Transmissionselektronenmikroskopie zur Quantifizierung der Glykogenverteilung in der menschlichen Skelettmuskulatur

Glykogen, ein verzweigtes Glukosepolymer, ist eine Energiereserve in subzellulären intermyofibrillären, intramyofibrillären und subsarkolemmalen Kompartimenten innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur.

Um die subzelluläre Glykogenverteilung mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu quantifizieren, wird isoliertes menschliches Skelettmuskelgewebe gewonnen. Mit Glutaraldehyd fixieren, um die Gewebestruktur zu erhalten. Das Gewebe wird nach dem Fixieren in einer Osmiumtetroxid- und Kaliumferrocyanidlösung fixiert.

Der reduzierte Osmium-Ferrocyanid-Komplex bindet an die Hydroxylgruppen im Glykogen und verbessert so den Kontrast der Glykogenpartikel im Muskel. Zusätzlich werden Membranen und sarkoplasmatisches Retikulum – ein membrangebundenes Organell – gefärbt.

Dehydrieren Sie das Gewebe bei steigenden Ethanolkonzentrationen. In Harz einbetten und einen festen Block bilden. Erhalten Sie ultradünne Schnitte mit längsorientierten Muskelfasern; Übertragung auf TEM-Gitter.

Tauchen Sie die Gitter in Uranylacetat, Schwermetalllösung. Uranyl-Ionen binden an negativ geladene Lipide und Proteine und machen sie elektronendicht. Mit Bleicitratlösung färben.

Blei-Ionen binden an die Osmium-gefärbten Regionen, einschließlich der Glykogenpartikel, und verstärken so den Kontrast. Sie binden auch an Uranylacetat-umgesetzte Regionen, wodurch die Elektronentrübung verstärkt wird.

Während der TEM-Bildgebung, wenn Elektronenstrahlen das Gewebe durchdringen, streuen gefärbte elektronendichte Bereiche, einschließlich Glykogen, mehr Elektronen, während ungefärbte Bereiche Elektronen übertragen.

In dem kontrastreichen TEM-Bild erscheinen Glykogenpartikel deutlich und dunkel, ungefärbte Regionen erscheinen heller, was die Visualisierung und Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung im Muskel erleichtert.