Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in der kombinatorischen Technik des mikrofluidischen Systems und des molekularen Biotechnologie-Feldes zu beantworten, wie mikrofluidische Geräte und Asymmetrie-PCR-Methode. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die effiziente Erzeugung hochhomogenisierter Mikrosphären und die Herstellung von einsträngiger DNA ohne zusätzliche Trennschritte. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose oder Therapie verschiedener Krankheiten.

Da die Generierung von einsträngiger DNA der Schlüssel für ap-ta-mo-sis-Assays ist, kann sie für die Detektion und Behandlung verwendet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in dreidimensionale mikrofluidische Systeme in MEMS bieten kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die zur Erkennung und Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, Flüssigkeiten richtig zu kontrollieren, die in umgekehrter Richtung fließen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Mikrosphärenbildung in der strömungsfokussierenden Geometrie und Erstarrung erzeugter Mikrosphären zu beobachten. Bereiten Sie zunächst 20 Milliliter flüssiges PDMS-Vorpolymer vor, indem Sie Basispolymer und Katalysator im Verhältnis von 10 zu 1 mischen. Gießen Sie 10 Milliliter des flüssigen PDMS auf eine vorbereitete SU-8-Form auf einen Siliziumwafer für den oberen Teil des mikrofluidischen Netzwerks.

Für das untere flache Teil das gleiche Volumen an flüssigem PDMS auf den Siliziumwafer ohne Formstruktur gießen. Zwei mit flüssigem PDMS-Vorpolymer beschichtete Siliziumwafer auf eine vorgeheizte Kochplatte legen und 30 Minuten bei 75 Grad Celsius aushärten. Anschließend die ausgehärtete PDMS-Schicht manuell aus der SU-8-Form abziehen.

Richten Sie ein rundes Loch-Stanzwerkzeug mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern an den Ölanschluss im replizierten mikrofluidischen Netzwerk aus, um Mikron-Flow-Kanäle mit den Makrofluidproben zu vernetzen. Dann das Durchgangsloch manuell ausstechen. Nachdem Sie den Stanzvorgang dreimal wiederholt haben, führen Sie eine hydrophile Oberflächenbehandlung sowohl auf der oberen als auch auf der unteren PDMS-Schicht mit einem Handkoron-Behandlungsmittel für mehrere Sekunden pro Probe durch.

Stapeln Sie zwei plasmabehandelte PDMS-Schichten und erhitzen Sie bei 90 Grad Celsius 30 Minuten lang auf einer Kochplatte für den PDMS-zu-PDMS-Bindungsprozess. Wirbel und kurz Zentrifugieren eine Standard-Einsträngig-DNA-Acrydite-markierte Sonde und eine 19-zu-eins-Acrylamid-Bis-Stammlösung. Bereiten Sie Lösung eins durch Mischen von 25 Mikroliter 40%Acrylamid bis Lösung, 10 Mikroliter einsträngige DNA, 10 Mikroliter 5X TBE Puffer, und fünf Mikroliter Wasser.

Bereiten Sie Lösung zwei mit 50 Mikroliter 20%Ammoniumpersulfat vor. Bereiten Sie zwei Spritzen individuell mit Lösung eins und Lösung zwei und montieren Sie sie auf die Spritzenpumpe, um Lösungsströme in die mikrofluidische Plattform einzuführen. Bereiten Sie Mineralöl gemischt mit 0,4%TEMED für die Oberflächenerstarrung der Mikrosphäre vor.

Nach dem Befüllen einer Glasflasche mit dem Mineralöl zwei Schläuche in die pneumatischen und flüssigen Anschlüsse in die Kappe der Glasflasche als mikrofluidisches Reservoir einlegen. Verbinden Sie Rohre zwischen der Glasflasche und dem Ölanschluss im mikrofluidischen Gerät. Schließen Sie die Rohre an die beiden Lösungsöffnungen im mikrofluidischen Gerät an, um die beiden Lösungen von den Spritzenpumpen zu liefern.

Legen Sie dann die Rohre in den Auslassanschluss ein, um die erzeugte Mikrosphäre in das Becherglas zu übertragen. Legen Sie als Nächstes den Durchfluss der Spritzenpumpe auf 0,4 bis 0,7 Milliliter pro Stunde fest. Stellen Sie den Druck des Kompressors mit einem Regler ein.

Legen Sie einen Glasbecher mit magnetischem Rührbalken auf eine Kochplatte und stellen Sie die Drehzahl ein. Betreiben Sie die Spritzenpumpe und liefern Sie die von einem externen Kompressor erzeugte Druckluft über die Ein-Aus-Steuerung eines elektromagnetischen Ventils in die Glasflasche. Beobachten Sie mit einem digitalen Mikroskop die Bildung von Mikrosphären in der Strömungsfokussierungsgeometrie und die Erstarrung erzeugter Mikrosphären im Glasbecher.

Die Beobachtung der Bildung von Mikrosphären ist einer der kritischsten Schritte, da es ein wichtiger Prozess in dieser Studie ist, Mikrosphären und mikrofluidisches System zu produzieren. Anschließend werden 100 Mikroliter der Mikrosphären in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Dann entfernen Sie den Überstand durch sanftezentrifugieren und Pipettieren.

Setzen Sie das kostenlose sondenmodifizierte Cyanin-3 mit 100 Mikrolitern 1X TE Puffer wieder auf, um eine Endkonzentration von 100 Mikromolaren zu erreichen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikromolar komplementärs sondenmodifiziertes Cyanin-3 zu einem sterilen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr hinzu, das AP-copolymerisierte Mikrosphären enthält. Tippen Sie ein paar Mal auf die Röhre, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln zu mischen und zu brüten.

Entsorgen Sie nach der Inkubation den Überstand und entfernen Sie den Restpuffer durch Pipettieren. Dann spülen Sie dreimal mit 500 Mikroliter TE Puffer. Platzieren Sie die Mikrosphären vor der Bildgebung auf einem 75 mal 50 Millimeter großen Glasschlitten und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab.

Erhalten Sie etwa 25 Mikrosphären durch mikroskopische Zählung mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher Vergrößerung. Kombinieren Sie anschließend alle Reagenzien, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die Proben in einen Thermocycler und starten Sie die asymmetrische PCR unter den entsprechenden Bedingungen.

Die Sammlung eines Überstandes nach asymmetrischer PCR ist einer der kritischsten Schritte, da es sich um einen wichtigen Prozess zur Erzeugung von einsträngiger DNA mit Mikrosphäre handelt. Fügen Sie nach der Verstärkung acht Mikroliter 6X Ladepuffer zu jeder Probe hinzu. 15 Mikroliter jeder Probe in 2%Agarose-Gel laden.

Dann Elektrophorese bei 100 Volt für 35 Minuten in 1x TAE Puffer durchführen. Legen Sie die hybridisierten Mikrosphären in einen Halter und befestigen Sie den Halter an der Stufe eines konfokalen Mikroskops. Wählen Sie den Laser aus und schalten Sie ihn in der Lasersteuerung ein.

Wählen Sie die Objektivlinse in der Mikroskopsteuerung aus. Wählen Sie dann den gewünschten Filter für Cyanin-3 und Kanal in der Konfigurationssteuerung aus. Beginnen Sie schließlich mit dem Experiment und beobachten Sie die Probe.

Die hergestellte mikrofluidische Plattform auf Tropfenbasis besteht aus zwei PDMS-Schichten. Drei Arten von mikrofluidischen Kanalnetzen werden zur Erzeugung von Mikrosphären verwendet, die strömungsfokussierende Geometrie, ein Serpentinkanal zum Mischen von Lösungen eins und zwei und ein Polymerisationskanal für die Mikrosphärenerprossierung sind. Zur Erzeugung von Mikrosphären in der mikrofluidischen Plattform wurden ein laborbasiertes pneumatisches Steuerungssystem für den kontinuierlichen Durchfluss des Mineralöls und zwei Spritzenpumpen für den Lösungsfluss eingesetzt.

Wenn die Mikrosphären mit der Fünf-Ur-Akrydite-DNA-Sonde korrekt funktionalisiert sind, sollten sie während des Hybridisierungsexperiments zu einer Abdeckung der fluoreszierenden Aktivität auf der Oberfläche führen, wie in diesen fluoreszierenden Bildern gezeigt. Wenn die Copolymerisation nicht korrekt auftritt, würde das optische Mikrosphärenbild eine interne Kontamination innerhalb der Mikrosphären aufweisen. Die Manipulation der 3D-Oberfläche von Mikrosphären mit einer DNA-Oligosonde ist ein viel schnellerer Prozess und eine On-Flow-Mikrosphären-Syntheseplattform kann ein Werkzeug für die einsträngige DNA-Verstärkung und -Reinigung bieten.

Der ursprünglich copolymerisierte Fünf-Prim-AP bietet ein Drei-Prim-Hydroxylende für die DNA-Polymerisation nach dem Glühen zu seiner komplementären Schablone. Im asymmetrischen PCR-Experiment wurden doppelsträngige DNA-Kontaminanten beobachtet. Die daraus resultierende einsträngige DNA, die sich aus der MikrosphärePCR angesammelt hat, wurde durch Vergleich der synthetischen Größenmarker durch Gelelektrophoreseanalyse nachgewiesen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Vorkenntnisse über Protokolle und Anpassungen, die häufig für die Optimierung von PCR-Experimenten erforderlich sind, um den Amplifikationszyklus, die Glühtemperatur und die Sondensequenz bei dieser Methode zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Diagnostik und Therapie, um zwei Regionen der Molekularbiotechnologie und Biomedizin miteinander zu verbinden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid-Lösung gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Labormänteln sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.