Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Virale Vektoren können verwendet werden, um fluoreszierende Proteine in bestimmten Untergruppen von Zellen im Gewebe zu exprimieren. Hier wird ein Virus, das manipulierte Proteine exprimiert, in den primären visuellen Kortex des Gehirns eingeführt, indem zunächst eine kleine Kraniotomie über diesem Bereich durchgeführt wird. Als nächstes wird eine Mikropipette aus Glas in das Gehirn abgesenkt und ein zahnassoziierter viraler Vektor in das Gehirn injiziert und die Operationsstelle geschlossen.

Sobald sich das Tier erholt hat, kann eine Bildgebung durchgeführt werden, um das Schicksal von fluoreszenzmarkierten Zellen in vivo oder in Gehirnschnitten zu verfolgen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzfarbstoffmarkierung und transgenen Mauslinien bestehen darin, dass sie auf einzelne Zelltypen abzielen kann und kostengünstiger und zeitaufwändiger ist als die Etablierung einer transgenen Linie. Die Verwendung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren ist für die Biosicherheitsstufe eins oder BSL eins zugelassen.

Hier werden ein Laborkittel und Handschuhe in Übereinstimmung mit den Verfahren für den Umgang mit BSL-Eins-Erregern getragen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei für Ali-Virus. Dadurch bleibt die Aktivität des Virus erhalten, indem ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermieden wird. Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank von allen unnötigen Gegenständen und sterilisieren Sie die Oberfläche mit 70%igem Ethanol.

Stellen Sie ein Becherglas mit einer 10%igen Bleichlösung in die Biosicherheitswerkbank, um einen mit Zahnviren kontaminierten Abfall aufzufangen. Ebenfalls platziert werden sterile 0,5-Milliliter-Röhrchen und ein Behälter mit Trockeneis. Tauen Sie den Virusbestand auf Eis außerhalb der Biosicherheitswerkbank auf.

Wirbeln Sie das Virus vor und öffnen Sie den Schlauch in der Haube. Pipettieren Sie das gewünschte Volumen in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen. Schließen Sie das Rohr und legen Sie es in das Trockeneis.

Zum Flashen frieren Sie den Virus ein, wenn der gesamte Virus aliquotiert wurde. Entsorgen Sie die leere Tube und die Pipettenspitzen im Behälter mit 10 % Bleichmittelabfällen. Entfernen Sie den Abfallbehälter von der Haube.

Fügen Sie zusätzlich 10% Bleiche hinzu. Warten Sie fünf bis 10 Minuten und gießen Sie dann das Bleichmittel in das Waschbecken. Entsorgen Sie alle Kunststoffabfälle in einem Behälter für biologische Gefahren.

Reinigen Sie gemäß den institutionellen Protokollen alle Geräte oder Oberflächen, die mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, mit 10 % Bleichmittel. Handschuhe ausziehen und entsorgen. Lagern Sie die Aliquots in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.

Decken Sie den Operationsbereich mit saugfähigem Labortischpapier ab. Das chirurgische Instrument sollte steril sein und die Operation sollte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Decken Sie den an den Operationsbereich angrenzenden Bereich mit saugfähigem Labortischpapier ab.

Dieser Bereich ist für die Beladung der Mikropipetten mit Viren vorgesehen. Legen Sie ein Aliquot des Virus in einen Behälter mit Eis und lassen Sie es während der Operation auf Eis auftauen. Stellen Sie einen Abfallbehälter mit 10 % Bleiche in den dafür vorgesehenen Virushandhabungsbereich ein, um Pipettenspitzen oder andere Gegenstände, die mit dem Virus in Kontakt kommen, zu entsorgen. Ziehen Sie eine Glasdraht-Troll-Mikropipette auf einen Spitzendurchmesser von ca. 20 Mikrometern.

Geben Sie einen kleinen Tropfen Mineralöl auf das stumpfe Ende der Mikropipette und setzen Sie den mit den Mikropipetten gelieferten Drahtkolben ein. Befestigen Sie die Mikropipette in der Klemme des Mikropumpenarms. Mit einer chirurgischen Schere.

Entferne die Haare von der Oberseite des Kopfes einer betäubten Maus. Sichern Sie dann die Maus in einem Stereoangriff. Baden Sie den Kopf in Ethanol und Betadin, um den Bereich zu sterilisieren.

Geben Sie einen Tropfen Tobradex-Augensalbe auf jedes Auge, um die Augen während der Operation feucht zu halten. Machen Sie einen Schnitt an der Mittellinie des Kopfes und ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel mit einer Pinzette mit feiner Spitze freizulegen. Entferne vorsichtig die Faszie vom Schädel.

Lokalisieren Sie den zu injizierenden Bereich anhand stereotaktischer Koordinaten und markieren Sie den Schädel mit einem chirurgischen Stift. Mit einem Zahnbohrer mit einem 1,4 Millimeter großen Fräser dünnen Sie einen Bereich des Schädels mit einem Durchmesser von etwa zwei Millimetern aus, bis der Schädel reißt. Unterteilen Sie den ausgedünnten Bereich während dieses Vorgangs in mehrere Segmente.

Tragen Sie sterile Kochsalzlösung auf, um den Schädel feucht zu halten. Führen Sie eine Kraniotomie durch, indem Sie die dünnen Schädelsegmente vorsichtig mit einer Zange mit extra feiner Spitze entfernen. Legen Sie ein Kim-Tuch über den Deckel der Virustube.

Öffnen Sie dann das Röhrchen für eine Ein-Mikroliter-Injektion. Pipettieren Sie 1,5 Mikroliter auf ein kleines Stück Paraform. Legen Sie dann die Spitze der Mikropipette in den Virusfond und ziehen Sie den Kolben manuell heraus.

Wenn es schwierig ist, Virusmaterial in die Mikropipette zu ziehen, kann die Spitze leicht vergrößert werden, indem Sie mit der Mikropipette ein Kim-Tuch durchstechen, um einen kleinen Teil des Glases zu zerbrechen, und den Mikropumpenarm auf den Kolben absenken, bis eine kleine Menge Virus von der Spitze der Mikropipette entfernt ist. Entfernen Sie diesen Tropfen mit einem Wattestäbchen-Applikator und entsorgen Sie den Applikator in einem Abfallbehälter. Tragen Sie einen Tropfen Mineralöl auf die Spitze der Mikropipette auf, um ein Verstopfen zu verhindern. Wenn die Mikropipette in das Gehirn abgesenkt wird, positionieren Sie die Mikropipette mit den stereotaktischen Koordinaten X und Y über dem zu injizierenden Bereich.

In diesem Experiment betragen die stereotaktischen Koordinaten, die zur Lokalisierung des primären visuellen Kortex verwendet werden, 2,7 Millimeter posterior Torema und 2,5 Millimeter lateral der Mittellinie. Senken Sie die Mikropipette sehr langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Millimeter pro Minute ab. Geben Sie die gewünschten Injektionsparameter bis zur gewünschten Tiefe in die Controller-Box der CYS micro four micro pump ein.

Für dieses Experiment wird ein Mikroliter über 10 Minuten als Injektionsrate verwendet. Initiieren Sie die Injektion. Wenn die Injektion beendet ist.

Lassen Sie die Pipette ein bis zwei Minuten ruhen, um ein Eindringen von Viren während der Entnahme zu verhindern. Entfernen Sie nach dieser Zeit sehr langsam die Mikropipette aus dem Gehirn, nähen Sie die Kopfhaut und versiegeln Sie sie mit Gewebekleber. Lassen Sie das Tier unter einer Wärmelampe genesen, bis es gehfähig ist.

Setze es dann wieder in seinen Käfig ein. Bildgebende Experimente können Tage bis Wochen nach der Virusinjektion durchgeführt werden. Spülen Sie die Mikropipette nach der Operation und der Injektion mit 10 % Bleiche aus und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände.

Geben Sie zusätzlich 10 % Bleichmittel in den Abfallbehälter. Warten Sie fünf bis 10 Minuten und gießen Sie dann das Bleichmittel in das Waschbecken. Entsorgen Sie Abfälle in einem Behälter für biologische Gefahrstoffe gemäß den institutionellen Richtlinien.

Entsorgen Sie das Labortischpapier in einem Behälter für biologische Gefahren. Wischen Sie alle Oberflächen und Instrumente ab, die möglicherweise mit dem Virus in Berührung gekommen sind. Mit 10% Bleiche können unbenutzte Viren eingefroren werden.

Auch hier ist zu bedenken, dass wiederholte Frostzyklen zu einer Verschlechterung des Virus führen. Dieses Bild zeigt transduzierte Neuronen nach Injektion eines dubletten, gestrandeten, adeno-assoziierten Virus-Serotyps. Eins. Der Zellkörper und die proximalen und distalen Dendriten sind in festen Schnitten deutlich sichtbar.

Hier wird die für eine intrakranielle Virusinjektion typische Markierung im primären visuellen Kortex gezeigt. Beachten Sie das Ausmaß der Virusausbreitung sowie die markierten Neuronen, Gliazellen und Prozesse. Die Injektion eines viralen Vektors in den Hippocampus führt ebenfalls zu deutlich sichtbaren markierten Zellen, wie in diesem Bild gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, beim Absenken und Anheben des microFIT im Gehirn große Vorsicht walten zu lassen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann. Befolgen Sie immer die richtigen Verfahren für den Umgang mit biologisch gefährlichen Stoffen, die von den Centers for Disease Control festgelegt wurden.

Bitte wenden Sie sich an das Sicherheitsbüro Ihrer Einrichtung, um eine Genehmigung und Anleitung zu erhalten, bevor Sie Experimente mit Viren durchführen.