Name: RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-RNAi-Screening zur Identifizierung von Wirtsfaktoren bei Vaccinia-Virus-Infektionen mit Drosophila-Zellen. Diese Methode nutzt Immunfluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIAID (R01AI074951, U54AI057168) und der Penn Genome Frontiers Institut SC unterstützt; von NIH T32HG000046 zu TSM; von NIH T32GM07229 und T32AI007324 zu LRS.

Teil 1: RNAi in 384 Well Platten <ol><li> Standardisierung der Reagenzien für das Screening verwendet unerlässlich. Wir testen einzelne Lose von Schneider Medien, Rinderfötenserum und Färbereagenzien. Dann haben wir Aliquot und verwenden die gleiche Menge für den gesamten Bildschirm. </li><li> Für jeden Test wird es am besten, verschiedene Zelllinien zu bestimmen, welche ist am wirkungsvollsten zu Ihrem biologischen read-out-Test. Wir verwenden in der Regel die S2-DRSC Linie. </li><li> Wachsen Drosophila-Zellen bei 25 ° C in völliger Schneider Medien. <ol class="lalpha"><li> Schneider Medien </li><li> 10% hitzeinaktiviertem FBS </li><li> 1X L-Glutamin </li><li> 1X Pen / Strep Antibiotika </li></ol></li><li> Drosophila-Zellen sind semi-Anhänger und sind ohne Trypsinierung passagiert alle vier Tage mit einer Pipette die Zellen aus dem Fläschchen und Verdünnen der Zellen 1.10 in eine frische Flasche. Die Zellen sind in Log-Phase für Experimente sein. </li><li> Plate-to-Plate-und Tag-zu-Tag Variabilität durch den Einsatz von automatisierten Liquid-Handling für alle flüssigen Zusätze zu Multi-Well-Platten minimiert. Wir verwenden eine WellMate (Matrix). </li><li> Bereiten WellMate Schlauch. <ol class="lalpha"><li> Sprayhood und WellMate mit 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Schläuche aus der Verpackung und Spray mit 70% Ethanol. </li><li> Das Rohr Kassette in Abgabeposition auf dem WellMate. </li><li> Prime Tubing mit 25 ml 70% Ethanol. </li><li> Sterilisieren Schlauch in Ethanol für 15 Minuten, dann grundieren mit weiteren 25 ml Ethanol. </li><li> Spülen Schlauch durch Grundierung mit 50 ml sterilem PBS. </li></ol></li><li> Verdrängen Zellen aus Kolben und zählen. Pellet-Zellen so, dass Sie 25% mehr als nötig (300xg, 5 min). Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung ausgesät muss nach Assay Länge optimiert werden. Bei der Durchführung von automatisierten Bildanalyse, ist eine einzige Monolage ohne Zelle Verklumpung ideal für Bildsegmentierung. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in serum-freien Schneider Medien 1.7x10 6 Zellen / ml. </li><li> Wir führen den Bildschirm in 384-Well-Platten mit einem kommerziell erhältlichen Bibliothek von dsRNA in einer Konzentration von 250ng/well pre-aliquotiert. Mehrere Brunnen jeder Platte sind leer für die Kontrollen, die manuell hinzugefügt wurden. Wir verwenden dsRNA Luciferase als negative Kontrolle. Wir verwenden dsRNA gegen Thread (DIAP) als Kontrolle für robuste RNAi. Knock down dieses anti-apoptotischen Faktor ergibt sich in dramatischen Zelltod und ist eine schnelle visuelle Weg, um die Qualität der knock down beurteilen. Schließlich verwenden wir eine dsRNA gegen das virale Reporter, in diesem Fall beta-Galactosidase, als positive Kontrolle, um zu überprüfen, dass wir Virusinfektion mit unserem Test Auslesen zu verhindern. Wenn Spotting dsRNA in Platte zum Zeitpunkt der Zellaussaat, Aliquot 1 ul dsRNA in die Ecke des Brunnens, um eine einfachere Visualisierung zu ermöglichen, dann Zentrifuge dsRNA auf Boden gut (300xg, 1 min) vor der Zugabe Zellen. </li><li> Verwenden Sie WellMate bis 10 ul Zellen über jeweils gut vorbereitet hinzuzufügen. </li><li> Spin-Zellen auf Platten durch Zentrifugieren 300xg, 1 min. </li><li> Inkubieren in 25 ° C Inkubator für 45 Minuten. </li><li> Add 20 uL komplette Schneider Medien-und Zentrifuge 300xg, 1 min. </li><li> Legen Platten in feuchter Tupperware Behälter ausgekleidet mit Wasser getränkten Papiertüchern. Das Volumen einer 384-Well ist klein, und so, Verdunstung kann große Auswirkungen auf die Biologie, die wiederum zu artifactual Veränderungen in der read-outs der Kante Brunnen führen können. Um dies zu überwinden, sollten Platten unter hoher Luftfeuchtigkeit gehalten werden. </li><li> Inkubieren für drei Tage bis zur robusten knockdown ermöglichen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Medien ändern, oder öffnen Sie befeuchteten Behälter während dieser Zeit. </li></ol> Teil 2: Infektion mit Vaccinia Virus <ol><li> Sterilisieren Multi-Channel-Aspirator in Quatricide für 15 Minuten, dann in 70% Ethanol spülen. </li><li> Bereiten WellMate wie oben beschrieben. </li><li> Bereiten Schneider Medien mit 2% FBS für eine Infektion durch Verdünnen komplette Medien 1:5 in serumfreien Medien. </li><li> Filter Rohöl Virus Lager bis 0,8 um Spritzenfilter um Zelltrümmer zu entfernen oder gereinigte Virus. </li><li> Verdünnen Vaccinia-Virus in 2% Serum Schneider Medien Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 erhalten. </li><li> Entfernen PBS aus WellMate Schlauch, Grundanstrich mit verdünnten Virus bis der Schlauch frei von Luftblasen. </li><li> Gebrauch sterilisiert Multi-Channel-Aspirator und Vakuumkammer zu entfernen sanft Medien von den Platten der dsRNA behandelten Drosophila-Zellen. </li><li> Dispense 30 ul Virus pro Well auf Platten mit dem WellMate. </li><li> Centrifuge Platten 1 Minute bei 300xg. </li><li> Sterilisieren WellMate Schlauch. Prime mit 25 ml 10% Bleach 10 Minuten warten, Grundanstrich mit weiteren 25 mL 10% Bleichmittel. </li><li> Prime Schläuche mit 50 ml Wasser, gefolgt von 50 ml 70% Ethanol. Zurück Schlauch an der Verpackung. </li><li> Zurück Platten befeuchtet Tupperware Behälter. Inkubation bei 25 ° C für 48 Stunden. </li></ol> Teil 3: Färbung Plates <ol><li> Fix Platten in 15 ul 4% Formaldehyd / PBS für 10 Minuten. Die Flüssigkeit wird entfernt mit einem Multi-Channel-Aspirator und Vakuumkammer bei jedem Schritt. Sobald Platten wurden behoben, sterile Geräte und Reagenzien sind nicht mehr notwendig. </li><li> Entfernen Sie fix und verwenden WellMate zu 30 ul PBST (PBS + 0,1% Triton-X) hinzu. Inkubieren 10 Minuten und wiederholen. Operate WellMate wie oben beschrieben, außer Schlauch muss nicht sterilisiert werden. </li><li> Zum Nachweis von Vaccinia-Infektion verwenden wir ein β-Galactosidase-Reporter von einem frühen / späten Vaccinia-Promotor angetrieben. </li><li> Nehmen Sie Flüssigkeit und inkubieren Zellen in Block (PBST mit 2% BSA) für 10 Minuten. </li><li> Verdünnen primärer Antikörper in Block, flüssiges und fügen 15 ul Antikörper in jede Vertiefung mit einem Multi-Channel wiederholen Pipette (Matrix). </li><li> Spin down-Platten (300xg, 1 min), mit einem klaren Aufkleber decken und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Entfernen primärer Antikörper, und verwenden Sie die WellMate, um Brunnen in PBST 3 mal, jeweils 10 Minuten abwaschen. </li><li> Verdünnen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (FITC) und Kernfärbung in Block und fügen Sie 15 ul in die Vertiefungen mit einer Multi-Channel wiederholen Pipette. </li><li> Die Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. </li><li> Wash Brunnen in PBST 3 mal, jeweils 10 Minuten mit dem WellMate. </li><li> Seal Platte mit klaren Aufkleber, Abdeckung, und lagern bei 4 ° C bis zu drei Wochen. </li></ol> Teil 4: Imaging and Image Analysis <ol><li> Verwenden Sie ein automatisiertes Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung auf Bild-Platten. </li><li> Machen Sie Bilder von insgesamt Kerne (DAPI) und infizierte Zellen (FITC). Optimieren Belichtungszeit für jeden Kanal individuell um Dynamikbereich zu maximieren. </li><li> Feinabstimmung der automatischen Fokus-Funktion, indem sie Z-Stapel von Bildern, Abstand 1um auseinander, dass die Flugzeuge span oberhalb und unterhalb der erwarteten Fokusebene. Sobald die optimale Fokusebene befindet, passen Autofokus-Einstellungen entsprechend an. </li><li> Bild die gesamte Platte, die Erfassung von mindestens drei Bildern pro Vertiefung sowohl in der Hoechst-Kanal (DAPI) und das Virus Kanal (FITC). Wählen Sie Websites aus verschiedenen Regionen innerhalb eines gut um Bilder, die gut vertreten als Ganzes zu erfassen. </li><li> Verwenden Sie MetaXpress Software, um eine Zeitschrift zu segmentieren schreiben Sie das Image und die Verwendung Count Kerne Module, um die Gesamtzahl der Zellen positiv für die Kernfärbung (insgesamt Zellen) und Infektionen (FITC) für jede Platte zu berechnen. </li><li> Berechnen Prozent Infektion (100 * FITC positive / insgesamt Zellen) und log zu verwandeln. </li><li> Zur Identifizierung Kandidaten, die wir verwenden eine robuste Z berechnet sich aus dem Median und Quartilsabstand jeder Platte basiert. Diese Methode ist unempfindlich gegenüber Ausreißern und unsymmetrischen Daten, und sorgt so für mehr Leistung bei der Identifizierung auch schwacher oder mäßiger hits 10. Für jede Platte ist der Median aus den Log-transformierten Daten subtrahiert. Dann werden die so ermittelten Werte werden um 0,74 fachen Quartilsabstand (die Differenz zwischen den Werten der 75-Perzentil und das 25-Perzentil) unterteilt. Die 0,74-Faktor ist die Angleichung einer Standard-Normalverteilung verwendet. </li><li> Die robuste Z-Score ist ein Maß für die Entfernung in Standardabweichungen vom Mittelwert der Platte. Zum Beispiel zeigt eine robuste Z-Score von 2% der Infektion der gut ist ~ 2 Standardabweichungen von der Platte Median-oder p &lt;0,05. </li><li> Analysieren Zellzahl auf zytotoxische Kandidaten zu identifizieren. Berechnen Sie die robuste Z-Scores der Kernenergie zählt. Kandidaten mit einem robusten Z &lt;-2 in doppelte Bildschirme gelten als zytotoxisch. </li><li> Wells, die eine robuste Z-Scores für die Prozent-Infektion von&gt; 2 oder &lt;-2 in doppelte Bildschirme (p &lt;0,0025) haben, ohne Zytotoxizität gelten als potenzielle Kandidaten aus dem primären Bildschirm. </li><li> Positive Kandidaten werden validiert durch unabhängige Reagenzien. dsRNAs gegen die Gene von Interesse aus einer anderen Region der mRNA generiert und getestet, wie oben. </li><li> Die Gene für die zwei unabhängigen dsRNAs haben die gleiche Phänotyp kann für weitere Untersuchungen in Betracht gezogen werden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Bilder und Interpretation der Infektionsraten <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Infizierte Brunnen zeigen keine Färbung für Vaccinia-Virus-Proteine, während ein Vertreter infiziert und enthält Zellen Färbung für Vaccinia-Ausdruck beta-Galaktosidase (&amp;bgr; Gal)-Protein, wie Immunfluoreszenzmikroskopie gemessen positiv.Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Automatische Bildanalyse-Software quantifiziert Infektion in jedem Bild mit Hilfe von Parametern durch den Benutzer festgelegt. In einer repräsentativen Bildes sind die Gesamtzahl der Zellkerne und die Anzahl der Zellen, die Virus-Antigen auf Größe und die Intensität der Färbung über den lokalen Hintergrundfärbung gezählt. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Knockdown des Fadens (DIAP) dient als positive Kontrolle für robuste RNAi Depletion von Zielgenen. Knockdown dieser anti-apoptotischen Faktors führt zu dramatischen Zelltod. Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Knockdown Luciferase dient als negative Kontrolle für die Wirkung von doppelsträngigen RNA-Behandlung bei Infektion. Depletion von Luciferase hat keinen Einfluss auf Infektionen bezogen auf Zellen unbehandelt. Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Knockdown von &amp;bgr; Gal-Protein dient als positive Kontrolle für eine Verringerung der Infektion, da die Assay verwendet &amp;bgr; Gal-Protein-Spiegel als Auslesen der Infektion. Depletion von &amp;bgr; Gal führt zu einer Abnahme des Anteils der infizierten Zellen. Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Knockdown von zellulären Faktor Rab5 führt zu einer Abnahme des Anteils der infizierten Zellen. Da Rab5 ist bekannt, dass in der Endozytose beteiligt, dieser Faktor trägt wahrscheinlich zur Vaccinia-Virus-Eintrag. Dies stellt ein Beispiel Ausreißer aus dem Bildschirm. Virus = grün, Zellkerne = blau.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

Genomweiten RNAi-Screening in Drosophila bietet eine robuste und effiziente Methode für die Untersuchung der zellulären Komponente der Virusinfektion. Eine Reihe von Säugetieren infizieren Drosophila-Zellen, die verwendet werden, um Komponenten des Host intrinsische Immunantwort und Wirtsprotein Faktoren für die virale Replikation, dass neue therapeutische Targets darstellen kann erforderlich identifiziert werden können. Vor der Durchführung eines Bildschirms, muss der Test sorgfältig Zelltyp, Zellzahl und Befall optimiert werden, und muss gut kontrolliert werden, die sowohl positive als auch negative virale und zelluläre Angriffspunkte 11. Es ist wichtig, um eine ausreichende Trennung zwischen positiven und negativen Kontrollen vor dem Screening zu gewährleisten, um den Dynamikbereich des Tests zu maximieren. Sobald der Bildschirm durchgeführt wurde, können die Kandidaten in funktionale Kategorien eingeteilt werden, um festzustellen, welche Host-Mechanismen der Infektion beitragen. Für Säugetiere Viren wie Vaccinia, sollte der Beitrag von Säugetier-Homologe von RNAi als Teil der sekundären Analyse bestimmt werden. Zusammen genommen werden diese robusten Screening-Methoden ermöglichen es uns, Einblicke in komplexe Mechanismen, durch die Viren interagieren mit ihren Wirtszellen zu gewinnen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Zellkultur&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Medium</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Screening&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genomweite dsRNA-Bibliothek</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Platten, schwarz mit klarem Boden</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumverschlüsse</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>Klare Verschlüsse</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>24-Pin-Manifold</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageXpressMicro automatisiertes Mikroskop</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Bildanalyse-Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai screening für host beteiligten faktoren in vaccinia virus-infektion mit drosophila cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Virale Erreger stellen eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, nicht nur Viren verursachen Epidemien von Krankheiten, aber ihre mögliche Verwendung in Bioterrorismus ist auch ein Anliegen. Ein besseres Verständnis der zellulären Faktoren, die Auswirkungen Infektion wäre die Entwicklung von dringend benötigten Therapien zu erleichtern. Jüngste Fortschritte in der RNA-Interferenz (RNAi)-Technologie mit vollständiger Sequenzierung des Genoms von mehreren Organismen gekoppelt ist, um die Optimierung der genomweiten, zellbasierte loss-of-function-Bildschirme geführt. Drosophila-Zellen sind besonders zugänglich genomweite Bildschirme wegen der Benutzerfreundlichkeit und Effizienz von RNAi in diesem System 1. Wichtig ist, dass eine Vielzahl von Viren infizieren Drosophila-Zellen, darunter eine Reihe von Säugetier-Viren der medizinischen und landwirtschaftlichen Bedeutung 2,3,4. Vorherige RNAi-Screens in Drosophila haben Host-Faktoren, die für die verschiedenen Schritte in Virus-Infektion, einschließlich Ein-, Übersetzungs-und RNA-Replikation 5 erforderlich sind identifiziert. Darüber hinaus sind viele der zellulären Faktoren für die virale Replikation in Drosophila Zellkultur benötigt auch die Begrenzung in menschlichen Zellen mit diesen Viren 4,6,7,8, 9 infiziert. Daher stellt die Identifizierung von Host-Faktoren während der viralen Infektion kooptiert neue Targets für eine antivirale Therapie. Hier präsentieren wir eine verallgemeinerte Protokoll für ein High-throughput RNAi Bildschirm, um zelluläre Faktoren in Virusinfektion beteiligt sind, mit Vaccinia-Virus als ein Beispiel.

Novel Wirtsfaktoren in Virusinfektion beteiligt durch zell-basierte genomweite Verlust der Funktion RNAi-Screening identifiziert werden. A<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellkultur-Modell ist besonders zugänglich, diesen Ansatz durch die Leichtigkeit und Effizienz von RNAi. Hier zeigen wir diese Technik mit<em&gt; Vaccinia</em&gt; Virus als ein Beispiel.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Virale Pathogene stellen eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar; Viren können nicht nur natürliche Epidemien menschlicher Krankheiten verursachen, sondern ihr potenzieller Einsatz in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Hochdurchsatz-RNAi-Screening Wirtsfaktoren zu identifizieren, die an der Virusinfektion beteiligt sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gene von Interesse mittels RNAi in 384-Well-Platten ausgeschaltet werden. Anschließend werden die Zellen mit dem Virus von Interesse infiziert, auf virale Proteine gefärbt und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie auf Virusinfektion untersucht.Schließlich wird eine automatisierte Bildanalyse durchgeführt, um Kandidatengene für die Validierung und weitere Untersuchungen zu identifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen der Infektion durch Quantifizierung des Prozentsatzes infizierter Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Dies ermöglicht die Entdeckung neuartiger zellulärer Faktoren, die an der Virusinfektion beteiligt sind.Obwohl diese Methode Einblicke in Virus-Wirt-Interaktionen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf die Untersuchung beliebiger Systeme anwenden, bei denen ein visueller Nachweis des gewünschten zellulären Prozesses von Vorteil ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, sollten mit einer steilen Lernkurve rechnen, da die Erzielung reproduzierbarer Infektionen bei gleichzeitiger Minimierung der Variabilität einer erheblichen Optimierung bedarf. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen, ist es unerlässlich, für jeden Reagenzienansatz innerhalb eines gesamten Screenings eine einzige Chargennummer zu verwenden. Kultivieren Sie S2DRSC-Drosophila-Zellen in vollständigem Schneider-Medium bei 25 Grad Celsius; die Zellen sollten sich in der log-Phase befinden.Führen Sie Experimente in einer laminaren Luftströmungskabine durch, indem Sie die halbadhärenten Zellen durch kräftiges Pipettieren aus dem Kolben lösen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, überführen Sie 125 % der für das Experiment benötigten Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas und pelletieren Sie diese 5 Minuten bei 300 × g. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in serumfreiem Schneider-Medium mit einer Endkonzentration von 1,7 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Verwenden Sie ein sterilisiertes und geprimtes automatisiertes Flüssigkeitsmanagementsystem. Hier paaren sich die Matrix-Wellen, um die Plattenvariabilität zu minimieren. Geben Sie 10 µL Zellsuspension in jedes Well einer 384-Well-Platte, die zuvor mit 250 Nanogramm pro Well doppelsträngiger RNA beladen wurde. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 300 ×g für eine Minute auf die Platten.Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius für 45 Minuten. Geben Sie 20 Mikroliter vollständiges Schneider-Medium zu jedem Ansatz hinzu. Zentrifugieren Sie das Medium kurz bei 300 ×g für eine Minute, um die Auswirkungen der Verdunstung zu minimieren.Die Platten und befeuchtete, versiegelte Behälter, die mit mit Wasser getränkten Papiertüchern ausgelegt sind, lagern. Inkubieren Sie bei 25 Grad Celsius für drei Tage, um starke Knockdown-Effekte in einem BSL-2-Biosicherheitsschrank zu ermöglichen. Vor der Infektion der Zellen den rohen Vaccinia-Virusstamm durch einen 0,8-Mikron-Spritzenfilter filtrieren.Um zellulären Abfall zu entfernen. Verdünnen Sie das Virus in Schneiders Medium mit 2 % Serum, um eine Infektionsmultiplizität – abgekürzt MOI – von zwei Prime zu erhalten.Das sterilisierte Mehrfachkanal-Abzapfgerät mit verdünntem Virus befüllen, bis die Schläuche frei von Luftblasen sind. Mit einem sterilisierten Mehrfachkanal-Aspirator und Vakuummanifold vorsichtig das Medium von den Platten mit doppelsträngiger RNA behandelten Drosophila-Zellen entfernen. 30 Mikroliter verdünntes Virus in jede Platte abgeben.Zentrifugieren Sie die Platten gut bei 300 ×g für eine Minute. Stellen Sie die Platten zurück in den befeuchteten Behälter und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius für 48 Stunden. In einem BSL-2-Biosicherheitswerkbank saugen Sie das Medium von der Platte ab.Dann 15 µL 4 % Formaldehyd-Fixierungslösung mit einer Mehrkanalpipette zu jeder Platte hinzufügen. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Flüssigkeit mit einem Mehrkanal-Aspirator entfernen.Verwenden Sie das WELLMADE, um 30 µL PBST zu jedem hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Vertiefungen 10 Minuten bei Raumtemperatur. Führen Sie eine zweite PBST-Waschung für 10 Minuten auf die gleiche Weise durch.Entfernen Sie die Flüssigkeit nach dem Inkubationsblock und geben Sie 30 Mikroliter PBST mit 2 % VSA-Blockierungslösung hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanal-Wiederholungspipette jeweils 15 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung, hinzu.Zentrifugieren Sie die Platten 1 Minute bei 300 ×g. Versiegeln Sie jede Platte mit einer klaren Abdeckfolie und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen mithilfe des Well-Mate und eines Mehrkanal-Aspirators dreimal mit PBST, jeweils 10 Minuten pro Waschgang. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 15 µL fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper mit Kernfärbung zu jedem Well hinzuzufügen. Den Well mit Folie abdecken, um ihn vor Licht zu schützen, und die Platten eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen dreimal wie zuvor jeweils 10 Minuten mit PBST.Geben Sie 30 Mikroliter PBST zu den Zellen hinzu und versiegeln Sie mit einer klaren Abdeckfolie. Bedecken Sie die Platten mit Aluminiumfolie. Lagern Sie die versiegelten Platten bis zu drei Wochen bei vier Grad Celsius, bevor sie auf einem automatisierten Mikroskop abgebildet werden.Nicht infizierte Wells zeigen keine Färbung für Vaccinia-Virus-Proteine, während ein repräsentativer infizierter Well Zellen enthält. Färbung positiv für das von Vaccinia exprimierte Beta-GCSEs-Protein, gemessen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Eine automatisierte Bildanalyse-Software quantifiziert die Infektion in jedem Bild anhand benutzerdefinierter Parameter.In einem repräsentativen Bild werden die Gesamtanzahl der Zellkerne und die Anzahl der Zellen, die virales Antigen exprimieren, anhand der Größe und Intensität der Färbung über dem lokalen Hintergrund gezählt. Die Absenkung der Färbung von thread dient als positiver Kontrollversuch für eine effiziente RNAi-vermittelte Reduktion der Zielgene. Die Absenkung dieses anti-apoptotischen Faktors führt zu einem dramatischen Zelltod. Die Herabregulierung von Luciferase dient als negativer Kontrollversuch für den Effekt doppelsträngiger RNA-Behandlung auf die Infektion. Die Verminderung der Luciferase-Aktivität hat im Vergleich zu unbehandelten Zellen keinen Einfluss auf die Infektion. Die Herabregulierung des Beta-Galacto-Proteins dient als positive Kontrolle für eine Verringerung der Infektion.Da der Assay die Beta-Galacto-Proteinspiegel als Nachweis einer Infektion verwendet, führt eine Verringerung der Beta-Galacto-Spiegel zu einer Abnahme des Prozentsatzes infizierter Zellen. Die Herabregulierung des zellulären Faktors RAB5 führt zu einer Verringerung des Prozentsatzes infizierter Zellen. Da bekannt ist, dass RAB5 an der Endozytose beteiligt ist, trägt dieser Faktor vermutlich zum Eintritt des Vaccinia-Virus bei.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine RNAi-Screening-Methode in Drosophila anwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die zur Virusinfektion beitragen, einschließlich der Durchführung von RNAi, der Infektion mit Vaccinia-Virus, der Färbung, Bildgebung und Analyse von 384-Well-Platten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem DIA-Virus äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laborkitteln und Schutzbrillen stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Lebendes Virus darf nur in einem BSL-2-Biosicherheitswerkbank geöffnet werden, und alles, was mit lebendem Virus in Kontakt gekommen ist, muss vor der Entsorgung mit 10 %iger Bleiche sterilisiert werden.

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

RNA-Interferenz wurde als sehr effektiv erwiesen, um Genfunktionen in...

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

In diesem Video beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung einer Nanoinjektion eines einzelsträngigen RNA-Virus mit positivem Sinn in erwachsene männliche Drosophila-Fliegen und untersuchen anschließend die antiviralen Reaktionen, die aufgrund der Infektion ausgelöst wurden. Die Polymerase-Kettenreaktionsanalyse identifiziert die Hochregulierung spezifischer Gene in den infizierten Fliegen, die auf die Aktivierung von Immunantwortwegen hinweisen, einschließlich RNA-Interferenz und...

Intrathorakale virale Nano-Injektion zur Untersuchung von Wirt-Virus-Interaktionen bei erwachsenen Fliegen

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Dieses Protokoll beschreibt die Virusinfektion in Vivo in Drosophila Melanogaster mit dem Nano-Injektionsverfahren und Grundtechniken zu Virus-Wirt Interaktionen analysieren zu etablieren.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

Lernen Sie ein Hochdurchsatz-RNAi-Screening zur Identifizierung von Wirtsfaktoren bei Vaccinia-Virus-Infektionen mit Drosophila-Zellen. Diese Methode nutzt Immunfluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

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