Name: Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Augenentwicklung von Zebrafisch-Embryonen mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie hochauflösend abbilden. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung morphogenetischer Prozesse mit geringer Phototoxizität.

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Wir danken Tobias Pietzsch für die Bereitstellung seiner leistungsstarken Open-Source-Software BigDataViewer. Wir danken der Light Microscopy Facility des Max-Planck-Instituts für molekulare Zellbiologie und Genetik (MPI-CBG), namentlich Jan Peychl, Sebastian Bundschuh und Davide Accardi für die technische Unterstützung, die perfekte Wartung der in der Studie verwendeten Mikroskope und für die Kommentare zum Manuskript und H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) für den BigDataServer. Wir danken Julia Eichhorn für die Zusammenstellung von Film 1. Die Mitglieder des Norden-Labors und Svea Grieb gaben viele hilfreiche Kommentare zu dem Manuskript ab. Jaroslav Icha, Christopher Schmied und Jaydeep Sidhaye sind Mitglieder der International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology und Doktoranden an der TU Dresden. Pavel Tomancak wird gefördert durch den ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development und den Human Frontier Science Program Young Investigator Grant RGY0093/2012. Caren Norden wird gefördert durch das Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) [SFB 655, A25].

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Morphogenese ist der Prozess, den Embryo und zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsformen treibt die Ontogenese aus einer befruchteten Eizelle zu einem reifen vielzelligen Organismus. Die morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung der Tiere können durch die Abbildung von intakten lebenden Proben 1-3 analysiert am besten. Dies ist, weil eine solche ganze embryo Abbildungs ​​bewahrt alle Komponenten, die Entwicklung, einschließlich Gradienten von Signalmolekülen, extrazelluläre Matrix, Gefßsystem, Innervation sowie mechanischen Eigenschaften des umgebenden Gewebes treiben und zu regeln. Um die Skalen überbrücken, an der Morphogenese auftritt, haben die schnellen subzelluläre Ereignisse auf eine Minute Zeitskala im Zusammenhang mit der Entwicklung des gesamten Gewebes über Stunden oder Tage erfasst werden. Um all diese Anforderungen zu erfüllen, eine moderne Umsetzung 4 der orthogonalen Ebene Beleuchtung Mikroskop 5 wurde entwickelt. Ursprünglich war es das Selective Plane Illumination Microscopy (SPI benanntM) 4; nun eine allumfassende Begriff Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) wird in der Regel eingesetzt. LSFM ermöglicht Bildgebung mit hoher Zeitauflösung, während Induktion weniger als Phototoxizität Laser - Scanning oder Drehscheiben - konfokale Mikroskope 6,7. Heutzutage gibt es bereits viele Implementierungen der Grundlichtbogen Beleuchtungsprinzip , und es hat 8-11 eine Vielzahl von Proben und Verfahren zur Bild bisher unzugänglichen Forscher verwendet. Wir würden zunächst einige wesentliche Vorteile von LSFM gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Ansätze hervorheben: Um aussagekräftige Ergebnisse aus Live-Bildgebung mikroskopische Experimente zu erwerben, ist es wichtig, dass die Beobachtung nur minimal die Probe beeinflusst. Allerdings sind viele Organismen Zebrabärbling einschließlich sehr anfällig für Laserlicht ausgesetzt werden, ist es schwierig zu Bild machen sie in einem konfokalen Mikroskop mit hoher Zeitauflösung ohne Phototoxizität effekte wie ins Stocken geraten oder Entwicklung 6,7 verzögert. LSFM ist derzeit der Fluoreszenz - Imaging - Technik mit den am wenigsten störenden Auswirkungen auf die Probe 7. Da das dünne Blech Laserlicht nur den Teil der Probe beleuchtet, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird, ist das Lichtblatt-Mikroskop Photonen sehr effizient zu nutzen. Folglich ermöglicht die geringe Lichtbelastung für längere Zeitraffer Beobachtungen von gesünderen Proben, zB 17.12. Darüber hinaus dank der minimalen Invasivität LSFM, die Anzahl der erfassten Bilder wird nicht mehr durch diktiert, wie viel Licht die Probe tolerieren kann, sondern durch, wie viele Daten verarbeitet und gespeichert werden. In die gleiche Richtung von der Probe in der Nähe von physiologischen Bedingungen zu halten, kommt LSFM mit alternativen Probenmontagestrategien gut geeignet für Live-Embryonen. In LSFM Techniken werden die Embryonen typischerweise innerhalb einer dünnen Säule von niedrigen Prozentsatz Agarose eingebettet. Die mounting in Agarose Zylindern ermöglicht die vollständige Rotationsfreiheit, so kann die Probe aus dem perfekten Winkel beobachtet werden (in LSFM als Ansicht bezeichnet) und aus mehreren Ansichten gleichzeitig. Die Multi-View-Bildgebung und die anschließende Multi-View-Fusion ist von Vorteil, besonders für große, Verstreuen Proben und ermöglicht es ihnen, mit hohen, isotropen Auflösung zu erfassen. Eine Zusammenfassung der anderen möglichen LSFM Montagestrategien können im offiziellen Mikroskop Betriebsanleitung zu finden, in dem Kapitel über die Vorbereitung durch das Labor von E. Reynaud geschrieben Probe. Es ist eine Lese empfohlen, insbesondere wenn das Ziel zur Bild verschiedenen Proben als hier beschrieben. Die Bilderfassung in LSFM ist weites Feld, kamerabasierte, als konfokales Mikroskop zu Laser-Scanning-Gegensatz. Dies führt zu einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) für die erfassten Bilder und können sehr schnell (zehn bis hundert Bilder pro Sekunde) betragen. Die hohe Empfindlichkeit von LSFM ermöglicht eine weitere Abbildung von schwach fluoreszierenden samples, wie Transkriptionsfaktoren an die endogenen Spiegel 18 zum Ausdruck gebracht oder in naher Zukunft, endogenen Proteinen unter Verwendung von CRISPR / Cas9 markiert. Die hohe SNR ist auch wichtig für eine erfolgreiche nachgeschalteter Bildanalyse. Die hohe Geschwindigkeit ist nicht erforderlich, nur eine schnelle intrazelluläre Vorgänge zu erfassen, sondern auch auf Bild, um das gesamte Embryo aus mehreren Ansichten schnell genug. Eine nahtlose Verschmelzung der mehreren Ansichten kann nur erreicht werden, wenn das beobachtete Phänomen während der Erfassung dieser verschiedenen z-Stacks nicht aus getrennten Ansichten kommenden ändern. Die Vorteile der LSFM typischerweise nicht auf Kosten der Bildqualität kommen. Die laterale Auflösung von LSFM ist etwas schlechter als die Auflösung eines konfokalen Mikroskops. Dies liegt daran, die Erkennungsziele in LSFM niedrigeren numerischen Apertur verwendet (in der Regel 1,0 oder weniger) im Vergleich zu 1,2-1,3 Wasser oder Silizium Tauchziele auf Standard-konfokalen Setups. Zusätzlich aufgrund der breiten Felderkennung in LSFM (Absence eines Pinholes), gibt es mehr out-of-focus Licht im Vergleich zu einem konfokalen Mikroskop. Die Menge an out-of-focus Licht wird durch die Lichtbogendicke bestimmt. Dennoch werden diese Nachteile durch die höhere SNR in LSFM kompensiert. In der Praxis führt dies in ähnlicher Qualität Bilder im Vergleich zu beispielsweise sich drehende Scheibe konfokalen Nahme 15. Folglich ermöglicht diese zuverlässige Extraktion von Merkmalen wie Zellmembranen oder Zellkerne, beispielsweise für die Zelllinie 15,19 Tracing. Die axiale Auflösung von LSFM bestimmt wird, zusätzlich zu dem Erfassungsziel, durch die Lichtbogendicke. Die axiale Auflösung von LSFM kann in einigen Fällen übertreffen die Auflösung der konfokalen Mikroskope. Zuerst kommt die Verbesserung der Auflösung, wenn die Lichtbogen dünner als die axiale Auflösung des Detektionsziel ist, die typischerweise für große Proben mit geringer Vergrößerung Ziel abgebildet auftritt. Der zweite Weg, wie die LSFM ach kannIEVE bessere axiale Auflösung ist die Multi-View-Fusion, bei der die hohe xy Auflösung von Informationen aus verschiedenen Ansichten in einem Bildstapel kombiniert wird. Die sich ergebende zusammen Stapel weist eine isotrope Auflösung 20,21 die Werte der Auflösung in der seitlichen Richtung nähern. Die Strategie zur Registrierung der mehrere Ansichten auf einander in diesem Artikel beschrieben wird , basiert auf der Verwendung fluoreszierenden Polystyrol - Kügelchen als Treuhänder in der Agarose eingebettete Marker um die Probe 20,21. Als Ergebnis der LSFM Kommerzialisierung Diese Technik ist jetzt zu einer breiten Gemeinschaft von Wissenschaftlern 22 zur Verfügung. Daher ist die Motivation, dieses Protokoll zu schreiben diese Technologie zugänglich Entwicklungsbiologen praktische Erfahrung in LSFM fehlt zu machen und diese Wissenschaftler zu erhalten begonnen mit dieser Technologie mit ihren Proben. Unser Protokoll verwendet das kommerzielle Lichtblatt-Mikroskop, das eine vom Konzept her einfach Mikroskop t darstelltHut ist leicht zu bedienen. Wir möchten zusätzlich andere neue Protokolle zu erwähnen , für die Abbildung Zebrabärbling mit selbstgebauten LSFM Setups, die geeignet sein könnten , insbesondere Fragen 23-25 ​​zu beantworten. Ein weiterer Eintrag Option LSFM sind die offenen Plattformen 26,27, die die Open - Access - Prinzipien verwenden Lichtblatt - Mikroskopie zu einer breiteren Gemeinschaft zu bringen. Die Dokumentation sowohl der Hardware als auch die Software-Aspekte können bei http://openspim.org und https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ finden. In diesem Protokoll verwenden wir das Teleostier Zebrabärbling als Modellsystem Entwicklungsprozesse mit LSFM zu studieren. Morphogenese des Zebrabärbling Auge ist ein Beispiel, das viele der Vorteile von LSFM unterstreicht. LSFM hat bereits in der Vergangenheit verwendet worden 29,30 Augenentwicklung in Medaka 28 und in Zebrabärbling zu untersuchen. In einem frühen Stadium der Entwicklung des Auges ist es kompliziert, den Embryo richtig für konventionelle Mikroskopie zu orientieren,wird als sperrig yolk nicht der Embryo erlauben, auf der Seite mit dem Auge, das Ziel zu liegen gegenüber. Jedoch mit LSFM in eine Agarose-Säule Befestigungs kann die Probe reproduzierbar positioniert werden. Zusätzlich wird während des Übergangs von Augenblase zur Exkavation Stufe erfährt das Auge Haupt morphogenetic durch Wachstum begleitet Umlagerungen, die eine große z-Stack und einen großen Sichtfeld erfordert die Erfassung. Auch für diese Herausforderungen ist LSFM überlegen gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung. Der Prozess der Exkavation Bildung ist dreidimensional, daher ist es schwer, durch Abbilden von einer Ansicht allein zu erfassen und zu visualisieren. Dies macht Multi-View-Bildgebung mit isotropen Auflösung von Vorteil. Nach Augenbecher Bildung, wird die Netzhaut-Laserbelichtung zunehmend empfindlich. Somit ist die geringe Phototoxizität assoziiert mit LSFM ein großer Vorteil für die Langzeitbildgebung. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Bildgebung von ein bis drei Tage alten Zebrafischembryonen einnd Larven mit Schwerpunkt auf der Entwicklung des Auges. Unsere Methode ermöglicht die Aufnahme von Zeitraffer-Filme auf 12-14 h mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verdecken. Wichtig ist, zeigen wir auch eine Pipeline für die Datenverarbeitung, die ein wesentlicher Schritt in LSFM ist, da diese Technik immer große Datensätze erzeugt, die oft im Terabyte-Bereich.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Roth</td><td></td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sigma</td><td>A4018 oder A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat (MESAB/MS-222/Tricain)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm rot fluoreszierende Kügelchen F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l (1&nbsp; mm Innendurchmesser, schwarz markiert) Kapillen</td><td>Marke</td><td>701904</td><td>als Ersatzteil für Transferpettor</td></tr><tr><td>verkauft Teflonspitze Kolben für 20&nbsp; &mu; l Kapillaren</td><td>Marke</td><td>701932</td><td>als Ersatzteil für Transferpettor verkauft</td></tr><tr><td>Runde Glasdeckgläser Durchmesser 18 mm, gewählte Dicke 0,17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-Ringe für Kammerfenster 17&fach; 1,5 mm</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie-Pinzette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock-Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm Verlängerungskabel für die Infusion kompatibel mit Luer-Lock-Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview-Rekonstruktionsanwendung</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview-Rekonstruktions-Anwendungsprobleme</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

mit lichtblatt fluoreszenzmikroskopie bild zebrabärbling augenentwicklung

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) wird als Methode zur Abbildung der Embryonalentwicklung immer beliebter. Die Hauptvorteile von LSFM im Vergleich zu konfokalen Systemen sind die geringe Phototoxizität, die schonenden Einbettstrategien, die schnelle Erfassung mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und die Möglichkeit, Proben aus verschiedenen Blickwinkeln (Ansichten) über lange Zeiträume abzubilden. Die Bildgebung aus mehreren Ansichten entfaltet das volle Potenzial von LSFM, kann aber gleichzeitig Datensätze im Terabyte-Bereich erstellen. Die Verarbeitung solcher Datensätze ist die größte Herausforderung beim Einsatz von LSFM. In diesem Protokoll skizzieren wir einige Lösungen für dieses Problem. Bis vor kurzem wurde LSFM meist in Laboratorien durchgeführt, die über das Know-how verfügten, ihre eigenen Lichtblattmikroskope zu bauen und zu betreiben. In den letzten drei Jahren wurden jedoch mehrere kommerzielle Implementierungen von LSFM verfügbar, die vielseitig einsetzbar und für jeden Entwicklungsbiologen einfach zu bedienen sind. Dieser Artikel richtet sich in erster Linie an diejenigen Forscher, die keine Entwickler von LSFM-Technologien sind, aber LSFM als Werkzeug zur Beantwortung spezifischer entwicklungsbiologischer Fragen einsetzen möchten. 
Hier verwenden wir die Bildgebung der Zebrafischaugenentwicklung als Beispiel, um den Leser in die LSFM-Technologie einzuführen und wir demonstrieren Anwendungen von LSFM über mehrere räumliche und zeitliche Skalen hinweg. Dieser Artikel beschreibt ein vollständiges Versuchsprotokoll, beginnend mit der Montage von Zebrafischembryonen für LSFM. Anschließend skizzieren wir die Möglichkeiten der Bildgebung mit dem kommerziell erhältlichen Lichtblattmikroskop. Wichtig ist, dass wir auch eine Pipeline für die anschließende Registrierung und Fusion von Multiview-Datensätzen unter Verwendung einer Open-Source-Lösung erklären, die als Fiji-Plugin implementiert ist. Während sich dieses Protokoll auf die Bildgebung des sich entwickelnden Zebrafischauges und die Verarbeitung von Daten aus einem bestimmten Bildgebungsaufbau konzentriert, sind die meisten der hier vorgestellten Erkenntnisse und Vorschläge zur Fehlerbehebung von allgemeinem Nutzen und das Protokoll kann an eine Vielzahl von Lichtblattmikroskopie-Experimenten angepasst werden.

LSFM ist eine ideale Methode zur Abbildung von Entwicklungsprozessen über Skalen. Mehrere Anwendungen sind hier zusammengestellt sowohl kurz- als auch langfristige Darstellung von intrazellulären Strukturen, sowie Zellen und ganze Gewebe zeigt. Diese Beispiele zeigen auch , dass LSFM ist ein nützliches Werkzeug in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Auges von Exkavation Bildung Neurogenese in der Netzhaut. Film 1 dient als Illustration der allgemeinen LSFM Ansatz, zuerst eine herausgezoomt , um die Ansicht , die eines intakten Embryo in der Agarose Zylinder in Hellfeld- Einbetten und später eine detaillierte Ansicht der Netzhaut im Fluoreszenzkanal zeigt. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM der Zebrabärbling Retina des LSFM Ansatz Zur Veranschaulichung dieser Film zeigt zunächst in der Hell- , dass der Embryo in der ein intaktes abgebildet wirdgarose Zylinder vor dem Fluoreszenz wechseln. Später wird gezeigt, daß das große Sichtfeld Beobachtung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Als nächstes zeigt der Film einen vergrößerten kleinen Bereich der Netzhaut, die gute subzellulärer Auflösung zu markieren. Ein Ath5: gap-GFP 37 transgenen Zebrafischembryo wurde für die Bildgebung verwendet. Dieses Transgen-Etiketten verschiedene Neuronen in der Netzhaut (hauptsächlich Ganglionzellen und Photoempfänger Grundstoffe). Die Fluoreszenz-Teil des Films wurde als Single-Ansicht mit doppelseitiger Beleuchtung des 40X / 1.0 W-Objektiv mit 5-Minuten-Intervallen mit der Aufnahme erfasst. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Movie 2 zeigt, wie sehr schnelle intrazelluläre Ereignisse mit hoher Auflösung erfasst werden; in diesem Fall wird das Wachstum der Mikrotubuli anihre Plus endet in den retinalen neuronalen Vorläuferzellen. Die Informationen in dem Film enthalten kann für das Tracking und Quantifizierung von Mikrotubuli Plus-Ende Wachstum. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Film 2:. Dynamik der Mikrotubuli in einer einzigen Zelle Dieser Film einfängt wachsenden Plus Spitzen durch das Plus - Spitze Markerprotein EB3-GFP 38 markierte Mikrotubuli. Das Protein wird in einer einzelnen Netzhautvorläuferzelle exprimiert. Die Mikrotubuli wachsen vorwiegend in Richtung von apikal nach basal (von oben nach unten). Die Durchschnittsgeschwindigkeit der EB3 Kometen als 0,28 ± 0,05 &amp; mgr; m / sec gemessen. Der helle Fleck an der apikalen Seite der Zelle hoch Mikrotubuli Nukleation Aktivität zeigt die Zentrosom. EB3-GFP-Plasmid-DNA: Das Wildtyp-Embryo wurde mit Hsp70 injiziert. Der Film wurde 4 h nach Hitzeschock erworben (15 min bei 37 ° C) bei etwa 28 hrpost-Düngeration (HPF) als einer einzigen Ansicht mit einseitiger Beleuchtung Aufzeichnung der Intervalle 63X / 1.0 W objektiv und 1 sec Mal verwenden. Die einzelne Zelle wurde aus einem Sichtfeld für die Mehrheit der Netzhaut abgeschnitten. Die maximale Intensitätsprojektion von zwei Scheiben dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Abbildung 3 zeigt, wie die intrazelluläre Strukturen können über viele Stunden folgen. Hier wird das Zentrosom retinalen Ganglionzellen in Translokationseinheiten (RGC) erfasst. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Zentrosom Lokalisation während der retinaler Ganglionzellen Translokation Diese Montage eines Zeitraffer-Experiment zeigt die Position des Zentrosom in der gesamten retinaler Ganglionzellen (RGC) Reifung.In den neuronalen Vorläufern wird der Zentrosomen in der Spitze des apikalen Verfahren (01.00) lokalisiert. Während der Zellteilung dienen die beiden Zentrosomen als Pole für die mitotische Spindel (02.25). Diese Aufteilung führt zu einer Tochterzelle, die in ein RGC und eine zweite Tochterzelle unterscheidet, die eine Sehzellen Vorläufer wird. Nach der Teilung transloziert die Zellkörper der RGC auf die basale Seite der Netzhaut, während die apikale Prozess an der apikalen Seite befestigt bleibt. Sobald die RGC die basale Seite erreicht, löst seine apikal Prozess und das Zentrosom reist mit ihm (6,15). Das Zentrosom kann gefolgt werden, während nach und nach mit dem apikal Prozess (06.50, 07.20, 08.10) Einfahren zusammen. Im letzten Rahmen (8.55) die Ganglionzellen ein Axon von seinem basalen Seite wächst, während der Zentrosomen noch apikal lokalisiert ist. Das Mosaik-Expression wurde durch Plasmid-DNA-Injektion in Wildtyp-Embryo in einem Zell-Stadium erreicht. GFP-CAAX (grün) const: Die Zellen werden durch die Ath5 visualisiertein- em, die RGCs und anderen Neuronen Etiketten. Die Zentrosomen (Pfeilspitzen) sind je nach Centrin-tdTomato 29 Ausdruck (magenta) markiert. Der apikalen Seite der Netzhaut ist an der Oberseite des Bildes und der basalen Seite an der Unterseite. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 Stunden nach der Befruchtung (HPF). Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Leicht verfolgt und seine apikalen und basalen Prozess werden kann In 4 es angezeigt wird, wie einzelne Zellverhalten von Daten extrahiert werden kann , das ganze Gewebe wie in Movie 1. Translokation eines RGC Erfassunges folgte. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Translokation eines einzelnen retinaler Ganglionzellen Die RGC Translokation von apikal basalen Seite der Retina tritt nach dem Anschluss der Mitose wie in Abbildung 3 beschrieben Die RGC durch die Expression des Ath5 markiert ist. Spalt-GFP 37 Transgen. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 HPF. Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 5 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 5 zeigt die Fähigkeit von Multi - View - LSFM zu erfassen Gewebe scAle morphogenetischen Prozesse mit zellulärer Auflösung am Beispiel der Augenbecher Morphogenese, bei der Augenblase in eine Exkavation verwandelt. Die Bildqualität kann erheblich durch Multi-View-Bildgebung verbessert werden, wenn das endgültige Bild von den Informationen aus 5 verschiedenen Ansichten (in diesem Fall) in einem z-Stack mit isotropen Auflösung kombiniert wird. Diese Abbildung zeigt die Verbesserung der Bildqualität nach dem gewichteten Durchschnitt der Fusion und weitere Verstärkung in den Bildkontrast und die Auflösung nach dem Multi-View-Entfaltungs. Die Abbildung zeigt zwei optische Scheiben in unterschiedlichen Orientierungen durch den Datensatz. Zusätzlich ist eine Montage aus dem entfalteten-Datensatz zeigt die Exkavation Morphogenese im Laufe der Zeit. Alle Zeitpunkte werden dann in Movie 3 gezeigt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Abbildung 5: Vergleich der Bildqualität zwischen den einzelnen Ansicht und zwei Methoden der multiview Fusion. (A) Eine optische Scheibe einzigen Ansicht Daten gezeigt von Seitenansicht und (B) dorsale Ansicht. Streifenartefakten und Verschlechterung des Signals tiefer in der Probe sind offensichtlich. Auch ein Teil des Bildes sichtbar in den verschmolzenen Daten (CF) wurde in diesem besonderen Ansicht nicht erfasst. (C) Das gleiche optische Scheibe, die nun als Multi - View - fusionierten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (D) dorsale Ansicht. Beachten Sie, dass Streifen Artefakte unterdrückt und Strukturen tief in der Probe vorhanden sind besser gelöst. (E) die gleiche optische Scheibe nun als Multi - View - entfalteten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (F) dorsale Ansicht. Beachten Sie die erhöhten Kontrast und Auflösung, so dass die einzelnen Zellmembranen und Kerne können gut unterschieden werden. Die Auflösung verschlechtert sich nicht deutlich tiefer in die Probe. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben auseinander etwa 20 Grad. Die z-Stapel abaus 100 &amp; mgr; m mit 1,5 &amp; mgr; m Schrittgrße wurden mit dem 20X / 1.0 W Ziel 10 Stunden bei jeder Ansicht in 10 min Intervallen erfasst. Eingabebilder für die Multi-View-Fusion und Entfaltungs wurden um 2 × abgetastet, um die Bildverarbeitung zu beschleunigen. 15 Iterationen des Multi-View-Entfaltungs wurden durchgeführt. (G) Die Montage zeigt einen beschnittenen Bereich der dorsalen Ansicht von den entfalteten Daten die morphogenetischen Ereignisse während der frühen Entwicklung des Auges aus der Augenblase in die Augenbecher Bühne zu markieren. Die beiden Schichten des optischen Vesikel, die zunächst ähnliche säulen Epithelien sind, differenzieren sich in verschiedenen Zellpopulationen. Die distale Schicht nahe der Epidermis wird die retinale neuroepithelium (RN) und der proximalen Schicht nahe dem Neuralrohr wird die retinalen Pigmentepithel (RP). Die Zellen in der RN länglichen und invaginate der Augenbecher (1.40 bis 5.00) zu bilden; zugleich flachen die RP-Zellen. Die Oberfläche Ektoderm induziert eine Linse (01.40) zu bilden, which stülpt später (05.00). Der Film beginnt bei 17 HPF. mm: Die Zeit wird im hh. Alle Zellmembranen werden durch den β-Actin-markiertem: ras-GFP-Transgen und alle Kerne gekennzeichnet sind durch die hsp70: H2B-RFP-Transgen. Maßstabsbalken entspricht 30 &amp; mgr; m. FB Vorderhirns, LE - Objektiv, OP olfaktorischen Plakode, RN retinalen neuroepithelium, RP retinalen Pigmentepithel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Augenbecher Morphogenese mit Einzelansicht und zwei Methoden der Multi - View - Fusion gezeigt Die Zeitraffer-Film zeigt den kompletten Prozess der Augenbecher Morphogenese von der Augenblase in die Augenbecher Bühne.. Es zeigt eine einzige optische Scheibe aus der Seitenansicht (oben) und eine einzige optische Scheibe von der dorsalen Ansicht (unten). Die Zellen des sich entwickelnden Augenblase unterziehen komplexe Umlagerungen schließlich mit der inneren retinalen neuroepithelium und äußeren retinalen Pigmentepithel der hemisphärischen Exkavation bilden. Eine Linse wird von der Oberfläche Ektoderm gebildet. Es stülpt mit dem neuroepithelium entlang und sitzt in der Augenbecher. ras-GFP (grün) Transgen und die Kerne sind beschriftet mit hsp70: H2B-RFP (magenta) alle Zellmembranen werden durch die Expression des β-Actin-markiert. Der Film beginnt bei rund 17 HPF. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben etwa 20 Grad auseinander und az Stapel von etwa 100 &amp; mgr; m alle 10 Minuten mit dem 20X / 1.0 W Ziel erworben wurden. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, die Augenentwicklung des Zebrafischembryos im Lichtblattmikroskop abzubilden und den erfassten Multiview-Datensatz in Figi über das Multiview-Rekonstruktionsanwendungs-Plug-in zu verarbeiten. Diese Methode kann Ihnen helfen, morphogenetische Vorgänge in der Tierentwicklung zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Sie morphogenetische Vorgänge im sich entwickelnden Embryo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung beobachten können.Der große Vorteil der Lichtblattmikroskopie sind die geringe Phototoxizität der Methode, das schnelle Erfassungszeitpunkt, mit dem Sie die Probe abbilden können und dass Sie die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln, sogenannten Ansichten, abbilden können. Die Erfassung der Probe aus verschiedenen Ansichten ermöglicht es uns, die Verschlechterung des Signals und der eingestellten Achse zu überwinden. Diese verschiedenen Bilder können dann verwendet und mit fluoreszierenden Mikrokügelchen um die Probe herum registriert werden.Wir können das dreidimensionale Volumen rekonstruieren und dabei die isotrope Auflösung erreichen. Obwohl wir den Einsatz der Lichtblatt-Fluorensenzmikroskopie für die Entwicklung von Zebrafischaugen demonstrieren, kann diese Methode auch zur Beantwortung verschiedener Fragen in der Entwicklungsbiologie und den Neurowissenschaften anhand verschiedener Modellorganismen verwendet werden. Schrauben Sie zunächst das Detektionsobjektiv in das Mikroskop, während Sie die Beleuchtungsobjektive abgedeckt halten.Lösen Sie dann die Kappe der Objektive und schieben Sie die Probenkammer vorsichtig in das Mikroskop. Sichern Sie die Kammer, indem Sie die Schraube festziehen. Verbinden Sie dann den Temperaturfühler und den Peltierblock mit dem Mikroskop.Die beiden Rohre, die die Kühlflüssigkeit für den Peltierblock zirkulieren lassen, sind mit beiden Anschlüssen kompatibel und können in beiden Richtungen arbeiten. Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um die Kammer durch die Spritze mit Lösung bis zur Oberkante der Kammerfenster zu füllen, und prüfen Sie, ob sie undicht sind. Schalten Sie nun das Mikroskop, den Computer und die Inkubation ein.Starten Sie die Bediensoftware des Mikroskops und stellen Sie die Inkubationstemperatur auf 28,5 Grad Celsius ein. Während die Temperatur eine Stunde lang anhält, bereiten Sie die Probe vor. Beginnen Sie mit der Zubereitung der Agarose.Schmelzen Sie ein vorbereitetes ein Milliliter Aliquot von 1%niedriger Schmelzpunkt Agarose in E drei Medium bei 70 Grad Celsius. Nach etwa 15 Minuten werden 600 Mikroliter geschmolzene Agarose in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 250 Mikroliter E drei Medium, 50 Mikroliter 0,4 %iges MS 222 und 25 Mikroliter Vortex-Fluoreszenzkugellösung hinzugefügt. Legen Sie das Röhrchen in einen Heizblock bei etwa 39 Grad Celsius, damit sich die Agarose ihrem Gelierpunkt nähert.Schieben Sie dann die mit Teflon bestückten Kolben bis zum Boden der Glaskapillaren mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter nach unten. Bereiten Sie fünf davon vor. Wirbeln Sie nun kurz die Agarosemischung vor und übertragen Sie dann fünf Embryonen mit der minimalen Menge Flüssigkeit hinein.Führen Sie dann eine Kapillare ein und aspirieren Sie einen Embryo mit dem Kopf voran. Der Kopf muss vor dem Schwanz eintreten und es dürfen keine Luftblasen entstehen. Ziehen Sie so viel Lösung auf, dass sich etwa zwei Zentimeter Agarose über dem Embryo und ein Zentimeter Agarose darunter befindet.Ziehen Sie einen Embryo in jede Kapillare, bevor Sie fortfahren. Dieser Schritt erfordert etwas Übung, um ihn zu meistern. Bereiten Sie sich mit nicht wertvollen Embryonen darauf vor.Wenn die Agarose vollständig erstarrt ist, werden die Proben in E drei Medium gelagert, indem die Kapillaren mit Plastilin an eine Becherwand geleitet werden, wobei die untere Öffnung in Lösung ist. Montieren Sie nun den Probenhalter. Führe zunächst zwei Plastikhüllen in der richtigen Größe gegeneinander in den Stiel ein.Die Schlitze an den Ärmeln müssen nach außen zeigen. Befestigen Sie anschließend eine Klemmschraube. Und führen Sie die Kapillare durch die Halterung, bis auf der anderen Seite das schwarze Farbband sichtbar wird.Vermeiden Sie es, den Kolben zu berühren. Ziehen Sie dann die Klemmschraube fest. Als nächstes drücken Sie einen Zentimeter Agarose aus der Kapillare heraus und schneiden Sie sie ab.Setzen Sie dann den Stiel in die Probenhalterscheibe ein. Überprüfen Sie vor dem Einlegen der Probendiskette, ob sich der Tisch in der Steuerungssoftware in der obersten Position befindet. Verwenden Sie dann Führungsschienen, um den Halter und die Probe nach unten in das Mikroskop zu gleiten.Stellen Sie sich nun die ausgewählte Probe vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Datenverarbeitung erfolgt in Figi. Es handelt sich um eine Distribution von ImageJ.Bevor Sie beginnen, sollte Figi aktualisiert werden. Speichern Sie den erfassten Bilddatensatz in einem einzigen Ordner. Die Zwischendateien der Bildbearbeitung werden im selben Ordner gespeichert.Starten Sie nun die Multi-View-Rekonstruktionsanwendung. Definieren Sie dann einen neuen Datensatz. Wählen Sie die Option Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats und erstellen Sie einen Namen für die Ausgabedatendatei.Wählen Sie dann die erste CZI-Datei des Datensatzes aus. Die Metadaten werden automatisch geladen. Überprüfen Sie in den Bildmetadaten, ob die Anzahl der Winkel, die Kanäle, die Beleuchtungen und die Voxelgröße korrekt eingestellt sind.Wenn Sie auf OK klicken, werden ein Protokollfenster, das Explorer-Fenster zum Einrichten der Ansicht und ein Konsolenfenster geöffnet. Der Explorer zum Einrichten von Ansichten bietet eine benutzerfreundliche Oberfläche. Wählen Sie die Dateien aus, die verarbeitet werden sollen, und drücken Sie die rechte Maustaste.Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die verschiedenen Verarbeitungsschritte während der Ausführung angezeigt werden. In der oberen rechten Ecke befinden sich die Schaltflächen Info und Speichern. Info zeigt eine Zusammenfassung des Inhalts der gespeicherten Datendatei an, und durch Drücken von Speichern werden die Verarbeitungsergebnisse gespeichert.Andernfalls speichert das Programm die Ergebnisse der Verarbeitungsschritte nicht. Um den gesamten Datensatz erneut zu speichern, wählen Sie zunächst alle Dateien aus, indem Sie Strg+A drücken und mit der rechten Maustaste klicken. Wählen Sie dann Dataset erneut speichern und Als HDF5 aus.Anschließend muss eine Bestätigung der erneuten Speicheraktion abgehakt werden. Nach einigen Minuten zeigt das Programm für jeden Zeitpunkt an, wann die erneute Speicherung abgeschlossen ist. Fahren Sie dann mit der Erkennung von Interessenpunkten in den Daten fort.Wählen Sie alle Zeitpunkte aus, indem Sie Strg+A drücken und mit der rechten Maustaste klicken. Erkennen Sie zum Auswählen Interessenpunkte. Wählen Sie aus den Optionen die Option Gaußsche Differenz aus.Und wählen Sie Bilder aus, bevor Sie sie segmentieren. Wählen Sie im nächsten Fenster die Erkennungseinstellungen aus. Wählen Sie in den Optionen für die Subpixel-Lokalisierung die Option 3-dimensionale quadratische Anpassung aus.Wählen Sie dann in der Zinspunktspezifikation die Option Interaktiv aus. Wählen Sie für die Option "Down-Sample XY" die Option "Z-Auflösung anpassen". Und für Down-Sample Z wählen Sie 1x.Führen Sie dann den Vorgang aus, indem Sie die Option compute on CPU Java auswählen. Wählen Sie im Popup-Fenster eine Ansicht aus, um die Parameter zu testen. Sobald die Ansicht geladen ist, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie Strg+Umschalt+C auf der Tastatur drücken.Schalten Sie für die Raupenerkennung die Option "Maxima grün" um. Beobachten Sie nun die Segmentierung als grüne Ringe um die Erkennungen. Passen Sie die Gaussien-Differenzwerte für die Parameter Sigma Eins und Schwellenwert an, um die Kügelchen mit einer minimalen Anzahl von falsch positiven Ergebnissen optimal zu segmentieren.Jede Perle darf nur einmal detektiert werden. Nachdem Sie die optimalen Parameter ermittelt haben, drücken Sie auf Fertig. Nachdem der Computer jede einzelne Ansicht des Zeitpunkts geladen und die Perlen segmentiert hat, gibt das Programm eine Protokolldatei mit der Anzahl der Perlen aus, die es pro Ansicht erkannt hat.Es sollten zwischen 600 und mehreren tausend Perlen pro Ansicht sein. Andernfalls müssen die Erkennungsparameter angepasst werden. Das ist ein kniffliger Prozess.Die Erkennungspyramide ist beim ersten Versuch selten genau und die Rücksetzungen können zwischen den Zeitpunkten eines Films variieren. Wenn Sie die Frische entspannen, werden alle echten Kügelchen erkannt und mehr Fehlalarme zugelassen, was hilfreich sein kann. Wenn keine Kombination der Pyramide funktioniert, muss ein neuer Datensatz mit anderen fluoreszierenden Kügelchen aufgenommen werden.Fahren Sie nun mit der Registrierung der Erkennungen fort und führen Sie eine Multi-View-Dekonvolution aus dem Stack durch. LSFM ist eine ideale Methode, um Entwicklungsprozesse auf mehreren Skalen abzubilden, von interzellulären Strukturen über Zellen bis hin zu ganzen Geweben über lange Zeiträume. Sehr schnelle interzelluläre Ereignisse können mit hoher Auflösung erfasst werden, wie z.B. das Wachstum von Mikrotubuli in Neurovorläuferzellen.Mit einem einzigen Film ist eine Quantifizierung des Mikrotubuli-Wachstums möglich. Intrazelluläre Strukturen können über viele Stunden verfolgt werden, wie z.B. das Zentrosom in retinalen Ganglienzellen. Das Verhalten einzelner Zellen kann aus Bildern des gesamten Gewebes extrahiert werden, wie z. B. aus der Translokalisierung einer Ganglienzelle auf der Netzhaut.Die Multi-View-Dekonvolution erzeugt einen isotropen Z-Stapel, indem mehrere verschiedene Ansichten mit der Punktspreizungsfunktion kombiniert werden. Dies führt zu erheblich verbesserten Bildern im Vergleich zu Einzelansichten oder gewichteten durchschnittlichen Fusionen. So kann beispielsweise die Umwandlung des optischen Vesikels in einen optischen Becher anhand von optischen Schnitten in unterschiedlichen Orientierungen anhand des gezeigten Datensatzes untersucht werden.Darüber hinaus ist die insgesamt gute Bildqualität, auch tief im Inneren des Embryos, offensichtlich. Zum Beispiel bei der Betrachtung der Morphogenese von optischen Bechern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bild von Zebrafischembryonen in einem Lichtblattmikroskop montiert.Und wie man Multi-View-Datensätze in Figi verarbeitet. Sobald es gemeistert ist, dauert es etwa zwei Stunden, um ein Zeitraffer-Experiment am Lichtblattmikroskop zu starten. Die anschließende Datenanalyse wird deutlich mehr Zeit in Anspruch nehmen.Es kann von Vorteil sein, für diese Aufgabe einen Computercluster zu verwenden. Weitere praktische Tipps, Ratschläge zur Fehlerbehebung und Links zu anderen Ressourcen finden Sie im Textprotokoll. Im Vorfeld des Experiments muss genügend Speicherkapazität und ein klarer Plan für die Datenverarbeitung zur Verfügung stehen.Wenn Sie Probleme, Fragen oder zukünftige Wünsche haben, wenden Sie sich bitte an die jeweilige Feature-Website oder Dateiprobleme in den jeweiligen GitHub-Repositories.

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt die Probenvorbereitung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Es demonstriert auch eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung, die die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht.

Probenvorbereitung für die Lichtblattmikroskopie: Einbetten lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von...

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Erfahren Sie, wie Sie die Augenentwicklung von Zebrafisch-Embryonen mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie hochauflösend abbilden. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung morphogenetischer Prozesse mit geringer Phototoxizität.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

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