Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Die Methylierung von DNA-Cytosin-Resten ist ein charakteristisches Merkmal von Leukozyten oder weißen Blutkörperchen.

Die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (mdPCR) ermöglicht die gleichzeitige Identifizierung mehrerer methylierter DNA-Regionen innerhalb der Leukozyten.

Bereiten Sie eine Mischung vor, die Reaktionspuffer, DNA-Polymerase und nukleasefreies Wasser enthält. Fügen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie Fluoreszenzhydrolysesonden hinzu, die für jede Zielregion spezifisch sind. Die Sonden bestehen aus verschiedenfarbigen Fluorophor-Reportern, die an Quencher gebunden sind, um die Fluoreszenzemission zu hemmen.

Fügen Sie Bisulfit-konvertierte DNA hinzu, wobei die unmethylierten Cytosine in Uracile desaminiert werden, während die methylierten Cytosine unverändert bleiben. Mischen.

Füllen Sie eine Glasspritze mit einem Trägeröl-Tensid-Gemisch und eine weitere mit einem Trägeröl-PCR-Gemisch und verbinden Sie diese mit dem mikrofluidischen Tröpfchengenerator. Das Trägeröl-wässrige PCR-Gemisch emulgiert in Tröpfchen im Sub-Nanoliter-Bereich. Das Tensid stabilisiert die Emulsion und verhindert das Verschmelzen von Tröpfchen.

Sammeln Sie die Tröpfchen und führen Sie die PCR durch. In jedem Tröpfchen denaturiert die hohe Denaturierungstemperatur doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA und aktiviert die Polymerase. Die Reaktionstemperatur wird abgesenkt, was ein ortsspezifisches Glühen der Primer und Sonden ermöglicht.

Da die Polymerase den DNA-Primer-Duplex bindet und verlängert, amplifizieren Uracile als Thymine, während methylierte Cytosine als Cytosine amplifizieren, was die Unterscheidung zwischen methylierten und unmethylierten Regionen ermöglicht. Die Polymerase spaltet weiter und gibt den Reporter von der Sonde ab, wodurch eine Fluoreszenzemission verursacht wird.

Visualisieren Sie die Tropfen nach der PCR unter einem Mikroskop. Die Fluoreszenzfarbe zeigt das Vorhandensein spezifischer methylierter DNA-Ziele an.