Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zirkulierende microRNAs und biologische Flüssigkeiten, wie Plasma oder Serum, mit Hilfe der digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie zu quantifizieren. Die Methode kann helfen, Fragen im Bereich des Biomarktes zu beantworten. Durch die Identifizierung von diagnostischem und prognostischem Biomarketing von Krebs.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der hohen Empfindlichkeit. Es kann verwendet werden, um auch die weniger häufig vorkommenden microRNAs zu quantifizieren, ohne dass ein androgynes Referenzgen erforderlich ist. Die Implikation dieser Methode erstreckt sich auf die Krebsdiagnostik, da sie das Potenzial hat, Menschen mit Krebs im Frühstadium zu identifizieren.

Es kann auch bei anderen Krankheiten wie neurologischen oder kardiologischen Erkrankungen angewendet werden. Im Allgemeinen müssen Einzelpersonen vor dem Schritt des thermischen Zyklus auf die Manipulation von Tröpfchen achten, um deren Unterbrechung zu vermeiden. Daher ist eine visuelle Demonstration der Tröpfchenerzeugung von entscheidender Bedeutung, da die Tröpfchen durch unachtsame Manipulation oder zu schnelles Pipettieren zerstört werden können.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Plasma- oder Serum-microRNAs isolieren. Anschließend werden sie umgekehrt transkribiert und verdünnt, wie im Begleitdokument beschrieben. Nehmen Sie den EvaGreen Mastermix, das microRNA-Primer-Set und die cDNA aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen.

Nach dem Auftauen kehren Sie die Mastermix-Röhre mehrmals um. Und dann drehen Sie alle Reagenzien herunter. Bereiten Sie eine digitale Tröpfchen- oder ddPCR-Mischlösung gemäß den Anweisungen im Begleitdokument vor.

Bereiten Sie genug für bis zu acht Proben vor, mit einer No-Template-Kontrolle für jede Bedingung plus einem Überschuss von 10 %Nach dem Zusammenbau mischen Sie die ddPCR-Mischung gründlich und schleudern Sie sie herunter. Beachten Sie, dass technische Replikate aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit dieser Technologie nicht erforderlich sind. Geben Sie nach dem Schleudern 12 Mikroliter ddPCR-Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte.

Geben Sie acht Mikroliter verdünntes cDNA-Template in jede Vertiefung. Setzen Sie dann die Tröpfchengenerator-Kartusche in den Kartuschenhalter ein. Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter jeder vorbereiteten Probe in die mittlere Reihe der Tröpfchengeneratorpatrone.

Vermeiden Sie es, Luftblasen auf den Boden der Vertiefung zu bringen. Füllen Sie jede der Ölquellen in der unteren Reihe mit 70 Mikrolitern Tröpfchengeneratoröl. Haken Sie die Dichtung über den Kartuschenhalter ein.

Setzen Sie ihn in den Tröpfchengenerator ein und schließen Sie den Deckel, um die Tröpfchenerzeugung zu starten. Wenn die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Kartusche aus dem Tröpfchengenerator und entfernen Sie die Einwegdichtung. Die oberen Vertiefungen der Kartusche enthalten die Tröpfchen.

Übertragen Sie langsam und reibungslos 40 Mikroliter aus jedem der acht Top-Wells in eine einzelne Säule einer 96-Well-PCR-Platte. Verschließen Sie die Platte sofort mit Folie, um Verdunstung zu vermeiden. Beginnen Sie innerhalb von 30 Minuten nach dem Versiegeln der Platte mit dem Thermozyklus unter Verwendung des in Tabelle drei des Begleitdokuments beschriebenen PCR-Protokolls.

Schalten Sie das Tröpfchenlesegerät ein. Bewegen Sie dann die Platte vom Thermocycler zum Tröpfchenleser. Setzen Sie die 96-Well-PCR-Platte mit den Post-PCR-Tröpfchen in den Boden des Plattenhalters im Droplet-Reader ein.

Setzen Sie die Oberseite des Plattenhalters auf die PCR-Platte. Drücken Sie beide Entriegelungslaschen fest nach unten, um die PCR-Platte in der Halterung zu fixieren. Starten Sie die QuantaLife-Software vom System-PC. Klicken Sie auf Setup und öffnen Sie die Vorlagendatendatei, die Informationen zu den Proben, Zielgenen und Assays enthält.

Wählen Sie in der linken Navigationsleiste Ausführen aus. Das Fenster Ausführungsoptionen wird angezeigt. Wählen Sie im Menü "Farbstoffset" die Option EVA aus und klicken Sie auf OK, um die Tröpfchenmessung zu starten.

Sobald der Lauf abgeschlossen ist, verwenden Sie das 2D-Amplitudendiagramm in der Analysesoftware, um die positiven Tröpfchen auszuwählen. Um die positiven Tröpfchen auszuwählen, verwenden Sie das Lasso-Werkzeug in der linken Navigationsleiste. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Ereignisse, um die Anzahl der positiven und gesamten Tröpfchen zu überprüfen.

Eine Gesamtanzahl von 18.000 Tröpfchen wird in der Regel mit der sondenlosen ddPCR erreicht. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Konzentration, um die endgültige Konzentrationsprobe zu visualisieren. Verwenden Sie abschließend die Schaltfläche Exportieren.

CSV zum Exportieren der microRNA-Konzentrationswerte. Die mRNA miR-181a-5p wurde in zwei Plasmaproben, S1 und S2, unter Verwendung einer Primerkonzentration von 0,5 und einem Mikroliter bei Glühtemperaturen von 58 und 60 Grad Celsius quantifiziert. Diese Abbildung zeigt die Kopien von microRNA pro Mikroliter in der Amplifikationsreaktion für jede Bedingung.

PCR-positive Tröpfchen für jede Probe sind blau und negative Tröpfchen schwarz dargestellt. Wie hier zu sehen ist, weist die Kontrollprobe erwartungsgemäß keine positiven Tröpfchen auf. Die PCR bei 60 Grad Celsius mit einem 0,5 oder einem Mikroliter Primer führte zu einer besseren Trennung von positiven und negativen Tröpfchen.

In dieser Abbildung stellen die Fehlerbalken das Poisson-Konfidenzintervall von 95 % dar. Und hier wird die Anzahl der positiven Tröpfchen, die in Blau dargestellt ist, mit der Gesamtzahl der Tröpfchen verglichen, die in Grün dargestellt ist. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die digitale Tröpfchen-PCR verwendet werden kann, um die absolute Anzahl der Kopien von microRNA pro Mikroliter einer biologischen Flüssigkeit zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mRNA-Quantifizierung mit digitaler Tröpfchen-PCR durchführen können. Einmal gemeistert, können 96 Proben in nur wenigen Stunden analysiert werden, was ein optimales Ergebnis für eine klinische Umgebung ist. Nach jeder Entwicklung ebnet diese Technik den Weg in das Gebiet der Flüssigbiopsie, um microRNA und andere Nukleinsäuren als Biomarker für Krankheiten zu erforschen.