Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, die Augenentwicklung des Zebrafischembryos im Lichtblattmikroskop abzubilden und den erfassten Multiview-Datensatz in Figi über das Multiview-Rekonstruktionsanwendungs-Plug-in zu verarbeiten. Diese Methode kann Ihnen helfen, morphogenetische Vorgänge in der Tierentwicklung zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Sie morphogenetische Vorgänge im sich entwickelnden Embryo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung beobachten können.

Der große Vorteil der Lichtblattmikroskopie sind die geringe Phototoxizität der Methode, das schnelle Erfassungszeitpunkt, mit dem Sie die Probe abbilden können und dass Sie die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln, sogenannten Ansichten, abbilden können. Die Erfassung der Probe aus verschiedenen Ansichten ermöglicht es uns, die Verschlechterung des Signals und der eingestellten Achse zu überwinden. Diese verschiedenen Bilder können dann verwendet und mit fluoreszierenden Mikrokügelchen um die Probe herum registriert werden.

Wir können das dreidimensionale Volumen rekonstruieren und dabei die isotrope Auflösung erreichen. Obwohl wir den Einsatz der Lichtblatt-Fluorensenzmikroskopie für die Entwicklung von Zebrafischaugen demonstrieren, kann diese Methode auch zur Beantwortung verschiedener Fragen in der Entwicklungsbiologie und den Neurowissenschaften anhand verschiedener Modellorganismen verwendet werden. Schrauben Sie zunächst das Detektionsobjektiv in das Mikroskop, während Sie die Beleuchtungsobjektive abgedeckt halten.

Lösen Sie dann die Kappe der Objektive und schieben Sie die Probenkammer vorsichtig in das Mikroskop. Sichern Sie die Kammer, indem Sie die Schraube festziehen. Verbinden Sie dann den Temperaturfühler und den Peltierblock mit dem Mikroskop.

Die beiden Rohre, die die Kühlflüssigkeit für den Peltierblock zirkulieren lassen, sind mit beiden Anschlüssen kompatibel und können in beiden Richtungen arbeiten. Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um die Kammer durch die Spritze mit Lösung bis zur Oberkante der Kammerfenster zu füllen, und prüfen Sie, ob sie undicht sind. Schalten Sie nun das Mikroskop, den Computer und die Inkubation ein.

Starten Sie die Bediensoftware des Mikroskops und stellen Sie die Inkubationstemperatur auf 28,5 Grad Celsius ein. Während die Temperatur eine Stunde lang anhält, bereiten Sie die Probe vor. Beginnen Sie mit der Zubereitung der Agarose.

Schmelzen Sie ein vorbereitetes ein Milliliter Aliquot von 1%niedriger Schmelzpunkt Agarose in E drei Medium bei 70 Grad Celsius. Nach etwa 15 Minuten werden 600 Mikroliter geschmolzene Agarose in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 250 Mikroliter E drei Medium, 50 Mikroliter 0,4 %iges MS 222 und 25 Mikroliter Vortex-Fluoreszenzkugellösung hinzugefügt. Legen Sie das Röhrchen in einen Heizblock bei etwa 39 Grad Celsius, damit sich die Agarose ihrem Gelierpunkt nähert.

Schieben Sie dann die mit Teflon bestückten Kolben bis zum Boden der Glaskapillaren mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter nach unten. Bereiten Sie fünf davon vor. Wirbeln Sie nun kurz die Agarosemischung vor und übertragen Sie dann fünf Embryonen mit der minimalen Menge Flüssigkeit hinein.

Führen Sie dann eine Kapillare ein und aspirieren Sie einen Embryo mit dem Kopf voran. Der Kopf muss vor dem Schwanz eintreten und es dürfen keine Luftblasen entstehen. Ziehen Sie so viel Lösung auf, dass sich etwa zwei Zentimeter Agarose über dem Embryo und ein Zentimeter Agarose darunter befindet.

Ziehen Sie einen Embryo in jede Kapillare, bevor Sie fortfahren. Dieser Schritt erfordert etwas Übung, um ihn zu meistern. Bereiten Sie sich mit nicht wertvollen Embryonen darauf vor.

Wenn die Agarose vollständig erstarrt ist, werden die Proben in E drei Medium gelagert, indem die Kapillaren mit Plastilin an eine Becherwand geleitet werden, wobei die untere Öffnung in Lösung ist. Montieren Sie nun den Probenhalter. Führe zunächst zwei Plastikhüllen in der richtigen Größe gegeneinander in den Stiel ein.

Die Schlitze an den Ärmeln müssen nach außen zeigen. Befestigen Sie anschließend eine Klemmschraube. Und führen Sie die Kapillare durch die Halterung, bis auf der anderen Seite das schwarze Farbband sichtbar wird.

Vermeiden Sie es, den Kolben zu berühren. Ziehen Sie dann die Klemmschraube fest. Als nächstes drücken Sie einen Zentimeter Agarose aus der Kapillare heraus und schneiden Sie sie ab.

Setzen Sie dann den Stiel in die Probenhalterscheibe ein. Überprüfen Sie vor dem Einlegen der Probendiskette, ob sich der Tisch in der Steuerungssoftware in der obersten Position befindet. Verwenden Sie dann Führungsschienen, um den Halter und die Probe nach unten in das Mikroskop zu gleiten.

Stellen Sie sich nun die ausgewählte Probe vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Datenverarbeitung erfolgt in Figi. Es handelt sich um eine Distribution von ImageJ.

Bevor Sie beginnen, sollte Figi aktualisiert werden. Speichern Sie den erfassten Bilddatensatz in einem einzigen Ordner. Die Zwischendateien der Bildbearbeitung werden im selben Ordner gespeichert.

Starten Sie nun die Multi-View-Rekonstruktionsanwendung. Definieren Sie dann einen neuen Datensatz. Wählen Sie die Option Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats und erstellen Sie einen Namen für die Ausgabedatendatei.

Wählen Sie dann die erste CZI-Datei des Datensatzes aus. Die Metadaten werden automatisch geladen. Überprüfen Sie in den Bildmetadaten, ob die Anzahl der Winkel, die Kanäle, die Beleuchtungen und die Voxelgröße korrekt eingestellt sind.

Wenn Sie auf OK klicken, werden ein Protokollfenster, das Explorer-Fenster zum Einrichten der Ansicht und ein Konsolenfenster geöffnet. Der Explorer zum Einrichten von Ansichten bietet eine benutzerfreundliche Oberfläche. Wählen Sie die Dateien aus, die verarbeitet werden sollen, und drücken Sie die rechte Maustaste.

Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die verschiedenen Verarbeitungsschritte während der Ausführung angezeigt werden. In der oberen rechten Ecke befinden sich die Schaltflächen Info und Speichern. Info zeigt eine Zusammenfassung des Inhalts der gespeicherten Datendatei an, und durch Drücken von Speichern werden die Verarbeitungsergebnisse gespeichert.

Andernfalls speichert das Programm die Ergebnisse der Verarbeitungsschritte nicht. Um den gesamten Datensatz erneut zu speichern, wählen Sie zunächst alle Dateien aus, indem Sie Strg+A drücken und mit der rechten Maustaste klicken. Wählen Sie dann Dataset erneut speichern und Als HDF5 aus.

Anschließend muss eine Bestätigung der erneuten Speicheraktion abgehakt werden. Nach einigen Minuten zeigt das Programm für jeden Zeitpunkt an, wann die erneute Speicherung abgeschlossen ist. Fahren Sie dann mit der Erkennung von Interessenpunkten in den Daten fort.

Wählen Sie alle Zeitpunkte aus, indem Sie Strg+A drücken und mit der rechten Maustaste klicken. Erkennen Sie zum Auswählen Interessenpunkte. Wählen Sie aus den Optionen die Option Gaußsche Differenz aus.

Und wählen Sie Bilder aus, bevor Sie sie segmentieren. Wählen Sie im nächsten Fenster die Erkennungseinstellungen aus. Wählen Sie in den Optionen für die Subpixel-Lokalisierung die Option 3-dimensionale quadratische Anpassung aus.

Wählen Sie dann in der Zinspunktspezifikation die Option Interaktiv aus. Wählen Sie für die Option "Down-Sample XY" die Option "Z-Auflösung anpassen". Und für Down-Sample Z wählen Sie 1x.

Führen Sie dann den Vorgang aus, indem Sie die Option compute on CPU Java auswählen. Wählen Sie im Popup-Fenster eine Ansicht aus, um die Parameter zu testen. Sobald die Ansicht geladen ist, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie Strg+Umschalt+C auf der Tastatur drücken.

Schalten Sie für die Raupenerkennung die Option "Maxima grün" um. Beobachten Sie nun die Segmentierung als grüne Ringe um die Erkennungen. Passen Sie die Gaussien-Differenzwerte für die Parameter Sigma Eins und Schwellenwert an, um die Kügelchen mit einer minimalen Anzahl von falsch positiven Ergebnissen optimal zu segmentieren.

Jede Perle darf nur einmal detektiert werden. Nachdem Sie die optimalen Parameter ermittelt haben, drücken Sie auf Fertig. Nachdem der Computer jede einzelne Ansicht des Zeitpunkts geladen und die Perlen segmentiert hat, gibt das Programm eine Protokolldatei mit der Anzahl der Perlen aus, die es pro Ansicht erkannt hat.

Es sollten zwischen 600 und mehreren tausend Perlen pro Ansicht sein. Andernfalls müssen die Erkennungsparameter angepasst werden. Das ist ein kniffliger Prozess.

Die Erkennungspyramide ist beim ersten Versuch selten genau und die Rücksetzungen können zwischen den Zeitpunkten eines Films variieren. Wenn Sie die Frische entspannen, werden alle echten Kügelchen erkannt und mehr Fehlalarme zugelassen, was hilfreich sein kann. Wenn keine Kombination der Pyramide funktioniert, muss ein neuer Datensatz mit anderen fluoreszierenden Kügelchen aufgenommen werden.

Fahren Sie nun mit der Registrierung der Erkennungen fort und führen Sie eine Multi-View-Dekonvolution aus dem Stack durch. LSFM ist eine ideale Methode, um Entwicklungsprozesse auf mehreren Skalen abzubilden, von interzellulären Strukturen über Zellen bis hin zu ganzen Geweben über lange Zeiträume. Sehr schnelle interzelluläre Ereignisse können mit hoher Auflösung erfasst werden, wie z.B. das Wachstum von Mikrotubuli in Neurovorläuferzellen.

Mit einem einzigen Film ist eine Quantifizierung des Mikrotubuli-Wachstums möglich. Intrazelluläre Strukturen können über viele Stunden verfolgt werden, wie z.B. das Zentrosom in retinalen Ganglienzellen. Das Verhalten einzelner Zellen kann aus Bildern des gesamten Gewebes extrahiert werden, wie z. B. aus der Translokalisierung einer Ganglienzelle auf der Netzhaut.

Die Multi-View-Dekonvolution erzeugt einen isotropen Z-Stapel, indem mehrere verschiedene Ansichten mit der Punktspreizungsfunktion kombiniert werden. Dies führt zu erheblich verbesserten Bildern im Vergleich zu Einzelansichten oder gewichteten durchschnittlichen Fusionen. So kann beispielsweise die Umwandlung des optischen Vesikels in einen optischen Becher anhand von optischen Schnitten in unterschiedlichen Orientierungen anhand des gezeigten Datensatzes untersucht werden.

Darüber hinaus ist die insgesamt gute Bildqualität, auch tief im Inneren des Embryos, offensichtlich. Zum Beispiel bei der Betrachtung der Morphogenese von optischen Bechern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bild von Zebrafischembryonen in einem Lichtblattmikroskop montiert.

Und wie man Multi-View-Datensätze in Figi verarbeitet. Sobald es gemeistert ist, dauert es etwa zwei Stunden, um ein Zeitraffer-Experiment am Lichtblattmikroskop zu starten. Die anschließende Datenanalyse wird deutlich mehr Zeit in Anspruch nehmen.

Es kann von Vorteil sein, für diese Aufgabe einen Computercluster zu verwenden. Weitere praktische Tipps, Ratschläge zur Fehlerbehebung und Links zu anderen Ressourcen finden Sie im Textprotokoll. Im Vorfeld des Experiments muss genügend Speicherkapazität und ein klarer Plan für die Datenverarbeitung zur Verfügung stehen.

Wenn Sie Probleme, Fragen oder zukünftige Wünsche haben, wenden Sie sich bitte an die jeweilige Feature-Website oder Dateiprobleme in den jeweiligen GitHub-Repositories.