Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der

Das übergeordnete Ziel dieses Duplex-Digital-PCR-Assays besteht darin, allgemeine und menschenspezifische fäkale Kontaminationen in Gewässern simultan zu quantifizieren. Dieser Assay kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Qualitätssicherung von Erholungsgewässern zu beantworten, beispielsweise: Wie viel allgemeiner fäkaler Indikator – also Enterococcus – und, noch wichtiger, wie viel menschenspezifischer HF183-Marker ist in den Gewässern enthalten?

Der Hauptvorteil dieses Assays besteht darin, dass er zwei Zielstrukturen in einer Reaktion quantifiziert und im Vergleich zur qPCR die Durchführung von Standardkurven überflüssig macht, wodurch verbundene systematische Fehler und Variabilität entfallen. Den Ablauf wird Meredith Raith, unsere leitende Laborassistentin, demonstrieren. Um mit dem Verfahren zu beginnen, stellen Sie zunächst 100 µmol/L Stammlösungen aller Primer in molekularbiologischem Wasser und der Sonden im TEPH 8-Puffer gemäß den Angaben im Protokolltext her.

Bereiten Sie als Nächstes einen Master-Mix vor, indem Sie geeignete Mengen des Digital-PCR-Mixes, der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, der fluoreszierenden Sonde und nukleasefreiem Wasser mischen. Pipettieren Sie mindestens 10-mal auf und ab, um eine Durchmischung zu gewährleisten, und achten Sie dabei darauf, keine Luftblasen in die Lösung einzubringen. Da der dPCR-Master-Mix viskoser ist als herkömmlicher qPCR-Master-Mix, ist es notwendig, die Pipettiermethode zum Mischen anzuwenden, um eine homogene Lösung zu erzeugen.

Dies ermöglicht eine genaue dPCR-Quantifizierung in nachfolgenden Schritten. Um die Assay-Mischung zur Tropfenerzeugung für die Analyse von Proben im Duplikat vorzubereiten, pipettieren Sie 36 Mikroliter der Master-Mischung in eine gewöhnliche PCR-Platte. Geben Sie zu jeder der 36-Mikroliter-Master-Mischungen jeweils 12 Mikroliter DNA-Vorlage hinzu und lassen Sie die entsprechenden Duplikat-Vertiefungen auf der Platte leer.

Fügen Sie positive Kontrollen hinzu, um sicherzustellen, dass der Assay ordnungsgemäß durchgeführt wird. Fügen Sie No-Template-Kontrollen (NTCs) hinzu, um sicherzustellen, dass keine Kontamination in der Platte vorliegt, und um später die fluoreszierende Basislinie für die Datenanalyse festzulegen. Vor dem Aufbau des Tropfengenerators mischen Sie die Assay-Mischungen, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette die Mischungen etwa 15-mal auf- und abpipettieren.

Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze während des Vorgangs in der Flüssigkeit bleibt, um Luftblasen in der Mischung zu vermeiden. Danach setzen Sie Kartusche eins, die acht Vertiefungen enthält, in einen weißen Kartuschenhalter ein und schließen den Halter mit einem Klick. Kartusche eins sitzt nun fest und kann während der Tropfenbildung nicht aus dem Halter gelöst werden.

Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 20 Mikroliter der Assay-Mischung in die mittlere Position der mit „Probe“ gekennzeichneten Vertiefung der Kartusche, ohne Luftblasen einzuführen. Pipettieren Sie 70 Mikroliter Tröpfchengenerierungsöl auf die linke Seite der mit „Öl“ gekennzeichneten Vertiefung der Kartusche. Verschließen Sie die Kartusche mit einer Dichtung, wobei sichergestellt werden muss, dass die Dichtung flach liegt und gleichmäßig von den vier Markierungen am Rand der Kartusche gehalten wird.

Drücken Sie die grün beleuchtete Taste am Tropfengenerator, um die Tür zu öffnen, und setzen Sie die Kartusche ein. Drücken Sie die Taste erneut, um den Generator zu schließen. Sobald die Tür geschlossen ist, wird die grüne Taste abgedunkelt und die Tür kann nicht erneut geöffnet werden.

Die Tröpfchengenerierung beginnt unmittelbar und dauert etwa eine Minute lang an. Während die Tröpfchengenerierung läuft, setzen Sie Kartusche zwei in einen zweiten weißen Kartuschenhalter ein und bereiten sie auf dieselbe Weise wie Kartusche eins vor. Sobald die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist, leuchtet die zuvor schwach beleuchtete Taste grün auf.

Öffnen Sie die Tür des Tropfengenerators, nehmen Sie den weißen Kartuschenhalter mit Kartusche eins heraus und legen Sie ihn beiseite. Setzen Sie Kartusche zwei in den Tropfengenerator ein. Entfernen und entsorgen Sie die Dichtung von Kartusche eins.

Den weißen Kartuschenhalter nicht lösen, da diese Aktion die neu erzeugten Tropfen beschädigen könnte. Mit einer Mehrkanalpipette, die auf 40 Mikroliter eingestellt ist, die Spitzen in die dritte Spalte der Kartusche einführen, die als Tropfen gekennzeichnet ist, in einem Winkel von 45 Grad und langsam alle Tropfen aufpipettieren. Diese auf die endgültige PCR-Platte übertragen, indem die Pipettenspitze etwa auf halber Höhe an die Wandung des Wells angelegt und die Tropfen langsam ausgestoßen werden.

Auf dieselbe Weise entfernen Sie nach Beendigung der Tröpfchengenerierung für Kartusche zwei die Dichtung von Kartusche zwei und überführen die erzeugten Tröpfchen in die endgültige PCR-Platte. Legen Sie eine durchstechbare Folienabdeckung auf die Platte und platzieren Sie sie auf einem Plattenversiegler. Stellen Sie den Versiegler auf 180 Grad Celsius ein, drücken Sie am Versiegler die Starttaste und versiegeln Sie für 10 Sekunden.

Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie die verschlossene endgültige PCR-Platte in den Thermocycler. Verwenden Sie einen Thermocycler, der mit der endgültigen PCR-Platte kompatibel ist und eine Temperaturanstiegsrate von zwei Grad Celsius pro Sekunde aufweist. Führen Sie das folgende thermische Programm durch: zehn Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 30 Sekunden bei 94 Grad Celsius und 60 Sekunden bei 60 Grad Celsius, gefolgt von einer zehnminütigen Haltephase bei 98 Grad Celsius.

Nach Abschluss des Zyklierens die Platte auf einen Tropfenleser übertragen, um automatisch die Fluoreszenz in jedem Tropfen jedes Wells zu messen. Stellen Sie sicher, dass sich die Tropfen vor dem Tropfenlesen bei Raumtemperatur befinden. Öffnen Sie zunächst die beigefügte Software, um das Tropfenlesen einzurichten.

Öffnen Sie im standardmäßigen Einrichtungsmenü, das ein Schema einer leeren 96-Loch-Platte enthält, das Feld A1 durch einen Doppelklick, um das Menü mit den drei Abschnitten Probe, Assay 1 und Assay 2 zu öffnen. Geben Sie im Abschnitt Probe die Proben-ID in das Feld mit der Bezeichnung Name ein und aktivieren Sie das rechts daneben markierte Kästchen mit Apply. Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung Experiment, wählen Sie RED für Rare Event Detection aus und klicken Sie auf Enter.

Wechseln Sie zum Abschnitt mit der Bezeichnung Assay 1. Füllen Sie im Bereich Name den Assay aus und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie im darunter liegenden Feld mit der Beschriftung Typ auf das Dropdown-Menü, wählen Sie Channel 1 Unknown aus und drücken Sie die Eingabetaste.

Wechseln Sie zum Abschnitt mit der Bezeichnung Assay 2. Im Bereich Name tragen Sie den Assay ein und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie im darunter liegenden Feld mit der Beschriftung Typ auf das Dropdown-Menü, wählen Sie Channel 2 Unknown aus und bestätigen Sie mit Enter.

Alle Informationen aus den vorherigen Schritten sind nun in der Vertiefung A1 vorhanden. Benennen Sie alle weiteren Vertiefungen, die Tropfen enthalten. Um die gesamte Einrichtungszeit zu verkürzen, klicken Sie die Umschalt- oder Steuerungstaste, um mehrere Vertiefungen gleichzeitig auszuwählen. Wenn die digitale Darstellung der Platte der physischen Platte entspricht, klicken Sie unten rechts im Menü auf „OK“.

Wählen Sie in dem neuen Menü, das oben im Plattenschema erscheint, unter „Template“ die Option „Speichern unter“, und benennen und speichern Sie die Platte. Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf „Ausführen“ und wählen Sie im eingeblendeten Fenster „Ausführungsoptionen“ den geeigneten Farbstoffsatz aus. Die Datenerfassung wird gestartet und in Echtzeit in der Software angezeigt.

Wenn der Leser fertig ist und ein Fenster mit der Meldung „Run Complete“ erscheint, klicken Sie auf OK. Überprüfen Sie die Trennung zwischen den positiven und negativen Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzsignale in allen Tröpfchen der NTC-Vertiefungen nahe der Basislinie liegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung Events.

Unten klicken Sie auf das Feld mit der Bezeichnung Single, und rechts neben dem angezeigten Histogramm klicken Sie auf das Feld mit der Bezeichnung Total, um die Gesamtanzahl der akzeptierten Tröpfchen pro Vertiefung anzuzeigen. Schließen Sie alle Vertiefungen mit weniger als 10.000 Tröpfchen aus, indem Sie die Steuertaste gedrückt halten und auf die auszuschließenden Vertiefungen klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung 1D Amplitude, um die fluoreszierende Schwelle für beide Ziele bei etwa einer Standardabweichung der negativen Tröpfchen in den NTC-Vertiefungen festzulegen.

Ganz links auf dem Bildschirm unter „Auto Analyze“ mit zwei Schwellenwert-Knöpfen das Symbol rechts wählen, das einen durchgehenden rosa horizontalen Strich zeigt. Das Kästchen links neben „Schwellenwert festlegen“ unter jedem der Amplitudendiagramme anklicken und die entsprechenden Fluoreszenz-Schwellenwerte eingeben. Die Zielkonzentrationen in Kopien pro Mikroliter Reaktion werden dann automatisch berechnet.

Exportieren Sie die Ergebnisse in einer CSV-Datei, indem Sie auf den Export-Button in der oberen linken Ecke des 1D-Amplitude-Bildschirms klicken. Multiplizieren Sie in der CSV-Datei die exportierte Zielkonzentration mit vier, um sie von Kopien des Zielmoleküls pro Mikroliter Reaktion in Kopien des Zielmoleküls pro Mikroliter DNA-Vorlage umzurechnen. Diese Abbildung vergleicht das Duplex- und das Simplex-Format des Digital-PCR-Assays.

Die linken und rechten Diagramme zeigen die Quantifizierung von Enterococcus bzw. HF183 mit den entsprechenden Korrelationskoeffizienten zwischen Duplex- und Simplex-Ergebnissen. Die durchgezogenen Linien kennzeichnen die Regressionslinien, und die graue Schattierung zeigt die entsprechenden Standardfehler an. Verschiedene Probenarten sind durch die Symbole gekennzeichnet.

Die Ergebnisse sind äußerst konsistent und oft nicht unterscheidbar, unabhängig davon, ob Enterococcus und HF183 gleichzeitig in einer Reaktion oder separat in zwei Reaktionen gemessen werden. Der Digital-PCR-Assay verträgt Hemmstoffe in Konzentrationen, die um eine bis zwei Größenordnungen höher liegen als die von entsprechenden qPCR-Assays verträglichen. Diese Abbildung zeigt die qPCR- und Digital-PCR-Quantifizierung des HF183-Markers in DNA aus gereinigtem Abwasser, die mit steigenden Konzentrationen von Huminsäure versetzt wurde, welche die PCR hemmt.

Die erwartete HF183-Quantifizierung in Abwesenheit von Hemmstoffen ist definiert als ein 95 %-Konfidenzintervall zwischen den beiden horizontalen gestrichelten Linien. Die durch Dreiecke gekennzeichnete digitale PCR liefert weiterhin eine genaue Quantifizierung bis zu einer Huminsäurekonzentration von 15 Nanogramm pro Mikroliter Reaktion, während die durch Kreuze gekennzeichnete qPCR bereits bei einem Nanogramm pro Mikroliter unterhalb des tatsächlichen Werts liegt und bei fünf Nanogramm pro Mikroliter vollständig gehemmt wird. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diesen enteralen HF183-Duplex-Droplet-Digital-PCR-Assay oder einen ähnlichen Assay unter Verwendung unterschiedlicher Primer und Sonden durchführt.

Seit der Entwicklung dieses Duplex-Assays, der 2015 in Water Research veröffentlicht wurde, haben wir eine Reihe weiterer Digital-PCR-Assays entwickelt und validiert, die auf allgemeine fäkale Indikatorbakterien, mikrobielle Markierungsgene und wasserbürtige Krankheitserreger abzielen. Diese Assays ermöglichen eine direkte und unverzerrte Quantifizierung ihrer Zielstrukturen und gewinnen als nützliche Alternativen zu qPCR-Assays im Bereich der Wasserqualitätsprüfung zunehmend an Bedeutung.