Name: Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte zur Quantifizierung kleiner nicht-kodierender RNAs. Diese Methode ermöglicht die Analyse von HDL-small RNAs als potenzielle Biomarker für kardiometabolische Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen der National Institutes of Health, des National Heart, Lung and Blood Institute an K.C.V. HL128996, HL113039 und HL116263 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch Auszeichnungen der American Heart Association an K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 und R.M.A. POST25710170 unterstützt.

1. HDL Reinigung (~ 5,5 Tage) <ol><li> Density-Ultrazentrifugation (DGUC, ~ 5 Tage) <ol><li> In 90 ul 100x Anti-Oxidantien zu 9 ml Plasma isoliert aus frischem venösen Blut. </li><li> Einstellen Plasmadichte mit KBr von 1,006 g / ml bis 1,025 g / ml durch Zugabe von 0,251 g KBr bis 9 ml Plasma aus Schritt 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr Plasma). Schaukeln Sie das Plasma, bis alle das Salz bei Raumtemperatur aufgelöst ist, und Rohre zu Ultracentrifuge und sicherzustellen, dass alle Blasen nach oben steigen. </li><li> Biegen Sie die Spitze eines 18-G-Nadel auf 90 ° 1 cm von der Spitze, mit Blick auf Kegel Seite nach oben. Unter Verwendung einer Spritze und die 18-Gauge - Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 1 über die Plasma (Tabelle 1). HINWEIS: Die gebogene Nadel sorgt für all die VLDL / IDL, LDL und HDL mit dem Overlay entfernt werden ohne Mischen. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der Blasen an der Spitze, so dass 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres und carefully Die Röhrchen in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer (Eimer + cap) Balance: # 1 bis # 4, # 2 bis # 5 und # 3 bis # 6. Hinweis: Diese Eimer müssen jederzeit ausgeglichen und abgestimmt sein. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage einer Spritze und gebogenen Nadel. Dies wird die VLDL / IDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C. </li><li> die VLDL / IDL-Fraktion, sammeln die restlichen 7 mL Probe (Plasma) und legen Sie es in eine 15 ml konischen Röhrchen Nach dem Entfernen. Bringen Sie das Volumen der Probe bis zu 9 ml mit Overlay - Lösung # 2 (Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie die Probendichte von 1,025 g / ml bis 1,080 g / ml mit KBr mitca. 0.746 g KBr in 9 ml Probe oder 0,0828 g / ml KBr Probe. Schütteln Sie die Probe, bis das gesamte KBr gelöst (ca. 20 min) und das Übertragungsrohr zu Ultracentrifuge während sichergestellt Blasen nach oben steigen. </li><li> Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 3 über die Probe (Tabelle 1). Lassen Sie 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen am oberen Ende des Rohres und legen Sie sorgfältig die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe balancieren, wie in 1.1.5. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage unter Verwendung einer Spritze und seinnt Nadel. Dies wird die LDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C. </li><li> Nach der LDL-Fraktion zu entfernen, sammeln die verbleibenden annähernd 7 ml Probe (Plasma) und legen Sie sie in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der Probe (Plasma) bis zu 9 ml mit 1,080 g / ml - Lösung # 4 (Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie die Probendichte von 1,080 g / ml bis 1,30 g / ml KBr unter Verwendung 3,33 g KBr in 9 ml Probe (Plasma) oder 0,37 g KBr pro ml Probe. Rock oder leicht die Probe rühren, bis das gesamte KBr (Salz) aufgelöst ist, und Rohr Ultracentrifuge. </li><li> Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 5 über die Probe (Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen an der Spitze des Rohres, 2- 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres zu verlassen und sorgfältig legen die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer. </li><li> Wiegen Sie jede Schaufel (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe, wie in 1.1.5 balancieren. </li><li> Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 48 h bei 4 ° C mit einem # 4 Bremse. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig mit einer Spritze und verbogene Nadel ca. 2 ml aus der oberen Schicht des Overlays verwenden. Dies ist der HDL-Fraktion, die bei 4 ° C oder -80 ° C gelagert werden kann. HINWEIS: Nach DGUC HDL kann die Hochsalzlösungen zu entfernen dialysiert werden. </li><li> Um dialysiere, legen Sie die gesammelten HDL-Fraktion in einem verschlossenen Dialysehülse (10.000 MW cut-off) und über Nacht in 1 L 1x PBS dialysiert. Ändern Dialysepuffer (1x PBS) 3-mal mehr als 24 Stunden. Sanfte Störung des PBS mit einem magnetischen Rührstab wird die Dialyse zu verbessern. </li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration des DGUC-HDL 8 ein BCA - Methode. </li></ol></li><li> Schnell-Protein Liquid Chrographie (FPLC) oder Grßenausschlußchromatographie (~ 6 h) <ol><li> Filter 1,2 mg DGUC-HDL (Gesamtprotein) in 500 &amp; mgr; l durch einen 0,22 &amp; mgr; m Mikrozentrifugenfilter (siehe Liste der Materialien), unmittelbar vor der Injektion. HINWEIS: Eine zusätzliche Filterung des DGUC-HDL Probe durch ein 0,45 um-Mikrozentrifugenfilter vor dem 0,22 um-Filter kann für einige Proben erforderlich sein. </li><li> Sammeln Sie die gefilterten DGUC-HDL-Probe, laden Sie die FPLC (Füllung) Injektionsspritze, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Spritze sind, bevor sie in die FPLC injiziert wird. </li><li> Stellen Sie die FPLC Flussrate auf 0,3 ml / min bei einer Druckgrenze bei 2,6 MPa. Äquilibrieren Säulen mit 0,2 Säulenvolumen (ca. 15 ml) der Puffer vor Injektion abzutasten. Injizieren Sie die Probe mit 3 ml Puffer in die FPLC (Injektionsschleife) Instrument und den Lauf starten. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen für insgesamt 72 Fraktionen. </li></ol></li></ol> 2. Hochdurchsatz-Small RNASequenzierung (sRNAseq, ~ 9 Tage) <ol><li> RNA - Isolierung (~ 1 Tag) <ol><li> Identifizieren der FPLC-Fraktionen DGUC-HDL entspricht, die von Gesamt-Cholesterinspiegel Bestimmen eines kolorimetrischen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Mit dieser FPLC Set-up, erwarten zu finden 6 - 7 FPLC Fraktionen, die DGUC-HDL. </li><li> Sammle alle Volumen (ca. 8 -1 0 ml Pool von 1,45 ml Fraktionsvolumina) von DGUC-HDL FPLC-Fraktionen und konzentriere unter Verwendung von 10 kDa MG Rückhalte Zentrifugalfilter Einheiten bei 4.000 × g für 1 h bei 4 ° C oder bis HDL Konzentrat beträgt etwa 100 &amp; mgr; l. </li><li> Sammeln Sie die HDL - Konzentrat und quantifizieren HDL Gesamtproteinkonzentration 8 der BCA - Methode. </li><li> Bestimmen die höchste Konzentration an HDL Gesamtprotein, bis zu 1 mg, die aus jeder Probe in dem Satz aliquotiert werden kann. B. Isolierung für jede Probe RNA aus der gleichen Menge an HDL Gesamtprotein. </li><li> Führen RNA-Isolierung verwendetein modifiziertes Protokoll (siehe Liste der Materialien). <ol><li> In 10x Volumen Phenol Lysereagenz (siehe Liste der Materialien) Probe und Vortex für 1 min. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In Chloroform (20% Reagenz Volumen in Schritt 2.1.5.1 verwendet Phenol Lyse) und kräftig schütteln, 15 s. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen, die Vermeidung der Interphase. </li><li> Hinzufügen 1,5x Volumen von 100% Ethanol zu der wässrigen Phase und vortex für 1 min. </li><li> Store Proben für mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 ° C. </li><li> Fahren Sie mit dem RNA-Isolierung Protokoll der mitgelieferten Mini-Spalten verwenden. </li><li> Eluieren mit 30 &amp; mgr; l RNase-freiem H 2 O. Erste hinzuzufügen 15 ul H 2 O direkt auf die Fritte, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 2 min, undSpin dann bei hoher Geschwindigkeit (max) für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichen 15 &amp; mgr; l H 2 O </li></ol></li><li> Fahren Sie direkt mit sRNA Bibliothek Generation oder bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Bibliothek Generation (~ 6 h) <ol><li> Bereiten Sie sRNA cDNA-Bibliotheken, die sRNA Bibliothek Generation Kit-Protokoll, als den Anweisungen des Herstellers mit einer Modifikation der PCR-Amplifikation wie nachfolgend beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie die PCR - Mastermix auf Eis mit 0,5 ul DNase / RNase-freiem H 2 O, 15 &amp; mgr; l PCR - Mix (PML) und 1 &amp; mgr; l RNA - PCR - Primer (RP1) pro Probe (einen zusätzlichen 10% zum Pipettieren Fehler). </li><li> In 16,5 ul der PCR-Mix zu jedem (cDNA) Probe. </li><li> einen Index / Barcode-Nummer zu jeder Probe zum Multiplexen zuweisen und 1 &amp; mgr; l PCR Primer Index (auf die entsprechende Nummer) zu der Probe hinzuzufügen. </li><li> Führen Sie eine schnelle Drehung der Mikrofuge verwenden. HINWEIS: Das Gesamtvolumen solltejetzt 30 ul pro Probe sein. </li><li> Führen Sie die Zyklusbedingungen für die PCR - Amplifikation wie in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt. </li></ol></li></ol></li><li> Größe auswählen sRNA - Bibliothek zu entfernen Adapter: Adapter (~ 1,5 h) <ol><li> Führen Sie Größe der Bibliothek-Auswahl unter Verwendung einer automatischen DNA-Größenwähler gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Größenparameter: Ziel: 156 bp, Beginn: 135 bp, Ende: 177 bp, Bereich Flag: Breit. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Clean up größenselektierten sRNA cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Eluieren sauber und konzentriert sRNA cDNA mit 2 x 7 ul DNase / RNase-freiem H 2 O. </li></ol></li><li> Quantifizieren und Beurteilen sRNA cDNA - Bibliothek Ertrag und Qualität (~ 1 h) <ol><li> Beurteilen Sie sRNA cDNA-Bibliothek Qualität und Größe unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Materialliste) gemäß manufacturer Anweisungen. </li><li> Quantifizieren der einzelnen sRNA cDNA-Bank-Konzentrationen unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Test (Materialliste), gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Proben mit unterschiedlichen Indizes haben auf der gleichen Spur der Flusszelle, wenn möglich ausgeführt werden. Wenn mehr als eine Spur erforderlich ist, mischen Fall und Kontrollproben geeignet. </li></ol></li><li> Hochdurchsatz - Sequenzierung sRNA (~ 7 Tage) <ol><li> Pool einzelne indiziert sRNA Bibliotheken basierend auf äquimolare Konzentrationen. </li><li> Bildschirm gepoolt sRNA Bibliotheken für Qualität mit hoher Empfindlichkeit DNA-Chip auf der Bioanalyzer und bestimmen Bibliothek DNA-Konzentration wie in 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Führen quantitative PCR (qPCR) des Adapters geeignete Inhalte Sequenzierungstiefe mit Hilfe der Sequenzierung Bibliothek qPCR Quantifizierung Kit, um sicherzustellen, laut Herstellerangaben (Materialliste). </li><li> Führen Sie die Sequenzierung eines einzelnen Lese verwenden, 50 b25 M liest / Probe, gemäß den Anweisungen des Herstellers - p-Protokoll eine Tiefe von etwa 20 zu erreichen. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse (~ 1 Tag) <ol><li> Verwenden Sie bcl2fastq2, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen vorverarbeiten rohen fastq Dateien von demultiplexten Proben (Materialliste). </li><li> Verwenden Sie Cutadapt zu trimmen Adapter 9 und entfernen Sie liest &lt;16 Nukleotiden (nts) in der Länge, wie pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste). </li><li> Entfernen Kontamination Sequenzen, die in den sRNA Bibliotheken, einschließlich Stop-Lösung Sequenz (STP: CCACGTTCCCGTGG) und Adapter Übertrag (CTACAGTCCGACGATC) mit removeSequenceInFastq Funktion in NGSPERL Rahmen, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Führen Sie die Qualitätskontrolle Metriken von FastQC mit Center for Quantitative Sciences (CQS) Werkzeuge, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Generieren Sie nicht redundante Liste der &quot;identisch&quot; liest (Zusammenbruch redundant liest) und Zahlen Rekordkopie CQSTools, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). </li><li> Richten Sie liest menschlichen Genoms Bowtie1.1.2 ermöglicht ein Mismatch (Optionen: -a -m 100 --bester --strata -v 1), pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste). </li><li> Führen Sie lesen Ausrichtung, Zählen, und führen Verdichtungsaufgaben mit NGSPERL, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen. </li><li> Konvertieren Sie exportierte Zählung Tabelle in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Normalisieren liest einer bestimmten Klasse (zB miRNAs) zur Gesamtzahl der für diese Klasse lautet (zB Gesamtzahl der miRNAs liest) und Bericht - Signale als Lesevorgänge pro Mapped miRNA (RPMM). (ZB RPMM = (miR-X / Gesamtanzahl von miRNA liest) * 1.000.000). </li><li> Eingang normalisiert Zählung Tabelle als generische einzelne Farbtechnologie in Software für Low-Level-und High-Level-Differenzanalysen gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste). HINWEIS: Zur Zeit gibt es keine gut charakterisierten Housekeeping-Gene / SRNWie für HDL-sRNA. Ein Spike-Kontrolle kann verwendet werden, kann aber problematisch sein. Normalisieren zum Gesamtprotein Eingang oder Volumen wird empfohlen, HDL. Am wichtigsten ist, ist es empfehlenswert, Sequenzierungsergebnisse von einem der verschiedenen Strategien zur Validierung miRNAs und sRNAs mittels real-time PCR oder quantitative PCR quantifiziert werden. </li></ol>

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<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt miRNAs und andere sRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Real-Time PCR auf hochreines HDL zu quantifizieren. Wie bei jedem Ansatz sollte besondere Überlegungen zu jedem Schritt in dem Verfahren zur Reinigung von HDL und RNA und dann sRNAs Quantifizieren gegeben werden. Dieses Protokoll wird für Projekte mit ≥ 2 ml Plasma gestartet wird. Dennoch können qualitativ hochwertige RNA Analysen erfolgreich mit HDL von so wenig wie 80 &amp; mgr; l des menschlichen oder Maus-Plasma unter Ve...

Die extrazelluläre nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) stellen eine neue Klasse von Krankheit Biomarker und potentielle therapeutische Targets und wahrscheinlich erleichtern Zell-zu-Zell - Kommunikation 1. Die am häufigsten untersuchten Typ von sRNA sind Mikro - RNAs (miRNAs) , die etwa 22 nts lang sind und aus längeren Vorläuferformen und primären Transkripte 2 verarbeitet. miRNAs wurden posttranskriptionell demonstriert die Genexpression durch Unterdrückung der Proteintranslation und die Induktion von mRNA - Abbau 2 regulieren. Dennoch sind miRNAs nur eine von vielen Arten von sRNAs; wie sRNAs kann von den Eltern tRNAs (tRNA-derived sRNAs, TDR), small nuclear RNAs (sRNA-derived sRNAs, sndRNA), kleine nucleolar RNAs (snoRNA abgeleitete sRNAs, snRNA), ribosomale RNAs (rRNA-abgeleitete sRNAs gespalten werden, RDR ), Y RNAs (yDR) und verschiedene andere RNAs 1. Einige Beispiele dieser neuartigen sRNAs wurden berichtet miRNAs ähnlich zu funktionieren; jedoch die biologische funktionen vieler dieser bleibt sRNAs bestimmt werden, obwohl Rollen in Genregulation 3-6 wahrscheinlich sind. Interessanterweise sind miRNAs und andere sRNAs stabil in extrazellulären Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Plasma, Urin und Galle. Extrazellulärem sRNAs wahrscheinlich von RNasen durch ihre Assoziation mit extrazellulären Vesikeln (EV), Lipoproteine ​​und / oder extrazellulären Ribonukleoprotein-Komplexe geschützt. Zuvor haben wir berichtet , dass Lipoproteine, nämlich High-Density - Lipoproteine (HDL), Transport miRNAs in Plasma 7. In dieser Studie wurden HDL unter Verwendung einer sequenziellen Methode der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, schnell-Protein-Flüssigchromatographie (Grßenausschlußchromatographie Gelfiltration, FPLC) und Affinitätschromatographie (anti-Apolipoprotein AI (ApoA-I) Immunpräzipitation 7). Mit beiden real-time PCR-basierten Low-Density-Arrays und einzelne miRNA-Assays wurden miRNA Ebenen auf HDL quantifiziert isoliert von heilendeine und hypercholesterolemic Themen 7. Mit diesem Ansatz konnten wir miRNAs zu profilieren und spezifischen miRNAs in hochreiner HDL Vorbereitungen zu quantifizieren. Seit 2011 haben wir festgestellt, dass, obwohl die Affinitätschromatographie HDL Reinheit verbessert, Antikörpersättigung Ausbeute stark begrenzt und kann kostspielig sein. Derzeit empfiehlt unser Protokoll einen zweistufigen sequentiellen Tandemverfahren DGUC durch FPLC gefolgt, die auch hochwertige HDL Proben für Downstream-RNA-Isolierung und Quantifizierung sRNA erzeugt. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz - Sequenzierung von sRNAs (sRNAseq), zB miRNAs, und das erhöhte Bewusstsein für andere nicht-miRNA sRNA Klassen ist sRNAseq die aktuellen State-of-the-art in miRNA und sRNA Profilierung. Als solches unser Protokoll empfiehlt miRNAs und andere sRNAs auf HDL-Proben unter Verwendung von sRNAseq zu quantifizieren. Dennoch kann Gesamt-RNA aus HDL isoliert auch einzelne miRNAs und andere sRNAs oder validieren sRNAseq Ergebnisse mit real-time PCR eine Quantifizierung verwendet werdenpproaches. Hier beschreiben wir ausführlich ein Protokoll für die Erfassung, Reinigung, Quantifizierung, Datenanalyse und Validierung von hochreinem HDL-sRNAs. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Machbarkeit und den Prozess der sRNA Quantifizierung in hochreiner HDL aus menschlichem Plasma isoliert zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Erhöhung der Säulen Inline</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300</td></tr><tr><td>gl SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Tischgerät Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (gekauft über USA Scientific)</td></tr><tr><td>Mikrofuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Hochempfindlicher DNA-Assay</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierungsbibliothek qPCR-Quantifizierungskit</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermocycler</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Roboter</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra-klare Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugalfilter 0,45 & Mikrozentrifugalfilter m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugalfilter 0,22 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Colormetric Kit</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10.000 m.w. Cut-off-Zentrifugationsfilter</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>gekauft über Millipore</td></tr><tr><td>PCR-Streifenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>gekauft über Fisher</td></tr><tr><td>microRNA RT-Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Für 1000 Reaktionen</td></tr><tr><td>PCR-Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>50-ml-Flasche</td></tr><tr><td>Pierce BCA-Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Reinigungs- und Konzentrator-Kit</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>über Fisher erworben</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

isolierung von lipoproteinen hoher dichte für non-coding small rna quantification

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Die Vielfalt der kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNA) ist schnell wachsenden und ihre Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, entstehen. Interessanterweise sRNAs werden auch außerhalb der Zellen und sind stabil in allen biologischen Flüssigkeiten gefunden. Als solche stellen extrazelluläre sRNAs eine neue Klasse von Krankheits Biomarkern und werden in Zellsignalisierung und interzellulare Kommunikationsnetze wahrscheinlich beteiligt. Ihr Potenzial als Biomarker beurteilen kann sRNAs im Plasma, Urin und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden. Dennoch vollständig die Wirkung von extrazellulärem sRNAs als endokrine Signale zu verstehen, ist es wichtig , zu bestimmen , welche Ladungsträger zu transportieren und sie in biologischen Flüssigkeiten (zB Plasma) zu schützen, das Zellen und Gewebe zu extrazellulärem sRNA Pools tragen und Zellen und Gewebe fähig des Annehmens und der extrazellulären sRNA verwendet. Um das zu erreichen, diese Ziele ist es entscheidend, hochreine Populationen von extrazellulären Träger zu isolierenfür sRNA Profilierung und Quantifizierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine ​​hoher Dichte (HDL), transportiert funktionelle mikroRNAs (miRNAs) zwischen Zellen und HDL-miRNAs sind Krankheit signifikant verändert. Hier Detail, das wir ein neues Protokoll, das Tandem-HDL-Isolierung mit Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) verwendet zu erhalten hochreine HDL für Downstream-Profilierung und Quantifizierung aller sRNAs, einschließlich miRNAs, die beide hoch mit -throughput Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von sRNAs auf HDL sein.

Dieses Protokoll ist eine Reihe von etablierten Methoden miteinander verbunden sind für die Quantifizierung von sRNAs auf hochreine HDL durch Hochdurchsatz - Sequenzierung oder Echtzeit - PCR (1) zu ermöglichen. Um die Machbarkeit und die Auswirkungen dieses Protokoll zeigen, HDL wurde aus Humanplasma durch das Tandem DGUC und FPLC-Methode gereinigt. Collected FPLC-Fraktionen zu HDL (von Cholesterinverteilung) wurden konzentriert, und Gesamt-RNA wurde aus 1 mg von HDL (G...

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, kleine nicht-kodierende RNAs auf gereinigten Lipoproteinen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lipoproteine zu beantworten, beispielsweise die Definition von kleinen RNA-Signaturen der Lipoproteine bei Gesundheit und Krankheit sowie die Weiterentwicklung kleiner Lipoprotein-RNAs als Biomarker für Krankheiten oder als Botenstoffe zwischen Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass man hochreine Lipoproteine hinsichtlich Veränderungen kleiner RNAs unter Krankheits- oder experimentellen Bedingungen analysieren kann.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von kardiometabolischen Erkrankungen, da extrazelluläre RNAs eine neue Klasse von Krankheitsbiomarkern darstellen und lipoproteingebundene kleine RNAs in zukünftigen Studien vielversprechendes Potenzial als Arzneimittelziele besitzen. Obwohl diese Methode für kleine RNAs aus HDL entwickelt wurde, kann sie ebenfalls für sehr geringe Dichte und niedrige Dichte Lipoprotein-kleine RNAs angepasst werden. Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da geeignete Ausrüstung und Fachkenntnisse bei der Probenvorbereitung für die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation fehlen.Dieses Protokoll besteht aus etablierten Methoden, die miteinander verknüpft sind, um kleine RNAs auf hochreinen HDL mittels Hochdurchsatzsequenzierung oder Echtzeit-PCR zu quantifizieren. In diesem Video wird die Reinigung der HDL behandelt. Dieses Protokoll wird von meinem Assistenten Evan Shadari demonstriert.Als Erstes 90 µL 100x-Antioxidantien zu 9 mL Plasma hinzufügen. Anschließend die Dichte des Plasmas durch Zugabe von 0,251 g Kaliumbromid zu je 9 mL Plasma auf 1,025 g/mL einstellen. Das Plasma bei Raumtemperatur schwenken, bis das gesamte Salz gelöst ist.Überführen Sie dann das Plasma in Ultrazentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, dass sich eine Schicht aus Blasen an der Oberseite befindet. Es sollte keine Luft unter dem Plasma eingeschlossen sein. Bereiten Sie anschließend eine 18-Gauge-Nadel vor, indem Sie einen 90-Grad-Knick einen Zentimeter von der Spitze entfernt anbringen, wobei die abgeschrägte Seite nach oben zeigt.Danach mit einer Spritze und der gebogenen Nadel vorsichtig drei Milliliter Überlagerungslösung Nummer eins auf das Plasma geben. Entfernen Sie die meisten Blasen auf der Oberfläche und lassen Sie einen Abstand von zwei bis drei Millimetern zwischen dem Meniskus und dem Rand des Röhrchens. Danach stellen Sie die Röhrchen vorsichtig in die SW 40 Ti-Buckets.Wiegen Sie jeden Eimer mit den Deckeln und bringen Sie die Eimer, die gegenüberliegende Positionen in der Zentrifuge einnehmen werden, exakt ins Gleichgewicht. Platzieren Sie anschließend den Rotor in die Ultrazentrifuge und lassen Sie ihn 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit 274.400 ×g laufen, wobei die Bremse mittig auf einen Wert von vier eingestellt ist. Am nächsten Tag nehmen Sie die Eimer vorsichtig vom Rotor und heben die Röhrchen aus den Eimern heraus.Entfernen Sie dann langsam zwei Milliliter aus der oberen Schicht der Überlagerung mithilfe einer Spritze und einer gebogenen Nadel. Dies ist die VLDL-IDL-Fraktion. Sammeln Sie anschließend die verbleibenden sieben Milliliter Plasma und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Kegelrohr.Bringen Sie das Volumen des Plasmas durch Zugabe von Überlagerungslösung Nummer zwei auf neun Milliliter. Anschließend stellen Sie die Dichte durch Zugabe von 0,746 Gramm Kaliumbromid auf 1,080 Gramm pro Milliliter ein. Danach schwenken Sie die Probe vorsichtig, um das Salz aufzulösen, was etwa 20 Minuten dauern wird.Anschließend die Probe ohne Lufteinschluss in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführen. Sicherstellen, dass sich an der Oberseite eine Schicht aus Blasen bildet. Mit der gebogenen Nadel vorsichtig drei Milliliter Überlagerungslösung Nummer drei auftragen.Entfernen Sie anschließend den Großteil der Luftblasen und laden Sie die Röhrchen vorsichtig in den SW 40 Ti-Behälter. Wägen Sie sie aus und zentrifugieren Sie sie wie zuvor beschrieben 24 Stunden lang. Am nächsten Tag entnehmen Sie vorsichtig zwei Milliliter aus der oberen Schicht der Überlagerung unter Verwendung der gebogenen Nadel.Dies ist die LDL-Fraktion. Überführen Sie danach die verbleibende Probe in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Gefäß und stellen Sie das Volumen mit Lösung Nummer vier auf neun Milliliter ein. Anschließend wird die Dichte durch Zugabe von etwa 3,33 Gramm Kaliumbromid auf 1,30 Gramm pro Milliliter eingestellt, wobei die Probe geschwenkt wird, bis das Salz vollständig gelöst ist.Überführen Sie die Probe anschließend in ein Ultrazentrifugenröhrchen und pipettieren Sie vorsichtig drei Milliliter Lösung Nummer fünf darüber. Zentrifugieren Sie die Probe nun erneut im Ultrazentrifugenröhrchen, diesmal jedoch 48 Stunden lang. Zwei Tage später entnehmen Sie mit einer Spritze und einer gebogenen Nadel die oberen zwei Milliliter der Überlagerungsflüssigkeit.Dies stellt die HDL-Fraktion dar. Um die Salzlösung mit hohem Salzgehalt zu entfernen, überführen Sie die HDL-Fraktion in eine benetzte Dialysehülle mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 10.000. Anschließend dialysieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Liter 1× PBS unter leichtem Rühren bei vier Grad Celsius.Ersetzen Sie die PBS-Lösung innerhalb des 24-Stunden-Zeitraums dreimal. Bestimmen Sie anschließend die Proteinkonzentration der HDL-Fraktion mithilfe der BCA-Methode. Extrazelluläre Vesikel oder Exosomen weisen eine ähnliche Dichte wie kleine HDL auf und könnten daher in derselben Dichtefraktion wie HDL vorhanden sein.Daher ist eine weitere Reinigung der HDL-Fraktion mittels FPLC erforderlich. Unmittelbar vor der Verwendung der FPLC werden 1,2 Milligramm der DGUC-HDL-Fraktion in 500 Mikrolitern Lösung durch einen 0,22-Mikron-Zentrifugalfilter geleitet. Die filtrierte Probe wird in eine FDLC-Injektionsspritze aufgefangen, wobei sichergestellt wird, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.Als Nächstes stellen Sie die FPLC-Durchflussrate auf 0,3 Milliliter pro Minute bei einer Druckbegrenzung von 2,6 Megapascal ein. Danach equilibrieren Sie die Säulen mit 0,2 Säulenvolumina Puffer. Injizieren Sie nun die Probe mit drei Milliliter Puffer in das FPLC-Gerät und starten Sie den Lauf.Sammeln Sie 1,5-Milliliter-Fraktionen für insgesamt 72 Fraktionen. Identifizieren Sie die FPLC-Fraktionen, die dem DGUC-HDL entsprechen, indem Sie die Gesamtcholesterinwerte mithilfe eines kolorimetrischen Kits gemäß den Herstelleranweisungen bestimmen. Es ist damit zu rechnen, dass sich sechs bis sieben FPLC-Fraktionen mit DGUC-HDL befinden.Vereinigen Sie alle HDL-haltigen Fraktionen und konzentrieren Sie diese mithilfe eines zentrifugalen Filters mit einer Grenzgröße von 10 Kilodalton bei 4.000 × g für eine Stunde bei vier Grad Celsius oder bis das HDL-Konzentrat etwa 100 Mikroliter beträgt. Sammeln Sie anschließend das HDL-Konzentrat und quantifizieren Sie das Protein nach der BCA-Methode. Verwenden Sie danach die gleiche Menge an gesamtem HDL-Protein, um RNA zu isolieren.Humanes Plasma wurde mittels FPLC ohne Verwendung einer Dichtegradiententrennung fraktioniert. Sechs Fraktionen entsprachen HDL und sechs dem sehr gering dichten Lipoprotein. Lipide in Schwarz, Cholesterin in Rot und Protein in Blau wurden jeweils mit farbmetrischen Kits gemessen.Im Vergleich dazu führte die Verwendung der Dichtegradient-Ultrazentrifugation vor der FPLC zur Identifizierung von Lipidproteinen und Cholesterin nahezu ausschließlich in HDL-Fraktionen. Aus HDL von vier gesunden Plasmaspendern wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels eines Einzel-Read-Protokolls mit 50 Basenpaaren sequenziert. Die Verteilung der normalisierten Reads zeigt eine Anreicherung kleiner RNAs bei etwa 21 und 34 Nukleotiden.Die Analyse der Bibliothek zeigte, dass 38 Prozent der Reads mikro-RNAs und 37 Prozent von tRNAs stammten. Außerdem waren diverse RNAs, ribosomale RNAs, kleine RNAs, kleine nucleoläre RNAs und lange nicht-kodierende RNAs vorhanden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zehn Tagen durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die mit Hochdurchsatzsequenzierung beobachteten Veränderungen an kleinen HDL-RNAs durch eine andere Methode wie PCR oder Northern Blotting zu validieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie die Bestimmung der HDL-Cholesterin-Efflux-Akzeptorkapazität und der antiinflammatorischen Aktivitäten von HDL, während der RNA-Isolierungsschritte und der Vorbereitungsschritte für die Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise den Zusammenhang zwischen Veränderungen an kleinen HDL-RNAs und der HDL-Funktion zu ermitteln. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf den Gebieten der Lipide und Lipoproteine den Weg, nicht-cholesterinhaltige Frachtstoffe, insbesondere Nukleinsäuren, sowie Stoffwechselerkrankungen wie beispielsweise Hypercholesterinämie oder Diabetes zu untersuchen.Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Plasma äußerst gefährlich sein kann. Man sollte über eine angemessene Schulung im Umgang mit blutübertragbaren Krankheitserregern verfügen, und geeignete persönliche Schutzausrüstung sollte beim Durchführen dieser Technik getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

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MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

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Epigenetische Faktoren können mit genetischen Programme zu modulieren Genexpression und regulieren die Funktion der B-Zellen interagieren. Durch die Kombination von in-vitro- B-Zell-Stimulation, qRT-PCR, und Hochdurchsatz-RNA-Sequenz und mRNA-Sequenz Ansätze, analysieren wir die epigenetische Modulation von MiRNA und gen-Expression in B-Zellen.

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Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

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Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

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Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

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Erfahren Sie die Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte zur Quantifizierung kleiner nicht-kodierender RNAs. Diese Methode ermöglicht die Analyse von HDL-small RNAs als potenzielle Biomarker für kardiometabolische Erkrankungen.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

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