gel für die Elektrophorese.</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualisierung von Nukleinsäuren.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Alternative Methode zu Ethidiumbromid zum Nachweis von dsDNA in Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA Aufreinigung, PCR Aufreinigung.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Für die Amplifikation von DNA mittels PCR.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>PCR-Amplifikation</td> <td>jeder Marke</td><td></td>.</tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Jede Marke,</td><td></td><td>NanoDrop oder verwandtes Produkt zur Quantifizierung der DNA/RNA-Menge.</td></tr><tr><td>E3 Embryo Medium</td><td>Made in house</td><td></td><td>Medium für die Aufzucht von Embryonen und die Herstellung von Injektionsplatten. Rezept: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>wird zu 1x E3-Medien hinzugefügt, um Pilzwachstum auf Embryonen zu verhindern.</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Thermo Fisher FB0875711Z</td><td></td><td>Lagerung von Embryonen, gegossene Injektionsplatte.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Guss-Injektionsplatte, Agarose-Gele.</td></tr><tr><td>Mikroinektion-Form</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Zur Erstellung von Vertiefungen, um Embryonen während der Injektion zu halten.</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Farbstoff zur Visualisierung der Injektion.</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Zur Kalibrierung des Nadelinjektionsvolumens.</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Bewegliche Embryonen.</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Schneidenadel für ausgewachsene Fische.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Embryonen bei 28,5 oC halten.</td></tr><tr><td>Verticle Pipettenabzieher</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Geneate Nadeln für die Injektion. Zusätzliche Anweisungen zum Ziehen der Nadel: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Geneate Nadeln für die Injektion.</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Laden Sie die Lösung in die Injektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Injektion von Embryonen.</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Injektion von Embryonen.</td></tr><tr><td>30% Polyacylamid (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Heteroduplex-Gelguss.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Betäubungsmittel für Zebrafische zum Schwanzabschneiden und zur gDNA-Extraktion aus Embryonen. Rezept: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Gießen Injektionsplatte, Agarosegele.</td></tr><tr><td>Skalieren</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Gießen von Injektionsplatten, Agarosegelen.</td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Zum Ausstoßen von Flüssigkeit aus der Kapillare für die Embryoinjektion.</td></tr><tr><td>1.000 & Mikro; L&nbsp; Tipps</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Tipps</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Tipps</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>PCR-Streifenröhrchen</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Für alle Aspekte des Protokolls.</td></tr><tr><td>NGS-Sequenzierungsplattform: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Wenn Ihre Institution diesen Service nicht anbietet, besuchen Sie: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Externe Kosten: 35 USD).</td></tr><tr><td>Software zur Sequenzanalyse</td><td></td><td></td><td>Für die Sanger-Sequenzierung von heterozygoten Fischen. Besuchen Sie: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Software für die Sequenzanalyse</td><td></td><td></td><td>, SnapGene Viewer, Sequenzscanner für die Analyse der NGS-Sequenzierung.</td></tr></tbody></table>

effiziente produktion und kennzeichnung der crispr/cas9 generiert gen knockouts im modellsystem danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Charakterisierung von gruppierten, regelmäßig dazwischen, werden kurze, palindromische (CRISPR) System von Streptococcus Pyogenes ermöglichte die Entwicklung einer anpassbaren Plattform schnell gen Änderungen in einer Vielzahl von generieren Organismen, einschließlich Zebrafisch. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung verwendet eine einzelne Guide RNA (SgRNA) Ziel einer CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease genomische DNA (gDNA) Ziel von Interesse, wo die Cas-Endonuklease erzeugt eine Doppel-Strang-Pause (DSB). Reparatur von DSB durch fehleranfällige Mechanismen führen zu Einfügungen oder Löschungen (Indels). Dadurch können Frameshift-Mutationen, die oft ein vorzeitiges Stopcodon innerhalb der kodierenden Sequenz, wodurch ein Protein-Null-Allel einführen. CRISPR-basierte Genom Engineering erfordert nur wenige molekularen Komponenten und ist leicht durch Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen eingeführt. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden CRISPR Reagenzien für Zebrafisch Mikroinjektion zu generieren und Fische ausstellenden Germline Übertragung von CRISPR-modifizierte Gene identifizieren. Diese Methoden umfassen die in Vitro Transkription von SgRNAs, Mikroinjektion CRISPR Reagenzien, Identifizierung der Indels induziert in der Ziel-Site mit einer PCR-basierten Methode ein Heteroduplex Mobility Assay (HMA) und Charakterisierung der Indels genannt mit einem niedrigen Durchsatz und eine leistungsfähige Next Generation Sequencing (NGS)-basierenden Ansatz, die mehrere PCR-Produkte von heterozygoten Fisch gesammelt analysieren können. Dieses Protokoll wird optimiert, um die Anzahl der Fische erforderlich und welche Ausrüstung benötigt, um die Analysen zu minimieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll so konzipiert, zugänglich für den Einsatz von Labor-Personal von allen Ebenen der Erfahrung unter anderem Studenten, ermöglicht dieses mächtige Werkzeug jede Forschungsgruppe Interesse CRISPR-basierte wirtschaftlich eingesetzt werden Genomic Änderung im Zebrafisch.

Die experimentelle Ansätze beschrieben in diesem Protokoll ermöglichen effiziente und kostengünstige Produktion von Zebrafisch Knock-out-Linien mit CRISPR/Cas9-Technologie. Die folgenden Zahlen wurden in diesem Artikel, Interpretation und Fehlerbehebung der Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls zu erleichtern. Nach erfolgreicher Produktion und Mikroinjektion CRISPR-Reagenzien können der Zebrafisch-Embryonen für offene Phänotypen und Indel Bildung mit HMA analysiert werden. Eine hilfreiche Kontrolle, den Erfolg des CRISPR-Experiments zu visualisieren ist der Einsatz von der SgRNA im Schritt 1.5 die pigmentbildenden gen Ziel beschrieben Tyrosinase. Cas9-induzierten Indel Formation an Tyrosinase führt zum Verlust der Pigmentierung und ist leicht von 48 erzielte hpf (Abbildung 1). Eine andere hilfreiche Steuerung Sicherstellung dieser Vorbereitung der CRISPR-Reagenzien für Injektion erfolgreich war, soll sichergestellt werden, in voller Länge (120 nt) SgRNA hat mit einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Abbildung 2, Spur 1 und 2) synthetisiert worden. Wenn die RNA degradiert worden erscheint als ein Abstrich, z. B. Bahn 3 (Abbildung 2) zeigt degradierten RNA, die für die Injektion nicht geeignet ist.
Um die Indel Bildung Häufigkeit der Gene von CRISPR-Cas9 gezielt zu analysieren, die nicht in offene Phänotypen z. B. Tyrosinase, ist HMA-Analyse eine einfache und zuverlässige Methode. SgRNA/Cas9 injiziert Embryonen mit HMA Ergebnisse bei der Bildung der Heteroduplex Bands und Verringerung der Intensität der Homoduplex Band (Abbildung 4) analysiert. Die Anwesenheit von Heteroduplex Bands ist weiter in dieses Protokoll zum Identifizieren potenzieller Gründer Fisch aus microinjected Embryonen und als Erwachsene (Abbildung 4 und Abbildung 5), analysieren die Keimbahn-Getriebe-Leistungsfähigkeit eines Gründers ( genutzt. Abbildung 6), und eine Indel in einem heterozygoten F1-Fisch (Abbildung 7) nachzuweisen. Die heterozygoten Fische, die eine Indel enthalten sind Kandidaten für NGS, die Natur der Indel zu identifizieren und zu bestimmen, ob ein vorzeitiges Stopcodon in der kodierenden Region des Zielgens vorhanden ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Abbildung 1 : Zebrafish Embryos zeigen einen Pigment defekt, wenn mit einer SgRNA gezielt Tyrosinase im 1-Zell-Stadium eingespritzt. (A) Wildtyp-uninjected Embryo bei 48 hpf und (B) injiziert Embryo bei 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Abbildung 2 : In-vitro- Transkription von SgRNA mit Synthese Kit. Oligos wurden mit in-vitro- Transkription Kit vorschriftsmäßig SgRNA Synthese synthetisiert. 500 ng RNA wurde auf einem Harnstoff/Seite Gel wie beschrieben ausgeführt. SgRNA geladen in Bahnen 1 und 2 zeigt eine Band, die volle Länge, intakt 120 nt RNA entspricht. Die SgRNA in Spur 3 zeigt eine degradierte RNA-Probe, die nicht zur Injektion eignet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Abbildung 3 : Vergleich der Gesundheit der 24 hpf injiziert Embryonen. Ein lebendige Embryo (A) entwickelt bis 24 hpf, ist leicht zu unterscheiden von einem Embryo, die Entwicklung (B) abgebrochen wurde. Embryonen, die ähneln (B) oder drastisch veränderte Funktionen, um (A), wie z. B. Wirbelsäulenverkrümmung oder Kopf verändert und Augenentwicklung sollte vom Gericht entfernt werden. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Abbildung 4 : Heteroduplex Mobility Assay der SgRNA-Cas9 mikroinjiziert Zebrafisch-Embryonen. Pools von 5 Embryonen pro Probe wurden bei 72 gesammelt hpf und gDNA extrahiert wurde. Heteroduplex-Analyse wurde durchgeführt wie beschrieben, wurden Proben gleich mit 500 geladen ng DNA. Bahnen: M = 100 bp Marker; 1 = uninjected Steuerung; 2 = Injektion Sample 1; 3 = Injektion Probe 2. Bandgröße erwartet = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Abbildung 5 : Heteroduplex Mobility Assay von gDNA extrahiert vom Heck eines Erwachsenen CRISPR-injiziert Zebrafisch. Embryonen, die mit einem SgRNA und einem Cas9 Protein injiziert wurden, wurden bis zum Erwachsenenalter (3 Monate) angebaut. Fisch B und C zeigen Heteroduplex Bänder und wurden daraufhin gezüchtet, um Keimbahn übertragen Indels identifizieren; Fisch A war nicht in der nachfolgenden Analyse verwendet, da es keine positive Heteroduplex Band aufweist. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch A; 3 = Fisch B; 4 = Fisch C. erwartet Bandgröße = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Abbildung 6 : Heteroduplex Mobility Assay von einzelnen Embryonen erzeugt durch die Züchtung einer F0 CRISPR-injiziert Zebrafisch zu einem Wild-Typ Fisch Keimbahn übertragen Indels identifizieren. Zebrafisch waren gedeckt, und die F1-Embryonen für 72 h. einzelne Embryonen gezüchtet wurden gesammelt und Heteroduplex Analyse durchgeführt wie beschrieben. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2-10 = einen einzelnen Formel 1 Embryo pro Bahn. Dieses Gel zeigt, dass 7 von 10 Embryonen eine positive Heteroduplex-Band zeigen, eine Keimbahn-Übertragungsrate von 70 % der Indel angibt. Bandgröße erwartet = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Abbildung 7 : Heteroduplex Mobility Assay der F1 Zebrafisch Schweif erwachsenenclips. Erwachsener F1 Fische wurden von HMA Indels identifizieren erzielte. Fische, die eine positive Heteroduplex Band ausgestellt wurden PCR verstärkt und zur breiten Sequenzierung Analyse zur Bestimmung der Art der Mutation. (A) Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch ein (4 bp Deletion, 1 bp Missverhältnis). (B) diese F1-Fisch aus der gleichen Gründer identifiziert wurden und doch zeigen die verschiedenen Heteroduplex Musterung, anzeigend Germline Übertragung mehrere veränderte Allele aus einem einzigen Gründer. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch B (4 bp einfügen, 7 bp Mismatch), 3 = Fisch C (4 bp löschen, 4 bp Mismatch). Jeder dieser Indels erstellt ein vorzeitiges Stopcodon in die kodierende Sequenz des Zielgens, NGS bestimmt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine gezielte Genom-Editierung mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie im Zebrafisch durchzuführen, um Gen-Knockouts auf robuste und kostengünstige Weise zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur biologischen Rolle eines Gens im Kontext eines Wirbeltiermodellsystems zu beantworten, z. B. wie ein Gen zu Entwicklungsprozessen in Eukaryoten höherer Ordnung beiträgt. Mit diesen einfachen, robusten Verfahren kann Laborpersonal aller Erfahrungsstufen, einschließlich Studenten, gezielte genomische Modifikationen im Zebrafisch durchführen.Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, sollten in der Lage sein, die Schritt-für-Schritt-Anleitung zu befolgen, um optimale genomische Ziele für die CRISPR-Mutagenese zu identifizieren, eine Mikroinjektion von Zebrafischembryonen durchzuführen und modifizierte Allele zu identifizieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da diese Methode für Studenten gedacht ist, die mit einer oder mehreren der erforderlichen Techniken nicht vertraut sind. Richtlinien für das Design von Template-spezifischen Oligos für die Produktion von Guide-RNA sind im Textprotokoll enthalten.Zu Beginn suspendieren Sie das Cas9-Protein in Puffer, um eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter zu erzeugen. Lagern Sie diese Lösung in injektionsfertigen Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Synthetisieren Sie dann die sgRNA mit einem In-vitro-Transkriptionskit, wie es in den Materialien dieses Artikels gemäß den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagen wird.Aufreinigung der synthetisierten sgRNA mit einer RNAse-freien Ammoniumacetat-Fällung. Geben Sie 25 Mikroliter fünfmolares Ammoniumacetat zur synthetisierten RNA und mischen Sie die Lösung durch Vortexen. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter 200 Proof nukleasefreies Ethanol in die Probe.Und lege die Reaktion für mindestens 20 Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, und achten Sie darauf, das RNA-Pellet nicht zu stören.Fügen Sie dann einen Milliliter 70%Ethanol hinzu und drehen Sie das Rohr mehrmals um, um das restliche Salz aus dem Rohr zu waschen. Zentrifugieren Sie erneut bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius für sieben Minuten. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den größten Teil der Lösung zu entfernen.Verwenden Sie anschließend eine P200-Pipette, um so viel wie möglich von der restlichen Lösung zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Achten Sie darauf, eine RNA-Kontamination zu vermeiden, und trocknen Sie das Pellet an einem sauberen Ort, bis keine Flüssigkeitstropfen mehr im Röhrchen sichtbar sind. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern RNAse-freiem Wasser und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um das Produkt zu quantifizieren.Aliquotieren Sie die Lösung für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius. Mischen Sie als Nächstes 300 bis 500 Nanogramm sgRNA mit einem gleichen Volumen an 2X RNA-Gelladefarbstoff. Befreien Sie dann mit einer P1000-Pipette jede der Agarosegel-Vertiefungen mehrmals mit laufendem Puffer von Ablagerungen.Laden Sie die Lösungen in die Vertiefungen des Agarosegels und lassen Sie das Gel mit 10 Volt pro Zentimeter ausreichend lange laufen, um die RNA-Banden auf dem Gel zu trennen. Die Zeit kann je nach Elektrophoresegerät variieren. Im Allgemeinen sollte die Färbefront auf 2/3s Länge des Gels verlaufen.Verwenden Sie dann eine Nukleinsäurefärbung, um die Banden sichtbar zu machen. Intakte RNA erscheint als einzelne Bande, wie hier auf Spur eins und zwei. Degradierte RNA verläuft als Abstrich, wie z. B. auf Bahn drei.Bereiten Sie zunächst die Zebrafisch-Probanden in der Nacht vor der Durchführung der Injektionen auf die Zucht vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie dann Cas9-Protein und sgRNA in einem Verhältnis von zwei zu eins. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, während Cas9 und sgRNA einen Ribonukleoproteinkomplex bilden.Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter 2,5%ige Phenolrotlösungen in ausreichend RNAse-freiem Wasser hinzu, um ein Endvolumen von fünf Mikrolitern zu erreichen. Um die Injektionsnadel vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenabzieher, um eine ein Millimeter große Glaskapillare zu ziehen. Schneide dann die Spitze der entstandenen Glasnadel mit einer Rasierklinge ab, um eine abgewinkelte Öffnung zu erhalten.Legen Sie die Nadel in einen Mikromanipulator, der an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop den Injektionsdruck so lange ein, bis die Nadel gleichmäßig einen Nanometer Lösung in die Petrischale injiziert. Üben Sie vor der Mikroinjektion von Embryonen die Vorbereitung von Nadeln und die Injektion von Kontrollembryonen mit einer reinen Farbstofflösung und notieren Sie das Überleben nach 24 Stunden Entwicklung.Sie sollten in der Lage sein, eine Überlebensrate von mehr als 90% im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolle zu erreichen. Wählen Sie als Nächstes 10 bis 15 Embryonen als Kontrollpopulation aus und legen Sie sie in eine separate, beschriftete Petrischale. Richten Sie die verbleibenden Embryonen mit einer Transferpipette vorsichtig auf einer Injektionsplatte bei Raumtemperatur aus.Injizieren Sie unter einem Präpariermikroskop einen Nanoliter der Lösung in den Dottersack jedes Embryos. Geben Sie dann die injizierten Embryonen in eine beschriftete Petrischale zurück und bedecken Sie sie mit 1X E3-Medium mit Methylenblau. Legen Sie die injizierten Embryonen für 24 Stunden in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius.Untersuchen Sie dann die injizierten Embryonen, um tote oder sich abnormal entwickelnde Individuen zu entfernen. Zuerst werden zwei Sätze von fünf 72 Stunden alten Embryonen von den Platten mit den injizierten Embryonen und ein Satz von fünf 72 Stunden alten Embryonen aus der nicht injizierten Kontrollgruppe in die Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig von jedem Embryosatz und betäuben Sie sie.Entfernen Sie das Anästhetikum nach zwei Minuten und fügen Sie 45 Mikroliter 50 millimolare Natriumhydroxid hinzu. Dann inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad. Nehmen Sie anschließend die Proben aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.Fügen Sie fünf Mikroliter eines molaren pH-Tris-Hydrochlorids hinzu und wirbeln Sie die Proben kräftig ein. Dann zentrifugieren Sie die Lösung drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand, der die genomische DNA enthält, in ein neues markiertes Röhrchen und lagern Sie die gDNA bei minus 20 Grad Celsius.Verwenden Sie die Primer, die für die Amplifikation um die sgRNA-Zielregion herum entwickelt wurden, wie im Text beschrieben, um ein PCR-Fragment für die Heteroduplex-Analyse zu amplifizieren. Verwenden Sie ein PCR-Aufreinigungskit, um die Produkte der PCR-Reaktion zu reinigen. Verdünnen Sie die Proben in 30 Mikrolitern Wasser und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA zu quantifizieren.Legen Sie die Röhrchen mit den PCR-Amplikons in ein schwimmendes Gestell in ein kochendes Wasserbad. Bereiten Sie anschließend ein 15%iges Polyacrylamid-FSME-Gel mit 30%igem Polyacrylamid vor. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, geben Sie es in ein Elektrophoresegerät mit FSME-Laufpuffer.Laden Sie dann 500 Nanogramm der neu getemperten PCR-Produkte und laden Sie eine Kontrolle neben jeden Satz von sgRNA-Proben. Lassen Sie das Gel zweieinhalb Stunden lang bei 150 Volt laufen oder bis sich die Farbstofffront am unteren Rand des Gels befindet. Wachsen Sie mit injizierten Zebrafischembryonen bis zum Erwachsenenalter auf, die Heteroduplex-Banden im HMA aufweisen.Um die HMA zu interpretieren, vergleichen Sie die Intensität der Homoduplex-Bande aus der PCR der Wildtyp-Kontrolle ohne Injektion mit den entsprechenden injizierten Proben. Wenn ausreichend beschnitten wurde, sollte die Intensität der Bande des injizierten Fisches etwa 50 % niedriger sein als bei der Wildtyp-Kontrolle. Um das Vorhandensein von Indels bei potentiellen Gründerelternfischen zu bestätigen, betäuben Sie den Fisch mit 0,004% Tricain und entfernen Sie mit einer sauberen Rasierklinge 1/2 bis 3/4 der Schwanzflosse.Legen Sie dann den Schwanz in 45 Mikroliter 50 Millimolar Natriumhydroxid. Setzen Sie den Fisch in ein Auffangbecken zurück und führen Sie die gDNA-Extraktion wie zuvor beschrieben durch. Führen Sie als Nächstes eine HMA an der gDNA des Schwanzclips durch, um festzustellen, ob die Person erfolgreich durch CRISPR-Injektion verändert wurde.Dann züchten Sie die erwachsenen Tiere, die Heteroduplex-Banden in der Schwanz-DNA aufweisen, mit Wildtyp-Fischen. Wählen Sie Gründerfische aus, um F1-Fische basierend auf der HMA-Analyse von Pools zu generieren. Sequenzieren Sie schließlich die gDNA des interessierenden Fisches, um die Art des Indels zu charakterisieren.Nach erfolgreicher Herstellung und Mikroinjektion von CRISPR-Reagenzien wurden Zebrafischembryonen mittels HMA auf offensichtliche Phänotypen und Indelbildung analysiert. Die Cas9-induzierte Indelbildung an der Tyrosinase führt zu einem Verlust der Pigmentierung und ist 48 Stunden nach der Befruchtung leicht zu erkennen. Die Identifizierung von CRISPR-modifizierten Allelen, die nicht zu offensichtlichen Entwicklungsphänotypen führen, erfolgt mit Hilfe von HMA.Ein erfolgreiches Targeting des interessierenden Gens führt zur Bildung von Heteroduplex-Banden und zur Verringerung der Intensität der Homoduplex-Bande, wie z. B. in den Spuren drei und vier. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Wirbeltierorganismus eine ethische Verantwortung mit sich bringt. Dieses Protokoll beschreibt Strategien, die die Anzahl der Zebrafische minimieren, die benötigt werden, um einen Knockout zu erzielen, ein Ziel, das bei der Durchführung dieses Verfahrens berücksichtigt werden sollte.Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um schnell Zebrafische zu generieren und zu identifizieren, die CRISPR-modifizierte Allele tragen, die mit hoher Effizienz in der Keimbahn übertragen werden. Wichtig ist, dass diese Technik so optimiert wurde, dass sie ein kostengünstiger Ansatz ist, der für Studenten und andere mit wenig Vorerfahrung zugänglich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen CRISPR-basierten Gen-Knockout-Ansatz mit Zebrafischen einfach entwerfen und implementieren können.

efficient-production-identification-crisprcas9-generated-gene

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video beschreibt eine Technik der Embryo-Mikroinjektion, um Verbindungen in den Dottersack des Zebrafisches zu bringen.

Mikroinjektion von Embryonen: Eine Technik, um eine Verbindung in das Eigelb des Zebrafisches zu bringen

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung des RNA-Targeting-Enzyms Cas13D (RfxCas13D) in Fliegen.

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Lernen Sie die effiziente CRISPR/Cas9-Genomeditierung in Danio rerio für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht Forschern aller Erfahrungsstufen, gezielte Gen-Knockouts zu erzeugen und zu identifizieren.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Weitere Videos entdecken