Entwicklung und Prüfung artspezifischer quantitativer PCR-Assays für Umwelt-DNA-Anwendungen

Gut optimierte Assays sind für die korrekte Interpretation von Umwelt-DNA-Daten von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Design- und Testschritte, um einen solchen Assay zu entwickeln. Im Allgemeinen ist Umwelt-DNA eine nicht-invasive Methode zum Nachweis einer bestimmten Art oder einer Reihe von Arten.

Es kann Kosten senken und ist im Vergleich zu herkömmlichen Erhebungsmethoden sensitiver. Diese Methode kann den Naturschutz und das Wildtiermanagement durch den Nachweis von DNA einer Art von Interesse unterstützen, so dass möglicherweise auf das Vorkommen einer Art im beprobten Gebiet geschlossen werden kann. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der quantitativen PCR kann es leicht zu einer Kontamination kommen, und es sind Negativkontrollen erforderlich, um die Schritte zu identifizieren, bei denen die Kontamination eingeführt wurde.

eDNA ist ein Feld, das mit Fachjargon und Kurzbegriffen übersät ist. Für diejenigen, die nicht in Molekularbiologie oder qPCR geübt sind, können visuelle Demonstrationen bei der Planung eines Versuchsdesigns von der Konzeptualisierung bis zur Datengenerierung hilfreich sein. Das Verfahren wird von Dannise Ruiz Ramos, einer Biologin aus unserem Labor, und Trudi Frost, einer studentischen Laborassistentin, vorgeführt.

Zu Beginn können Sie mit der Nukleotiddatenbank des NCBI Sequenzen aus mehreren Genregionen für Arten von Interesse suchen und herunterladen. Wählen Sie alle Sequenzen aus, die den Spezifikationen entsprechen, und wählen Sie Senden an.Wählen Sie Complete Record, File, Download Format als GenBank oder FASTA und dann Create File (Datei erstellen) aus. Diese Sequenzen werden nun auf dem Computer gespeichert.

Wiederholen Sie diese Schritte für alle Arten von Interesse. Bewahren Sie die Sequenzen für jede Genregion in einer separaten Datei auf, da sie separat analysiert werden. Um die Sequenzen aus jeder Genregion separat auszurichten, importieren Sie die heruntergeladenen Sequenzdateien in ein Sequenzausrichtungsprogramm, z. B. die Geneious Prime-Software.

Erstellen Sie separate Ordner für jede Genregion und wählen Sie dann alle Sequenzen in einem Ordner aus, der Sequenzen aus einer Genregion enthält. Verwenden Sie das Werkzeug Mehrfachausrichtung, um eine Nukleotidausrichtung zu erstellen, z. B. Geneious oder MUSCLE der ausgewählten Sequenzen. Wählen Sie vielversprechende Regionen für das Assay-Design durch die Visualisierung ausgerichteter Sequenzdaten.

Wählen Sie eine Region aus, in der viele Sequenzdaten für die interessierende Art verfügbar sind, die zwischen den Arten stark voneinander abweichen und die Variation innerhalb der Art gering ist. Entwerfen Sie als Nächstes die Assay-Primer und die Sonde. Verwenden Sie die qPCR-Assay-Designsoftware, um fünf Sätze von qPCR-Assays zu entwerfen.

Fügen Sie die ausgewählte Sequenz in das Feld "Sequenzeintrag" ein. Wenn durch die Achse Räume erstellt wurden, löschen Sie diese aus der Sequenz. Wählen Sie die qPCR 2-Primer-Sonde in der Option Choose Your Design aus und laden Sie dann die empfohlenen Assays herunter.

Kopieren Sie die Sequenzen aus dem Vorwärtsprimer des ersten Assays und suchen Sie nach dieser Primersequenz im zuvor erstellten Alignment. Wenn Sie Geneious Prime verwenden, verwenden Sie das Werkzeug "Vorhersage beschriften", um den Primerbereich zur Ausrichtung hinzuzufügen. Tun Sie dies für alle Kombinationen von Primer und Sonde.

Untersuchen Sie diese Bereiche der Ausrichtung auf Variationen innerhalb der Zielspezies sowie innerhalb der gleichzeitig vorkommenden Spezies. Testen Sie Primer in silico mit dem Primer-BLAST von NCBI. Füge Primer in die Use my own primer box unter Primer Parameters ein.

Wählen Sie in den Optionen für die Überprüfung der Primer-Paarspezifität die Option NR als Datenbank aus und geben Sie die taxonomische Reihenfolge oder Familie des gewünschten Organismus in das Feld Organismus ein. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Primer wahrscheinlich keine Nichtzielspezies amplifizieren. Testen Sie die Effizienz des Assays in vitro, indem Sie eine Standardkurve erstellen und die Effizienz und den linearen Bereich der Kurve bestimmen.

Es werden mindestens sechs zehnfache Verdünnungen eines synthetischen DNA-Standards, der die Zielsequenz enthält, mit etwa einer bis einer Million Kopien pro Reaktion getestet. Verwenden Sie die qPCR-Software, um den CQ-Wert jedes Standards auf der Y-Achse und die logarithmische Basis 10 der anfänglichen Standardkonzentration in Kopien pro Reaktion auf der X-Achse darzustellen. Die qPCR-Software sollte automatisch eine lineare Regression ausführen.

Berechnen Sie den Wirkungsgrad aus der Steigung der Regression. Überprüfen Sie die Standardkurve visuell auf Verzerrung oder schlechte Leistung, gemessen anhand des Wirkungsgrads und der R-Quadrat-Werte. Verwenden Sie eine interne Positivkontrolle, um auf PCR-Hemmung von tatsächlichen Feldproben zu testen, was zu einer Abnahme der Sensitivität und falsch negativen Ergebnissen führen kann.

Bestimmen Sie die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen für jeden Assay. Testen Sie Assays mit Nicht-Zielspezies, um die Spezifität zu überprüfen und sicherzustellen, dass der Assay mit einem IPC-Multiplexed gut funktioniert. Assays mit guter Sensitivität, Spezifität und Effizienz können zu den nächsten Schritten übergehen.

Um einen In-situ-Test des Assays durchzuführen, entnehmen Sie mehrere Wasserproben und bereiten Sie sie für die qPCR auf. Führen Sie den quantitativen PCR-Assay durch und vergleichen Sie die eDNA-Konzentration und -Nachweishäufigkeit mit bekannten Unterschieden in Vorkommen und Häufigkeit. Bestätigen Sie alle Erkennungen durch Sequenzierung.

Verfügbare Sequenzen aller Unionidae-Arten im Clinch River wurden heruntergeladen und abgeglichen. Nach der Entwicklung mehrerer Assays wurden fünf Sätze von Primern und Sonden zur visuellen Beurteilung zur Ausrichtung hinzugefügt. Die Primer- und Sondensets wurden in silico und in vitro getestet.

Im Labor wurden alle Assays mit DNA-Extraktionen von 27 verfügbaren Spezies getestet, um die Spezifität zu überprüfen. Ein Assay amplifizierte erfolgreich nur die Zielspezies. Hier ist ein erfolgreicher Assay mit guter Effizienz und R-Quadrat-Werten dargestellt.

Die LOD und LOQ für den ausgewählten Assay betrugen jeweils fünf Kopien pro Reaktion. Im Gegensatz dazu wurden Assays, die eine Standardkurve mit geringer Effizienz erzeugten, verworfen. In einer Qualitäts-qPCR amplifizieren die Standardverdünnungen bei gleichmäßig verteilten Zyklusquantifizierungswerten von etwa 3,3 Zyklen für jeden zehnfachen Konzentrationsunterschied.

Bei einer schlechten qPCR können die Standards eine ungleichmäßige Variation der Zyklusquantifizierungswerte zwischen den Verdünnungen aufweisen. Die IPC-Amplifikation für unbekannte Proben sollte mit den Ergebnissen der Negativ-Template-Kontroll-IPC verglichen werden. Wenn keine Inhibitoren in den Proben vorhanden sind, sollte die gesamte IPC-Amplifikation eine enge Gruppierung im Diagramm aufweisen, wobei die Quantifizierungswerte des Zyklus nahezu mit denen der Kontrolle ohne Template übereinstimmen.

Für die In-situ-Untersuchung des Assays umfassten die Standorte den Boden des Muschelbetts in Strömen, den Boden des Muskelbetts in Ufernähe, 100 Meter flussabwärts des Flussbettes, 500 Meter stromabwärts des Flussbettes und 500 Meter flussabwärts des Flussbettes in Ufernähe. Quantitative PCR-Assays für Umwelt-DNA können bei der Überwachung sowohl invasiver als auch gefährdeter Arten helfen und unser Verständnis der räumlichen und zeitlichen Veränderungen bei der Artenerkennung verbessern, ohne dass der einzelne Organismus physisch erfasst werden muss.