Name: Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Mikrosphären-PCR-Amplifikaten in mikrofluidischen Tröpfchensystemen mit Polyacrylamid-Mikrosphären. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion einzelsträngiger DNA ohne zusätzliche Trennschritte für diagnostische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Studie stützt sich auf ein Projekt mit dem Titel "kooperatives Forschungsprogramm für Agrarwissenschaft und Technologieentwicklung (Projekt Nr. PJ0011642) "finanziert durch die ländliche Entwicklung Verwaltung, Republik Korea. Diese Forschung wurde auch zum Teil durch einen Zuschuss (NRF-2017R1A2B4012253) des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen, Republik Korea unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch einen Zuschuss (N0000717) des Bildungsprogramm für kreative und industrielle Konvergenz gefördert durch das Ministerium für Handel, Industrie und Energie, Republik Korea unterstützt.

(1) Herstellung einer PDMS mikrofluidischen Plattform
<ol><li>Bereiten Sie 20 mL flüssige PDMS Prepolymer durch Mischen Basispolymer und Katalysator in einem Volumen-Verhältnis von 10:1. Gießen Sie 10 mL Flüssigkeit PDMS auf eine vorbereitete SU-8-Form auf einem Silizium-Wafer für den oberen Teil des Netzes mikrofluidischen. Gießen Sie für den unteren flachen Teil die gleiche Menge an flüssigem PDMS auf dem Siliziumwafer ohne Schimmel Struktur. Hinweis: Das mikrofluidischen Netzwerk ist in einem CAD-Programm entwickelt und dann in einer Fotomaske umgewandelt, um ein Meister mit dem typischen Photolithographie-Prozess (siehe Ergänzende Zahlen) zu fabrizieren. Dieser Meister besteht aus den negativen Photoresist SU-8 Schimmel auf der Silizium-Wafer-11.</li>
	<li>Legen Sie zwei Silizium-Wafern, beschichtet mit flüssigen PDMS-Prepolymer auf der heißen Platte und Heilung bei 75 ° C für 30 Minuten.<ol>
<li>Manuell die gehärtete PDMS-Schicht aus der SU-8 Form abziehen. Richten Sie einen Durchmesser von 1,5 mm Runde Loch Stanzwerkzeug um den Ölhafen im replizierten mikrofluidischen Netzwerk für die Anbindung von Mikron-Skala Strömungskanäle mit der Makro-Flüssigkeitsproben. Die Durchgangsbohrung manuell ausstanzen.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal für die Bildung der beiden Lösungen und die Auslassöffnung Stanzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie hydrophile Oberflächenbehandlung in der oberen und unteren PDMS Schichten mit einer handgeführten Corona Treater12 für mehrere Sekunden pro Probe.<ol>
<li>Stapeln Sie zwei plasmabehandelte PDMS Schichten und Hitze bei 90 ° C für 30 Minuten mit einer Heizplatte für PDMS-PDMS-Bonding-Verfahren. Das Druckwasser mit der Spritzenpumpe in drei Einlass-Ports für die strukturellen Klebens und Dichtigkeitsprüfung des gefertigten Gerätes zu liefern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Herstellung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären
<ol><li>Bereiten Sie in Tabelle 1beschriebenen Wulst-Mischung zu.</li>
	<li>Wirbel und kurz Zentrifuge standard SsDNA Acrydite mit der Bezeichnung Sonde (Ap, 100 μM) und Acrylamide:bis (19:1) Stammlösung.</li>
	<li>Bereiten Sie Lösung ich durch das Mischen von 25 μL von 40 % Acrylamid BIZ Lösung, 10 μL SsDNA (Acrydite-Sonde), 10 μL der 5 X TBE-Puffer (1,1 M Tris, Borat 900 mM, 25 mM EDTA) und 5 μL des Wassers. Bereiten Sie Lösung II mit 50 μL der 20 % Ammonium bleichen.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Spritzen individuell gefüllt mit Lösung I und Lösung II und klebe sie auf die Pumpe Lösung fließt in mikrofluidischen Plattform einzuführen. Bereiten Sie Mineralöl vermischt mit 0,4 % TEMED für Oberfläche erstarren die Mikrosphären. Hinweis: TEMED ist bekannt als freie Radikale Stabilisator. Freie Radikale können die Polymerbildung mit Ammonium Bleichen (APS) beschleunigen um Acrylamid Polymerisation zu katalysieren.</li>
	<li>Füllen Sie eine Glasflasche mit 4 mL des Mineralöls zu einen kontinuierlichen Strom zu erzeugen.</li>
	<li>Legen Sie zwei Röhren mit zwei Ports in die Kappe der Glasflasche als mikrofluidischen Reservoir: der pneumatischen Anschluss für die Anwendung der Druckluft in die Glasflasche von Kompressor und dem flüssigen Hafen für die Versorgung das Drucköl, micro Channel-Netzwerk aus der Glasflasche. Schläuche zwischen der Glasflasche und Ölhafen in mikrofluidischen Gerät anschließen.<ol>
<li>Verbinden Sie die Rohre mit den zwei Lösung Anschlüssen in mikrofluidischen Gerät um die beiden Lösungen aus der Spritzenpumpen liefern. Legen Sie Röhren in die Auslassöffnung um die generierten Mikrosphären in das Becherglas zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 0,4 - 0,7 mL/h. Adjust Druckluft Druck des Kompressors mit einem Regler (82-116 kPa). Legen Sie die Drehzahl (500 u/min) der Magnetrührer Bar in das Becherglas auf einer heißen Platte. Betrieben Sie die Spritzenpumpe und liefern Sie die komprimierte Luft in die Glasflasche mit dem ON/OFF Control ein elektromagnetisches Ventil13von einem externen Kompressor erzeugt.</li>
	<li>Die Bildung von Mikrosphären in der Strömung mit Schwerpunkt Geometrie und Verfestigung der generierten Mikrosphären in das Glasgefäß mit einem digitalen Mikroskop zu beobachten. Hinweis: Die Größe und Geschwindigkeit der Mikrosphären hängen der Durchfluß von Lösungen und der Druck für die Mineralöl-Fluss (Tabelle 2).
</li>
</ol>3. Durchführung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären zählt
<ol><li>Zur Quantifizierung der Hemocytometer nehmen Sie eine kleine Menge (ca. 100 μL) wässrige Lösung von Polyacrylamid Oligo-Mikrosphären und Platz auf der Glas-Hemocytometer, und füllen Sie sanft die Mikrosphären Suspension gut von der Zählkammer. Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Mikroskop und Hand Stückzähler Mikrosphären in einem Satz von 16 Quadrate zu zählen. Dann verschieben Sie die Hemocytometer zum nächsten Satz der Kammer und weitermachen Sie zählen, bis alle vier Sätze von 16 Ecken gezählt werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der durchschnittlichen Mikrosphären und berechnen Sie die Anzahl der Mikrosphären in der ursprünglichen Wulst-Suspension.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μL der Mikrosphären auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen des Überstands durch sanftes Zentrifugieren (400 X g) und pipettieren.</li>
</ol>4. Durchführung von DNA-Hybridisierung auf der Oberfläche der Polyacrylamid-Oligomicrosphere
Hinweis: Eine identische DNA-Sonde mit einer 5'-NH2-Gruppe statt 5'-Acrytide-Modifikation wird in Lösung ich hinzugefügt und für Ap-haltigen Mikrosphären parallel getestet. DNA-Hybridisierung Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Die Cy3 beschriftet ergänzende Oligonukleotid Sonden (GAP) Lösung sollte in einem dunklen Raum platziert werden.
<ol><li>Aufschwemmen Cy3-cAp mit 100 μl 1xTE-Puffer (TE-Puffer: 10 mM Tris und 1μM EDTA, pH 8,0) um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. Z. B. Aufschwemmen Sie 1 Pmol GAP in 100 mL TE-Puffer und Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch mit Aluminiumfolie abgedeckt. Hinweis: Für Strang-Sequenzen, siehe Tabelle 3.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μM Cy3-cAp zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Ap copolymerisiert Mikrosphären.</li>
	<li>Tippen Sie auf das Rohr ein paar Mal zu mischen und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 h.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und verbleibende Puffer durch Pipettieren zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie drei Mal mit 500 μl TE-Puffer.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Mikrosphären durch leichtes Klopfen Microcentrifuge Schlauch. Wiederholen Sie Schritt 4.4.</li>
	<li>Die Objektträger (75 x 50 mm) und die Abdeckung mit Alu-Folie vor Bildgebung Mikrosphären aufsetzen.</li>
</ol>(5) asymmetrische PCR zur Verstärkung ssDNA
<ol><li>Bereiten Sie eine asymmetrische PCR-Reagenz-Mischung zur Verstärkung SsDNA analysiert werden. Die Reagenzien in Tabelle 4 auf Eis auftauen. Halten Sie nicht das Enzym Taq Polymerase (50 U/µL) auf dem Eis, sondern eher speichern sie bei-20 ° C bis benötigt.</li>
	<li>Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.</li>
	<li>Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 4.
</li>
	<li>Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten</li>
</ol>6. Mikrosphären-PCR zur Verstärkung ssDNA
Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll zur Verstärkung SsDNA in einer PCR-Reaktion-Röhre. Mikrosphären-PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die detaillierte Sequenzen verwendet, um SsDNA verstärken sind in Tabelle 5aufgeführt. In diesem Fall kann Ap auf der Oberfläche der Mikrosphären an zufälligen DNA Vorlagen ergänzend Tempern. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt für die Herstellung von komplementären DNA-Stränge (antisense DNA-Strang, Abbildung 3). Die DNA erweitert dient als Kopiervorlage für Mikrosphären-PCR Verstärkung.
<ol><li>Bereiten Sie Mikrosphären-PCR-Reagenz Mixes. Die Reagenzien in Tabelle 6 auf Eis auftauen; Denken Sie jedoch nicht das Taq Polymerase Enzym auf Eis. Bewahren Sie es bei-20 ° C bis benötigt.</li>
	<li>Sanft Wirbel alle Reagenzien und dann kurz Zentrifugieren Rohre bei 10.000 x g für 10 s.</li>
	<li>Erhalten Sie ca. ~ 25 Mikrosphären durch mikroskopische zählen. Hinweis: Die Anzahl der Mikrosphären in einem Reaktionsgefäß werden mit einem Lichtmikroskop mit 40 X Vergrößerung berechnet. Etwa 25 ~ Mikrosphären werden Mikrosphären-PCR Verstärkung. Detailliertere Informationen sind in Schritt 3.</li>
	<li>Alle Reagenzien zu kombinieren, wie in beschrieben Tabelle 6.
</li>
	<li>Proben in einem Thermocycler und beginnen die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen: 25 Zyklen (95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s), 85 ° C für 5 min bei 4 ° c zu halten</li>
	<li>Folgende Verstärkung 8 μl 6 x Ladepuffer hinzufügen und laden 15 μl jeder Probe in 2 % Agarose-Gel. Führen Sie dann die Elektrophorese bei 100 V 35 min in 1 X TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris Acetat, 1 mM EDTA pH 8,2) Puffer.</li>
</ol>(7) konfokalen Mikroskopie Erwerb
Hinweis: Die Ergebnisse der Mikrosphären-DNA-Sonde Hybridisierung werden unter einem confocal Mikroskop abgebildet. Bildanalyse erfolgt mittels ImageJ.
<ol><li>Befestigen Sie hybridisierte Mikrosphären auf die Bühne des Mikroskops in einer Halterung.</li>
	<li>Wählen Sie den Laser (Helium/Neon Laser, 543 nm-Linie) und schalten Sie ihn ein in Lasersteuerung.</li>
	<li>Wählen Sie die Objektivlinse in Mikroskopkontrolle.</li>
	<li>Wählen Sie den gewünschten Filter für Cy3 und Kanal in Konfigurationskontrolle.</li>
	<li>Starten Sie das Experiment zu und beobachten Sie die Probe. Einstellungen für das konfokale Mikroskop sind in Tabelle 7zusammengefasst.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Verunreinigungen der DsDNA sind ein wichtiges Thema in SsDNA Verstärkung. Es bleibt schwierig, DsDNA Verstärkung in herkömmlichen asymmetrischen PCR Verstärkung15zu minimieren. Obwohl technische Verbesserungen für die Erzeugung von SsDNA uns zur Steigerung der Effizienz der Probendurchsatz aktiviert haben, ist darüber hinaus SsDNA Isolation aufgrund seiner hohen Kosten und unvollständige Reinigung Erträge nach wie vor problematisch.
Asymmetrische PCR ist eine der anspru...

Einzelsträngiger DNA (SsDNA) wurde ausgiebig als molekulare Erkennung Element (MRE) aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften für DNA-DNA Hybridisierung1,2berücksichtigt. Die Entwicklung von SsDNA synthetischer Systeme führt zu biologischen Anwendungen wie DNA-Microarrays3, Oligotherapeutics, Diagnostik und integrierte molekulare Erkennung basiert auf komplementäre Interaktionen4,5.
Bisher wurden erfolgreich Mikrometer-Skala Polymerpartikel mit mikrofluidischen Geräten demonstriert. Verschiedene Techniken der mikrofluidischen nachweislich um zu mächtig für die Herstellung von sehr homogene Mikrosphären auf kontinuierlichen Flow in der Microchannel Umwelt6,7.
In der Studie von Lee Et al. 8, eine Tröpfchen-basierte Mikrofluidik Plattform für Mikrofluidik-Synthese von copolymerizable Oligo-Mikrosphären und SsDNA Verstärkung wurde berichtet. Die mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei PDMS (Polydimethylsiloxan) Schichten: einem oberen Teil mit einem Mikrofluidik-Channel-Netzwerk zur Erzeugung von Mikrosphären und einem unteren flachen Teil. Diese bestehen aus drei Arten von PDMS fluidische Kanäle: 1) einen Fluss mit Schwerpunkt Kanal für Tröpfchen Generation, (2) eine serpentine Kanal für das Mischen von zwei Lösungen und (3) eine sequenzielle Polymerisation Kanal für Mikrosphären Erstarrung. Sobald zwei nicht mischbare fließt in einen einzigen PDMS fluidische Kanal eingeführt werden, können die Ströme durch die schmale Öffnung Struktur erzwungen werden. Die Strömung Verhaltensweisen wie Kanalgeometrie, Durchfluss und Viskosität beeinflussen die Größe und Morphologie der Mikrosphären. Daher kann Microscale Monospheres9,10der Hauptstrom flüssigen unterteilt werden.
Hier ist eine detaillierte Mikrosphären-PCR-Protokoll für die Verstärkung der SsDNA zur Verfügung gestellt. Zunächst wird ein Droplet-basierte Mikrofluidik-Gerät-Design-Prozess beschrieben. Dann wird die Art und Weise, in welcher, die Polyacrylamid Mikrosphären mit zufälligen DNA Schablone komplementär funktionalisiert werden können, erklärt. Schließlich ist ein Mikrosphären-PCR-Protokoll zur Verstärkung SsDNA gezeigt.

<table><tbody><tr><td>flüssiges Polydimethylsiloxan, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Bestandteile des Chips</td></tr><tr><td>40% Acrylamid:bis-Lösung (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Bestandteile aus copolymerisierbarer Oligo-Mikrosphäre</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Härter aus Acrylamid:bis-Lösung</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Katalysator von Ammoniumpersulfat</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabelle 1. Lösung III. Bestandteil von Mikrosphärenreagenzien</td></tr><tr><td>Cy3-markierte komplementäre Oligonukleotidsonden</td><td>Bioneer</td><td>synthetisierte</td><td>Tabelle 3. Informationen zur Sequenz&nbsp;</td></tr><tr><td>ssDNA-Acrydit-markierte Sonde</td><td>Bioneer</td><td>synthetisierte</td><td>Tabelle 1. Lösung I. Bestandteil der Mikrosphärenreagenzien</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>Bestandteile des TE-Puffers, pH-Pufferlösung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Bestandteile des TE-Puffers, Entfernung von Ionen (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>ssDNA-Amplifikation</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identifizierung der Oligonukleotid-Exposition von Mikrosphären-Oberflächenlichtmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Berechnung der Anzahl von Mikrosphären</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>ssDNA-Amplifikation</td></tr><tr><td>Handheld Corona Treater</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Labor Corona Treater</td><td>Hydrophile Oberflächenbehandlung</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>As eine</td><td>HI-1000</td><td>Heizplatte zum Aushärten von flüssigem PDMS</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Gleichmäßiger Fluss von Lösung I und Lösung II</td></tr><tr><td></td><td>Kompressor Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Durchflussregelung von Lösung III</td></tr><tr><td>Bright-Line Hämazytometer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Berechnung der Anzahl von Mikrosphären</td></tr></tbody></table>

ein tröpfchen mikrofluidischen ansatz und mikrosphären-pcr verstärkung für single-stranded dna-amplifikate

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Tröpfchen-basierte Mikrofluidik ermöglichen die zuverlässige Herstellung von homogenen Mikrosphären in den mikrofluidischen Kanal, Bereitstellung von kontrollierten Größe und Morphologie der erhaltenen Mikrosphären. Eine Mikrosphären copolymerisiert mit einer Acrydite-DNA-Sonde wurde erfolgreich hergestellt. Verschiedene Methoden wie asymmetrische PCR Exonuclease Verdauung und Isolation auf magnetische Beads Streptavidin beschichteten einsetzbar, einzelsträngiger DNA (SsDNA) zu synthetisieren. Jedoch verwenden nicht diese Methoden effizient große Mengen an hochgereinigtes SsDNA. Hier beschreiben wir eine Mikrosphären-PCR-Protokoll Details wie SsDNA effizient verstärkt und einfach durch Pipettieren von einer PCR-Reaktion-Röhre von DsDNA getrennt werden kann. Die Verstärkung der SsDNA kann als potenzielle Reagenzien für die DNA-Microarray und DNA-SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Prozesse angewendet werden.

Die vorgefertigten Polymeren Droplet-basierte mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei Schichten in PDMS (Abbildung 1a). Drei Arten von mikrofluidischen Channel-Netzwerke sind für die Erzeugung von Mikrosphären verwendet: (1) Flow-mit Schwerpunkt Geometrie wie in Abbildung 1 b, 2) eine serpentine Kanal für mixing-Lösung I und Lösung II und (3) eine Polymerisation Kanal für Mikrosphären gezeigt Erstarrung. Die Höhe aller Kanäle...

Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in der kombinatorischen Technik des mikrofluidischen Systems und des molekularen Biotechnologie-Feldes zu beantworten, wie mikrofluidische Geräte und Asymmetrie-PCR-Methode. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die effiziente Erzeugung hochhomogenisierter Mikrosphären und die Herstellung von einsträngiger DNA ohne zusätzliche Trennschritte. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose oder Therapie verschiedener Krankheiten.Da die Generierung von einsträngiger DNA der Schlüssel für ap-ta-mo-sis-Assays ist, kann sie für die Detektion und Behandlung verwendet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in dreidimensionale mikrofluidische Systeme in MEMS bieten kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die zur Erkennung und Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, Flüssigkeiten richtig zu kontrollieren, die in umgekehrter Richtung fließen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Mikrosphärenbildung in der strömungsfokussierenden Geometrie und Erstarrung erzeugter Mikrosphären zu beobachte

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Droplet-based mikrofluidischen Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für einen hohen Durchsatz Experimente, da sie in der Lage, Picoliter, Selbst-compartmentalized Schiffe kostengünstig erzeugen bei kHz Preise sind. Durch die Integration mit schnellen, empfindlichen und hoch aufgelöste Fluoreszenz-spektroskopischen Methoden kann die große Mengen von Informationen in diesen Systemen erzeugt effizient extrahiert werden können, genutzt und verwertet werden.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Dieses Video beschreibt die Technik zur Amplifikation einzelsträngiger DNA unter Verwendung von Oligonukleotid-beschichteten Polymer-Mikrosphären in einer Einzelrohrreaktion. Bei diesem Verfahren entsteht reine einzelsträngige DNA, die für die DNA-Sequenzierung und Microarray-Analyse weiterverwendet werden kann.

Mikrosphären-Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einzelsträngiger DNA

Dieses Video demonstriert die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktionstechnik zur gleichzeitigen Quantifizierung von methylierten DNA-Regionen in verschiedenen Populationen weißer Blutkörperchen als frühen Biomarker für die klinische Diagnose und Prognose.

Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Dieses Video demonstriert die Nützlichkeit der digitalen PCR in einem Chip-in-a-Tube-Format für den Nachweis von Einzelnukleotidvariationen in DNA-Proben. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in Kammern aufgeteilt, die als unabhängige PCR-Reaktionen fungieren, und die Detektion von Fluoreszenzsignalen von den amplifizierten Zielen in den Kammern wird verwendet, um die Häufigkeit des varianten Allels in der Probe zu berechnen.

Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Einzellige Sequenzierung zeigt genotypischen Heterogenität in biologischen Systemen, aber aktuelle Technologien fehlen des Durchsatzes für die Tiefe Profilierung der Zusammensetzung und Funktion notwendig. Hier beschreiben wir einen mikrofluidischen Workflow für die Sequenzierung &gt; 50.000 einzellige Genome aus verschiedenen Zell-Populationen.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Wasser-in-Öl-Tröpfchen-Assays sind nützlich für die analytische Chemie, die Enzymevolution und die Einzelzellanalyse, erfordern jedoch typischerweise Mikrofluidik, um die Tröpfchen zu bilden. Hier beschreiben wir die Partikel-Template-Emulgierung, einen mikrofluidikfreien Ansatz zur Durchführung von Tröpfchenassays.

Partikel-Template-Emulgierung ermöglicht mikrofluidsäurefreie Tröpfchen-Assays

Erfahren Sie die Herstellung von Mikrosphären-PCR-Amplifikaten in mikrofluidischen Tröpfchensystemen mit Polyacrylamid-Mikrosphären. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion einzelsträngiger DNA ohne zusätzliche Trennschritte für diagnostische Anwendungen.

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Weitere Videos entdecken