Quantifizierung der Membrankräuselbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Externe Stimulatoren aktivieren Zellen und induzieren eine dreidimensionale zirkuläre Membranvorwölbung oder Membrankräuselbildung, die für verschiedene zelluläre Aktivitäten unerlässlich ist.

Um die Bildung von Membrankräuseln zu visualisieren, beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die an der Basis ein Deckglas enthält. Auf der Oberseite des Deckglases befinden sich kultivierte Makrophagen.

Behandeln Sie diese Makrophagen mit Stimulatormolekülen, die die Zellen aktivieren und die Reorganisation des Zytoskeletts und die Bildung von Membranvorsprüngen erleichtern. Überlagern Sie die Zellen mit einer Fixierlösung, vernetzen Sie die Proteine und bewahren Sie die Zellstruktur.

Behandeln Sie die fixierten Makrophagen mit steigenden Alkoholkonzentrationen für eine vollständige Dehydratisierung. Trocknen Sie diese Makrophagen mit einem Trockner an kritischen Punkten aus und entfernen Sie alle Spuren von Wasser für eine bessere Bildgebung.

Befestigen Sie das Deckglas mit leitfähigem Klebeband auf einem Rasterelektronenmikroskopie-Probenhalter (REM). Sputtern überziehen das Makrophagen-haltige Deckglas mit einer dünnen Metallschicht, die eine gute elektronische Leitfähigkeit während der Bildgebung gewährleistet.

Legen Sie das Deckglas in die REM-Kammer. Fokussieren Sie den Elektronenstrahl auf das Deckglas. Der Elektronenstrahl trifft auf die Membran des metallbeschichteten Makrophagen und bewirkt eine niederenergetische Sekundärelektronenbildung von der Membranoberfläche.

Die dreidimensionalen Vorsprünge streuen Elektronen anders als der Rest der Membran, wodurch diese Merkmale auf der Zelloberfläche hervorgehoben werden. Der Detektor sammelt die gestreuten Elektronen aus verschiedenen Zelloberflächenregionen und erzeugt so ein Kontrastbild.

Auf dem REM-Bild erscheinen Makrophagen dunkler mit hellen kreisförmigen Vorsprüngen auf der Oberfläche, was die Kräuselungsbildung bestätigt.