Northern Blot zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer microRNA im Gesamt-RNA-Extrakt von Pflanzengewebe

MicroRNAs, miRNAs, sind kleine, einzelsträngige, nicht-kodierende RNAs. miRNA baut sich in einen Multiproteinkomplex ein und bindet weiter an komplementäre Ziel-mRNA-Sequenzen, um die Genexpression negativ zu regulieren.

Um spezifische miRNA aus der Gesamt-RNA aus Pflanzengeweben nachzuweisen, fügen Sie einen Gel-Loading-Farbstoff hinzu, der Tracking-Farbstoffe und Formamid – ein RNA-Denaturierungsmittel – enthält. Erhitzen Sie die Probe, um die RNA zu denaturieren und die Bildung von Sekundärstrukturen vor der Elektrophorese zu verhindern.

Laden Sie die Probe und die Standard-RNA-Marker in die Vertiefungen eines vormontierten denaturierenden Polyacrylamidgels. Führen Sie eine Elektrophorese durch, die die größenbasierte Trennung von RNA-Fragmenten erleichtert.

Übertragen Sie das Gel auf vornasses Filterpapier auf einer Elektrolöschkassette. Richten Sie eine mit Puffern getränkte Nylon-Blotting-Membran über dem Gel aus. Stapeln Sie dann die vornassen Filterpapiere. Führen Sie Elektroblotting durch.

Der elektrische Strom bewirkt, dass sich die negativ geladene RNA, einschließlich der miRNA, aus dem Gel auf die positiv geladene Nylonmembranoberfläche bewegt. Setzen Sie die Membran ultraviolettem Licht aus. Dadurch werden die RNAs mit der Membran vernetzt und so ein RNA-Verlust verhindert.

Inkubieren Sie die Membran in einem Hybridisierungspuffer, der Blockierungsmittel enthält, die die unspezifischen Bindungsstellen einnehmen, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.

Fügen Sie eine radioaktiv markierte RNA-Oligonukleotidsonde hinzu, die komplementär zur Ziel-miRNA ist, um spezifisch an diese zu binden. Waschen Sie die Membran mit Puffer und entfernen Sie die ungebundenen Sonden.

Verwenden Sie ein Phosphor-Bildgebungssystem, um die Signalintensitäten der radioaktiven Hybridisierung zu erfassen und zu quantifizieren. Das hochauflösende Signal deutet auf eine spezifische miRNA-Expression im Pflanzengewebe hin.