Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, kleine nicht-kodierende RNAs auf gereinigten Lipoproteinen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Lipoproteine zu beantworten, wie z. B. die Definition von Lipoprotein-Small-RNA-Signaturen bei Gesundheit und Krankheit sowie die Weiterentwicklung kleiner Lipoprotein-RNAs als Krankheitsbiomarker oder Zell-zu-Zell-Nachrichten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man hochreine Lipoproteine auf kleine RNA-Veränderungen bei Krankheiten oder experimentellen Bedingungen analysieren kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie kardiometabolischer Erkrankungen, da extrazelluläre RNAs eine neue Klasse von Krankheitsbiomarkern darstellen und kleine Lipoprotein-RNA ein spannendes Potenzial als Angriffspunkte für Medikamente in zukünftigen Studien haben. Obwohl diese Methode für kleine HDL-RNAs ausgelegt ist, kann sie auch für kleine Lipoprotein-RNAs mit sehr niedriger Dichte und niedriger Dichte angepasst werden. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es an geeigneter Ausrüstung und Fachwissen bei der Vorbereitung von Proben für die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation mangelt.

Dieses Protokoll besteht aus etablierten Methoden, die für die Quantifizierung kleiner RNAs auf hochreinem HDL unter Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Echtzeit-PCR miteinander verknüpft sind. In diesem Video geht es um die Reinigung des HDL. Dieses Protokoll wird von meinem Assistenten Evan Shadari demonstriert.

Fügen Sie zunächst 90 Mikroliter 100x Antioxidantien zu neun Millilitern Plasma hinzu. Stellen Sie dann die Dichte des Plasmas auf 1,025 Gramm pro Milliliter ein, indem Sie 0,251 Gramm Kaliumbromid pro neun Milliliter Plasma hinzufügen. Schütteln Sie das Plasma bei Raumtemperatur, bis sich das gesamte Salz aufgelöst hat.

Übertragen Sie dann das Plasma in Ultrazentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass sich oben eine Schicht Blasen befinden. Unter dem Plasma sollte keine Luft eingeschlossen sein. Bereiten Sie als Nächstes eine 18-Gauge-Nadel vor, indem Sie eine 90-Grad-Biegung einen Zentimeter von der Spitze entfernt hinzufügen, wobei die abgeschrägte Seite nach oben zeigt.

Geben Sie dann mit einer Spritze und der gebogenen Nadel vorsichtig drei Milliliter Overlay-Lösung Nummer eins auf das Plasma. Entfernen Sie den Großteil der Blasen auf der Oberfläche und lassen Sie zwei bis drei Millimeter zwischen dem Meniskus und dem Rand des Schlauchs. Legen Sie dann die Schläuche vorsichtig in SW 40 Ti Eimer

Wiegen Sie jeden Eimer mit den Kappen und balancieren Sie die Eimer, die in der Zentrifuge entgegengesetzte Positionen einnehmen, genau aus. Setzen Sie dann den Rotor in die Ultrazentrifuge ein und lassen Sie ihn 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius bei 274, 400 mal G laufen, wobei die Unterbrechung zwischenzeitlich auf einen Wert von vier eingestellt wird. Nehmen Sie am nächsten Tag die Schaufeln vorsichtig vom Rotor und heben Sie die Rohre aus den Schaufeln.

Entfernen Sie dann langsam zwei Milliliter von der obersten Schicht des Overlays mit einer Spritze und einer gebogenen Nadel. Dies ist die VLDL-IDL-Fraktion. Sammeln Sie dann die restlichen sieben Milliliter Plasma und geben Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Erhöhen Sie das Volumen des Plasmas auf neun Milliliter, indem Sie Overlay-Lösung Nummer zwei hinzufügen. Stellen Sie dann die Dichte auf 1,080 Gramm pro Milliliter ein, indem Sie 0,746 Gramm Kaliumbromid hinzufügen. Schütteln Sie anschließend die Probe vorsichtig, um das Salz aufzulösen, was etwa 20 Minuten dauert.

Übertragen Sie dann die Probe in ein Ultrazentrifugenröhrchen, ohne dass Luft eingeschlossen wird. Stellen Sie sicher, dass oben eine Schicht Blasen gebildet wird. Überlagern Sie mit der gebogenen Nadel vorsichtig drei Milliliter der Auflagelösung Nummer drei.

Entfernen Sie dann den Großteil der Blasen und laden Sie die Schläuche vorsichtig in den SW 40 Ti-Eimer. Balancieren Sie sie aus und drehen Sie sie, wie zuvor beschrieben, 24 Stunden lang. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig zwei Milliliter mit der gebogenen Nadel von der obersten Schicht des Overlays.

Dies ist die LDL-Fraktion. Übertragen Sie dann die verbleibende Probe in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen mit Lösung Nummer vier auf neun Milliliter. Stellen Sie nun die Dichte auf 1,30 Gramm pro Milliliter ein, indem Sie etwa 3,33 Gramm Kaliumbromid hinzufügen und die Probe schütteln, bis sich das Salz aufgelöst hat.

Übertragen Sie dann die Probe in ein Ultrazentrifugenröhrchen und übermäßig drei Milliliter Lösung Nummer fünf. Zentrifugieren Sie die Probe nun wie zuvor, jedoch 48 Stunden lang. Zwei Tage später sammeln Sie die oberen zwei Milliliter des Overlays mit einer Spritze und einer gebogenen Nadel.

Dies ist die HDL-Fraktion. Um die salzreichen Lösungen zu entfernen, überführen Sie die HDL-Fraktion in eine Nassdialysehülse mit einem Grenzwert von 10.000 Molekulargewicht. Dialysieren Sie es dann 24 Stunden lang in einem Liter eines XPBS unter leichtem Rühren bei vier Grad Celsius.

Ersetzen Sie die PBS-Lösung dreimal über einen Zeitraum von 24 Stunden. Bestimmen Sie später die Proteinkonzentration der HDL-Fraktion mit einer BCA-Methode. Extrazelluläre Vesikel oder Exosomen haben eine ähnliche Dichte wie kleine HDL und könnten daher in der gleichen Dichtefraktion wie HDL vorliegen.

Daher muss die HDL-Fraktion weiter durch FPLC gereinigt werden. Unmittelbar vor der Verwendung des FPLC werden 1,2 Milligramm der DGUC HDL-Fraktion in 500 Mikrolitern Lösung durch einen 0,22-Mikron-Zentrifugalfilter geleitet. Sammeln Sie die gefilterte Probe in einer FDLC-Injektionsspritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.

Stellen Sie als Nächstes die FPLC-Durchflussrate auf 0,3 Milliliter pro Minute mit einer Druckgrenze von 2,6 Megapascal ein. Äquilibrieren Sie dann die Spalten mit einem Puffervolumen von 0,2 Spalten. Injizieren Sie nun die Probe mit drei Millilitern Puffer in das FPLC-Gerät und starten Sie den Lauf.

Sammeln Sie 1,5 Milliliter-Fraktionen, so dass es insgesamt 72 Fraktionen gibt. Identifizieren Sie die FPLC-Fraktionen, die DGUC HDL entsprechen, indem Sie den Gesamtcholesterinspiegel mit einem kolorimetrischen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmen. Es ist zu erwarten, dass sechs bis sieben FPLC-Fraktionen gefunden werden, die DGUC HDL enthalten.

Sammeln Sie alle HDL-haltigen Fraktionen und konzentrieren Sie sie unter Verwendung eines 10-Kilodalton-Cutoff-Zentrifugalfilters bei 4.000 G für eine Stunde bei vier Grad Celsius oder bis das HDL-Konzentrat etwa 100 Mikroliter beträgt. Sammeln Sie dann das HDL-Konzentrat und quantifizieren Sie das Protein mit der BCA-Methode. Verwenden Sie später die gleiche Menge an HDL-Gesamtprotein, um RNA zu isolieren.

Humanes Plasma wurde mittels FPLC ohne Verwendung von Dichtegradiententrennung fraktioniert. Sechs Fraktionen entsprachen HDL und sechs Lipoproteinen mit sehr niedriger Dichte. Lipide in Schwarz, Cholesterin in Rot und Protein in Blau wurden alle mit kolorimetrischen Kits gemessen.

Im Vergleich dazu führte die Verwendung der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation vor der FPLC dazu, dass Lipidprotein und Cholesterin fast ausschließlich in HDL-Fraktionen gefunden wurden. Aus HDL, das von vier gesunden Plasmaspendern entnommen wurde, wurde die Gesamt-RNA isoliert und unter Verwendung eines Protokolls mit 50 Basenpaaren sequenziert. Die Verteilung normalisierter Reads veranschaulicht die Anreicherung kleiner RNAs um 21 und 34 Nukleotide.

Die Analyse der Bibliothek zeigte, dass 38 Prozent der Reads microRNAs waren und 37 Prozent von TRNAs abgeleitet wurden. Verschiedene RNAs, ribosomale RNAs, kleine RNAs, kleine nukleoläre RNAs und lange nicht-kodierende RNAs waren ebenfalls vorhanden. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zehn Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, kleine HDL-RNA-Veränderungen, die bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung beobachtet wurden, mit einer anderen Methode, wie z. B. PCR oder Northern Blotting, zu validieren. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Akzeptanzkapazität des HDL-Cholesterin-E-Flusses und die entzündungshemmenden HDL-SAs, während der RNA-Isolierungsschritte und der Sequenzierungsvorbereitung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Korrelation zwischen kleinen HDL-RNA-Veränderungen und der HDL-Funktion. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Lipide und Lipoproteine den Weg, die Nicht-Cholesterinfracht zu untersuchen, insbesondere Nukleinsäuren und Stoffwechselkrankheiten, zum Beispiel Hypercholesterinämie oder Diabetes.

Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Plasma äußerst gefährlich sein kann, und man sollte eine angemessene Ausbildung in durch Blut übertragbaren Krankheitserregern haben, und bei der Durchführung dieser Technik sollte eine angemessene persönliche Schutzausrüstung getragen werden.