Nested-PCR zum Nachweis einer spezifischen viralen Genomsequenz

Die verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion, die verschachtelte PCR, kann spezifische Gensequenzen selektiv amplifizieren.

Um eine virale Zielsequenz nachzuweisen, beginnen Sie mit einem Mastermix, der äußere Primer enthält, die zu einer größeren DNA-Region komplementär sind, die die Zielvirussequenz, dNTPs und thermostabile DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer enthält.

Fügen Sie dieser Mischung doppelsträngige virale DNA hinzu, die aus den virusinfizierten Zellen extrahiert wurde. Übertragen Sie das Rohr in einen Thermocycler; Führen Sie den ersten PCR-Zyklus durch.

Bei der Denaturierung produziert die doppelsträngige DNA zwei einzelsträngige Matrizen. Bei einer geeigneten Glühtemperatur binden die äußeren Primer an die entsprechenden Zielsequenzen. Später verlängert die DNA-Polymerase die Primer mit dNTPs und erzeugt große Amplicons, die die spezifische Sequenz innerhalb der amplifizierten DNA enthalten.

Übertragen Sie diese Amplikons in eine neue Röhre. Ergänzen Sie mit einem frischen Mastermix, der innere oder verschachtelte Primer enthält, die auf eine kleinere, spezifischere Sequenz innerhalb der größeren amplifizierten DNA abzielen. Führen Sie die zweite PCR durch.

Während der zweiten PCR denaturiert der DNA-Strang. Nach der Denaturierung binden die verschachtelten Primer die Zielstellen auf dem einzelsträngigen Template, gefolgt von einer Polymerase-vermittelten Primerverlängerung.

Wiederholen Sie den zweiten PCR-Zyklus mehrmals, um ausschließlich die Zielvirussequenz zu amplifizieren.

Analysieren Sie das PCR-Produkt, um die kleineren Amplikons zu visualisieren und das Vorhandensein der spezifischen Virussequenz zu bestätigen.