Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der Enterococcus spp. Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Das übergeordnete Ziel dieses digitalen Duplex-PCR-Assays ist es, gleichzeitig die allgemeine und die mit dem Menschen assoziierte fäkale Kontamination in Gewässern zu quantifizieren. Dieser Assay kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Überwachung der Wasserqualität in der Freizeit zu beantworten, z. B. wie viel allgemeiner Fäkalindikator, d. h. Enterokokken und vor allem der mit menschlichen Fäkalien assoziierte HF183-Marker, im Wasser vorhanden ist.

Der Hauptvorteil dieses Assays besteht darin, dass er zwei Ziele in einer Reaktion quantifiziert und im Vergleich zur qPCR das Laufen von Standardkurven und damit die damit verbundene Verzerrung und Variabilität überflüssig macht. Das Verfahren wird von Meredith Raith, unserer leitenden Forschungstechnikerin, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst Stammkonzentrationen von 100 Mikromol pro Liter für alle Primer in molekularem Wasser und Sonden in TEPH 8 Puffer vor, wie im Protokolltext beschrieben.

Bereiten Sie als Nächstes einen Mastermix vor, indem Sie die entsprechenden Mengen der digitalen PCR-Mischung, der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, der Fluoreszenzsonde und des nukleasefreien Wassers mischen. Pipettieren Sie mindestens 10 Mal auf und ab, um zu mischen, und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Lösung zu bringen. Da der dPCR-Mastermix viskoser ist als der herkömmliche qPCR-Mastermix, ist es notwendig, die Mischtechnik durch Pipettieren zu verwenden, um eine homogene Lösung zu erhalten.

Dies ermöglicht eine genaue nachgelagerte dPCR-Quantifizierung. Um die Assay-Mischung für die Tröpfchenerzeugung herzustellen, um Proben in Duplikaten laufen zu lassen, pipettieren Sie 36 Mikroliter des Mastermixes in eine normale PCR-Platte. Mischen Sie zu jedem der 36-Mikroliter-Mastermixe 12 Mikroliter DNA-Template und lassen Sie die entsprechenden Replikatvertiefungen auf der Platte leer

Fügen Sie Positivkontrollen hinzu, um sicherzustellen, dass der Assay ordnungsgemäß abläuft. Fügen Sie keine Vorlagenkontrollen oder NTCs hinzu, um sicherzustellen, dass sich keine Kontamination in der Platte befindet, und um die Fluoreszenz-Basislinie später für die Datenanalyse festzulegen. Mischen Sie vor der Einrichtung des Tröpfchengenerators die Assay-Mischungen, indem Sie die Mischungen mit einer Mehrkanalpipette etwa 15 Mal auf und ab pipettieren.

Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze in der Flüssigkeit bleibt, um zu vermeiden, dass Blasen in der Mischung entstehen. Setzen Sie anschließend die erste Kartusche mit acht Vertiefungen in einen weißen Kartuschenhalter ein und klicken Sie den Kartuschenhalter zu. Die erste Kartusche sitzt nun fest und kann sich nicht aus der Halterung lösen, während Tröpfchen entstehen.

Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 20 Mikroliter der Assay-Mischung in die mittlere Position der kartuschenmarkierten Probe, ohne Luftblasen einzuführen. Pipettieren Sie 70 Mikroliter Tröpfchenöl auf die linke Seite der mit Öl gekennzeichneten Kartusche ein. Decken Sie die Kartusche mit einer Dichtung ab und stellen Sie sicher, dass die Dichtung flach ist und gleichmäßig von den vier Häkchen zum Rand der Kartusche gehalten wird.

Drücken Sie die grün leuchtende Taste am Tröpfchengenerator, um die Klappe zu öffnen und die Patrone einzusetzen. Drücken Sie die Taste erneut, um den Generator zu schließen. Sobald sich die Tür schließt, wird der grüne Knopf gedimmt und die Tür kann nicht wieder geöffnet werden.

Die Tröpfchengenerierung beginnt sofort und dauert etwa eine Minute lang. Während die Tröpfchengenerierung ausgeführt wird, legen Sie die zweite Kartusche in einen zweiten weißen Kartuschenhalter und bereiten Sie sie auf die gleiche Weise wie die erste Kartusche vor. Wenn die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist, wird die schwach beleuchtete Schaltfläche grün.

Öffnen Sie die Klappe des Tröpfchengenerators, entfernen Sie den weißen Patronenhalter mit der ersten Kartusche und legen Sie ihn beiseite. Setzen Sie die zweite Kartusche in den Tröpfchengenerator ein. Entfernen Sie die Dichtung von der ersten Kartusche und entsorgen Sie sie.

Lösen Sie den weißen Patronenhalter nicht, da die neu erzeugten Tröpfchen dadurch beschädigt werden können. Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette, die auf 40 Mikroliter eingestellt ist, die Spitzen in einem Winkel von 45 Grad in die dritte Spalte der mit den markierten Tröpfchen ein und pipettieren Sie langsam alle Tröpfchen hoch. Übertragen Sie sie auf die endgültige PCR-Platte, indem Sie die Pipettenspitze etwa auf halber Höhe an die Well-Wand legen und die Tröpfchen langsam ausstoßen.

Wenn die Tröpfchenerzeugung für Kartusche zwei abgeschlossen ist, entfernen Sie auf die gleiche Weise die Dichtung von Kartusche zwei und übertragen Sie die erzeugten Tröpfchen auf die endgültige PCR-Platte. Legen Sie eine durchstechbare Folienabdeckung auf die Platte und legen Sie sie auf einen Plattenversiegeler. Stellen Sie das Versiegelungsmittel auf 180 Grad Celsius ein, drücken Sie die Play-Taste auf dem Versiegelungsmittel und versiegeln Sie es 10 Sekunden lang.

Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die versiegelte endgültige PCR-Platte in den Thermocycler. Verwenden Sie einen Thermocycler, der mit der finalen PCR-Platte kompatibel ist und eine Temperaturrampengeschwindigkeit von zwei Grad Celsius pro Sekunde aufweist. Führen Sie das folgende Wärmeprogramm zehn Minuten bei 95 Grad Celsius durch, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 Grad Celsius und 60 Sekunden bei 60 Grad Celsius, gefolgt von einem zehnminütigen Halten bei 98 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Platte nach Abschluss des Zyklus auf einen Droplet Reader, um die Fluoreszenz in jedem Tröpfchen in jedem Well automatisch zu messen. Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen Raumtemperatur haben, bevor Sie mit der Tröpfchenmessung fortfahren. Öffnen Sie zunächst die mitgelieferte Software, um die Tröpfchenlesung einzurichten.

Doppelklicken Sie im Standard-Setup-Menü mit einem Schaltplan einer leeren 96-Well-Platte auf Well A1, um das Menü mit den drei Abschnitten Probe, Assay 1 und Assay 2 zu öffnen. Geben Sie im Abschnitt "Beispiel" die Beispiel-ID in das Feld "Name" ein, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen rechts mit der Aufschrift "Übernehmen". Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung Experiment, wählen Sie ROT für Erkennung seltener Ereignisse aus und klicken Sie auf Eingabetaste.

Wechseln Sie zu dem Abschnitt mit der Bezeichnung Assay 1. Füllen Sie im Abschnitt Name das Feld Assay aus und klicken Sie auf Enter. Klicken Sie im Feld unten mit der Bezeichnung Typ auf das Dropdown-Menü, wählen Sie Kanal 1 Unbekannt aus und klicken Sie auf Eingabetaste.

Wechseln Sie zu dem Abschnitt mit der Bezeichnung Assay 2. Füllen Sie im Abschnitt Name das Feld Assay aus und klicken Sie auf Enter. Klicken Sie im Feld unter der Bezeichnung Typ auf das Dropdown-Menü, wählen Sie Kanal 2 Unbekannt aus, und klicken Sie auf die Eingabetaste.

Alle Informationen aus den vorherigen Schritten sind nun in der Vertiefung A1.Name allen nachfolgenden Vertiefungen vorhanden, die Tröpfchen enthalten. Um die gesamte Einrichtungszeit zu sparen, klicken Sie auf Umschalttaste oder Steuerung, um mehrere Wells gleichzeitig auszuwählen. Wenn die digitale Darstellung der Platte die physische Platte widerspiegelt, drücken Sie OK unten rechts im Menü.

Wählen Sie im neuen Menü, das oben im Plattenschaltplan angezeigt wird, unter der Vorlage die Option Speichern unter aus, und benennen und speichern Sie die Platte. Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf Ausführen und wählen Sie das entsprechende Färbeset im Popup-Fenster "Laufoptionen" aus. Die Datenerfassung wird eingeleitet und in Echtzeit in der Software angezeigt.

Wenn der Reader fertig ist und ein Feld mit der Meldung Run Complete angezeigt wird, klicken Sie auf OK. Überprüfen Sie den Abstand zwischen den positiven und negativen Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzwerte in allen Tröpfchen in den NTC-Vertiefungen nahe der Basislinie liegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung Ereignisse.

Klicken Sie unten auf das Feld Single und rechts neben dem angezeigten Histogramm auf das Feld mit dem Namen Total, um die Gesamtzahl der akzeptierten Tröpfchen pro Well anzuzeigen. Schließen Sie alle Vertiefungen mit weniger als 10.000 Tröpfchen aus, indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten und auf die auszuschließenden Vertiefungen klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung 1D-Amplitude, um die Fluoreszenzschwelle für beide Targets auf etwa eine Standardabweichung der negativen Tröpfchen in den NTC-Vertiefungen einzustellen.

Wählen Sie ganz links auf dem Bildschirm unter den Schaltflächen Automatische Analyse mit zwei Schwellenwerten das Symbol rechts aus, das von einer durchgehenden rosa horizontalen Linie durchzogen ist. Klicken Sie auf das Feld links neben "Schwellenwert einstellen" unter jedem der Amplitudendiagramme und geben Sie die entsprechenden Fluoreszenzschwellenwerte ein. Die Zielkonzentrationen in Kopie pro Mikroliterreaktion werden dann automatisch berechnet.

Exportieren Sie die Ergebnisse in eine CSV-Datei, indem Sie auf die Schaltfläche Exportieren in der oberen linken Ecke des 1D-Amplituden-Bildschirms klicken. Multiplizieren Sie in der CSV-Datei die exportierte Zielkonzentration mit vier, um sie von der Kopie des Ziels pro Mikroliterreaktion in eine Kopie des Ziels pro Mikroliter-DNA-Vorlage umzuwandeln. In dieser Abbildung werden die Duplex- und Simplex-Formate des Digital PCR Assays verglichen.

Das linke und rechte Feld zeigen die Enterokokken- bzw. HF183-Quantifizierung mit den entsprechenden Korrelationskoeffizienten zwischen Duplex- und Simplex-Ergebnissen. Die durchgezogenen Linien zeigen die Regressionslinien und die graue Schattierung die entsprechenden Standardfehler an. Verschiedene Arten von Proben werden durch die Symbole gekennzeichnet.

Die Ergebnisse sind sehr konsistent und oft nicht zu unterscheiden, unabhängig davon, ob Enterokokken und HF183 gleichzeitig in einer Reaktion oder getrennt in zwei Reaktionen gemessen werden. Der digitale PCR-Assay kann auch Inhibitoren in Konzentrationen tolerieren, die ein bis zwei Größenordnungen höher sind als die seiner qPCR-Gegenstücke. Diese Abbildung zeigt die qPCR- und Digital-PCR-Quantifizierung des HF183-Markers in sauberer Abwasser-DNA, die mit zunehmender Konzentration von Huminsäure, die die PCR hemmt, versetzt wurde.

Die erwartete HF183-Quantifizierung in Abwesenheit von Inhibitoren ist definiert als eine 95%ige Konfidenzfaltung zwischen den beiden horizontalen gestrichelten Linien. Die digitale PCR, die durch Dreiecke gekennzeichnet ist, bietet weiterhin eine genaue Quantifizierung bis zu einer Huminsäurekonzentration von 15 Nanogramm pro Mikroliterreaktion, während die durch Kreuze gekennzeichnete qPCR bei einem Nanogramm pro Mikroliter zu unterschätzen beginnt und bei fünf Nanogramm pro Mikroliter vollständig gehemmt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen enteralen HF183 Duplex-Tröpfchen-Digital-PCR-Assay oder einen ähnlichen Assay mit verschiedenen Primern und Sonden durchführen.

Seit der Entwicklung dieses Duplex-Assays, der 2015 in water research veröffentlicht wurde, haben wir eine Reihe weiterer digitaler PCR-Assays entwickelt und validiert, die auf allgemeine fäkale Indikatorbakterien, mikrobielle Tracking-Marker und durch Wasser übertragene Krankheitserreger abzielen. Diese Assays bieten eine direkte und unvoreingenommene Quantifizierung ihres Ziels und werden zu nützlichen Alternativen zu qPCR-Assays im Bereich der Wasserqualitätstests.