Variationen auf negativ Färben Elektronenmikroskopie Methoden: Werkzeuge für die Bekämpfung der anspruchsvolle Systeme

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, verschiedene Variationen von Techniken zur Vorbereitung von Elektronenmikroskopieproben mit negativer Färbung zu demonstrieren. Die negative Färbung ist der beste Weg, um die Qualität einer EM-Probe schnell zu beurteilen. Es ist wichtig zu erkennen, dass verschiedene Gittervorbereitungstechniken für einige Proben besser funktionieren.

Die Technik, die für eine bestimmte Probe am besten geeignet ist, muss durch Versuch und Irrtum bestimmt werden. Bereiten Sie zunächst die EM-Gitter mit der Kohlenstoffblattmethode vor und bereiten Sie die negativen Färbereagenzien vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie ein mit Kohleblech beschichtetes EM-Gitter mit der Vorderseite nach oben auf einen Objektträger.

Setzen Sie den Objektträger in eine Glimmentladungseinheit ein und behandeln Sie das Gitter mindestens 30 Sekunden lang bei 10 Milliampere, um das Gitter hydrophil zu machen. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Probe aus der Entleerungseinheit. Greife dann mit einer Unterdruckpinzette den Rand des Gitters.

Um mit der Side-Blot-Methode zu färben, tragen Sie zunächst drei bis fünf Mikroliter der Probe auf die Auflagefläche auf. Lassen Sie die Probe 10 Sekunden bis eine Minute lang an der Gitteroberfläche adsorbieren, berühren Sie dann den Rand des Gitters mit einem Blatt Filterpapier und lassen Sie die Kapillarwirkung die Flüssigkeit abziehen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Reinstwasser oder eine geeignete flüchtige Pufferlösung auf ein Blatt Laborfolie.

Berühren Sie vorsichtig die Carbonoberfläche des Gitters mit dem Tropfen und heben Sie ein kleines Tröpfchen auf die Oberfläche des Gitters ab. Berühren Sie dann den Rand des Gitters mit einem Blatt Filterpapier und lassen Sie die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung abziehen. Geben Sie anschließend zwei 50-Mikroliter-Tropfen Färbereagenz auf ein Blatt Laborfolie.

Berühren Sie vorsichtig die Carbonoberfläche des Gitters mit dem Tropfen und heben Sie ein kleines Tröpfchen auf die Oberseite des Gitters ab. Wenn der Fleck auf die Rückseite des Gitters wandert, ist der Kohlenstofffilm aufgebrochen und muss entsorgt werden. Berühren Sie nach 10 bis 15 Sekunden den Rand des Gitters mit einem Blatt Filterpapier und lassen Sie die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung abziehen.

Wiederholen Sie diesen Färbeschritt noch einmal und lassen Sie das Gitter dann an der Luft trocknen. Um die Probe mit der Flicking-Methode zu färben, fassen Sie den Rand des Gitters mit einer Unterdruckpinzette und tragen Sie drei bis fünf Mikroliter Probe auf die Auflagefläche auf. Halten Sie die Pinzette in einer Hand, winkeln Sie das Gitter so an, dass es in einem Winkel von etwa 45 Grad steht, und schnippen Sie schnell mit dem Handgelenk, um den größten Teil des Tröpfchens abzuschnippen, das sich oben auf dem Gitter befindet.

Tragen Sie dann mit einer Pasteur-Glaspipette einen Tropfen Waschlösung auf die Auflagefläche auf. Streichen Sie den Tropfen ab und wiederholen Sie den Vorgang einige Male, um die Probe zu waschen. Tragen Sie anschließend einen Tropfen Färbereagenz auf die Trägeroberfläche auf und schnippen Sie das Tröpfchen erneut ab.

Wiederholen Sie diesen Färbeschritt ein- bis dreimal, je nachdem, welche Färbetiefe für die Visualisierung der Probe erforderlich ist. Entfernen Sie überschüssigen Fleck, indem Sie die abgerissene Kante eines Stücks Filterpapier mit der Kante des Gitters berühren und dann das Gitter an der Luft trocknen lassen. Um die Probe mit der Schnellspülmethode zu färben, ziehen Sie zunächst 30 bis 70 Mikroliter Fleck in die Spitze einer 200-Mikroliter-Pipette.

Drehen Sie den Lautstärkeregler, um fünf Mikroliter Luft anzusaugen, dann fünf bis 30 Mikroliter des Waschreagenzes aufzusaugen, gefolgt von einem weiteren kleinen Luftspalt, bevor weitere fünf Mikroliter Probe entnommen werden. Fassen Sie den Rand eines Gitters mit einer Unterdruckpinzette und winkeln Sie das Gitter etwa 45 Grad nach Weg. Werfen Sie mit einer schnellen Bewegung den gesamten Inhalt der Pipettenspitze über die Oberfläche des kohlenstoffbeschichteten EM-Gitters aus.

Entfernen Sie überschüssigen Fleck, indem Sie den abgerissenen Rand eines Stücks Filterpapier mit dem Rand des Gitters berühren und das Gitter an der Luft trocknen lassen. Die ideale Wahl für eine negative Färbung ist stark probenabhängig. Der am häufigsten verwendete Fleck ist Uranylacetat, aber auch Lanthanid-Flecken können verwendet werden.

Bei tief eingebetteten Proben erzeugten Färbungen auf Lanthanidbasis, Thuliumacetat und Erbiumacetat, eine Negativfärbung von gleichwertiger Qualität wie Uranylacetat, gemessen am scheinbaren Kontrast und der Schärfe der gefärbten Partikel, wobei Thuliumacetat klarere und schärfere Bilder erzeugte als Erbiumacetat. Die große Korngröße von Thuliumacetat wird bei hoher Vergrößerung deutlich, hier gezeigt, als eine Probe von Tabakmosaik-Faserpartikeln mit 1%thuliumacetat gefärbt wurde. Bei Verwendung von Thuliumacetat ist der 23-Angström-Rapport des Tabakmosaik-Faserpartikels mit dem Auge deutlich sichtbar.

Keiner der anderen getesteten Lanthanidflecken war in der Lage, dieses Merkmal zu beheben. Eine weitere schwer abzubildende Probe ist das aus Muskeln gewonnene C-Protein. Diese Probe erzeugt je nach Färbemethode deutlich unterschiedliche Bilder.

Wenn es mit einer Side-Blot-Methode gefärbt wird, erscheint es als kugelförmige, kollabierte, flügelartige Struktur. Wenn Gitter mit der Flicking-Methode präpariert werden, wird das C-Protein als eine Reihe von Domänen beobachtet, die Kügelchen auf einer Schnur ähneln. Dies stellt die tatsächliche C-Proteinstruktur besser dar.

Einmal gemeistert, dauert es nur etwa eine Minute, um eine negativ gefärbte Probe vorzubereiten. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Probe unterschiedlich auf jede Färbetechnik reagiert. Bei neuen Proben muss der beste Ansatz experimentell ermittelt werden.

Vergessen Sie nicht, dass Uranyl-Färbereagenzien giftig und leicht radioaktiv sind. Stellen Sie sicher, dass sie in einem ordnungsgemäßen Abfallstrom entsorgt werden.