Gitterlichtblattmikroskopie zur Visualisierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in lebenden Zellen

Die Gitterlicht-Blatt-Mikroskopie, LLSM, ermöglicht die Visualisierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zwischen Zelloberfläche und Zelloberfläche in lebenden Zellen mit hoher raumzeitlicher Auflösung.

Nehmen Sie ein Deckglas mit transduzierten Liganden-exprimierenden Zellen, die rote Fluoreszenz emittieren. Befestigen Sie das Deckglas mit der Küvette nach oben auf einem gefetteten Probenhalter. Befestigen Sie die Halterung am Piezo eines Mikroskoptisches, um eine präzise Positionierung und Abtastung der Probe während der Bildgebung zu ermöglichen. Passen Sie die Softwareeinstellungen so an, dass der Fokus auf eine einzelne ligandenexprimierende Zelle gelegt wird.

Pipettieren Sie die Rezeptor-exprimierende Zellsuspension auf das Deckglas. Die Rezeptoren sind mit grün fluorophormarkierten Antikörpern markiert. Stellen Sie sich die interagierenden Zellpaare vor.

Der Anregungslaser des Mikroskops sendet einen zirkularen, linear polarisierten Laserstrahl aus, der durch zylindrische Linsen geht, um ein Lichtblatt zu erzeugen. Das Lichtblatt wird auf einen Modulator projiziert, der überschüssige Beugung entfernt und in ein ultradünnes Gittermuster umwandelt.

Das Gitterlichtblatt beleuchtet einen ultradünnen Abschnitt des wechselwirkenden Zellpaares, und die von den wechselwirkenden Zellen emittierte Fluoreszenz wird senkrecht zum einfallenden Strahl erfasst. Stellen Sie das interagierende Zellpaar in mehreren Z-Ebenen dar und nehmen Sie mit einer Hochgeschwindigkeitskamera zweidimensionale Bilder in jeder Fokusebene auf.

Kombinieren Sie diese Bilder mit geeigneter Software zu einem Z-Stapel – einem hochauflösenden vierdimensionalen Bild, das die raumzeitliche Dynamik der Rezeptor-Liganden-Interaktion zwischen Zelloberfläche und Ligand zeigt.