Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopische Analysen sind häufig komplex. Wir glauben, dass unser Protokoll die Verarbeitung und Erfassung der EM-Daten von der großen Probenoberfläche und dem Zwischenvolumen erleichtert. Unser Protokoll hilft, Zielstrukturen in seriellen Abschnitten zu finden.

Die Datenaufzeichnung beschränkt sich auf das Notwendige. Im Vergleich zur Datenerfassung in ganzgewebten Blöcken wird die Aufnahmezeit reduziert und die Datenanalyse erleichtert. Angesichts der allgemeinen Leichtigkeit des Ansatzes glauben wir, dass er nicht nur für wissenschaftliche Fragen, sondern auch als diagnostisches Instrument verwendet werden kann.

Um ein Array für die Analyse zu erzeugen, klemmen Sie zuerst die Probe auf einen Ultramikrotomhalter und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Harz um die Probe herum grob zu trimmen. Verwenden Sie ein Diamantschneidwerkzeug, um die Probe fein zu trimmen, und verwenden Sie Trimmmesser mit einer Neigung von 20 oder 90 Grad, um sicherzustellen, dass die Ober- und Unterseite des Blocks parallel zur Schneide des Messers verlaufen. Mischen Sie Xylol und Kleben in einem Verhältnis von 3: 1 und verwenden Sie eine Wimper, die an einem Zahnstocher befestigt ist, um die Mischung auf die Ober- und Unterkante des zugeschnittenen Blocks aufzutragen.

Während die Mischung trocknet, verwenden Sie ein Wafer-Spaltwerkzeug, um ein Stück Wafer auf die für die Analyse geeignete Größe zu schneiden. Reinigen Sie den Wafer in destilliertem Wasser, um alle Ablagerungen wegzuspülen, und reinigen Sie die Oberfläche mit Plasma, nachdem der Wafer getrocknet ist. Um ein Array-Tomographiemesser vorzubereiten, verwenden Sie schaumiges Klebeband, um eine Nadel am Boden eines Histo-Jumbo-Messers zu befestigen, und legen Sie das Messer bei null Grad in den Ultramikrotomhalter.

Stellen Sie die Schneide des Messers parallel zur Blockoberfläche ein und bringen Sie den beschnittenen Block in einer schnittbereiten Position an den Rand des Messers. Legen Sie die saubere Waffel in das Messerbecken und füllen Sie das Becken mit Wasser auf die gleiche Höhe wie die Messerkante, dann lassen Sie die Diamantkante des Messers richtig befeuchten, indem Sie die angebrachte Spritze verwenden, um wasser nach Bedarf hinzuzufügen oder zu entnehmen. Stellen Sie für das Array-Schneiden das Mikrotom auf einen Schnittbereich von 50 bis 100 Nanometern und eine Schnittgeschwindigkeit von 6 bis 1 Millimeter pro Sekunde ein und beginnen Sie mit dem Schneiden, um ein Band zu erhalten, das lang genug ist, um ein zielgerichtetes Z-Volumen abzudecken.

Abhängig von der Blockgröße, der Homogenität des Gewebes und der Art des Harzes ist das Band ungefähr gerade. Verwenden Sie eine saubere, nicht klebrige Wimpernspitze, um die Bänder von der Messerkante zu lösen. Verwenden Sie die Wimpern, um das Band vorsichtig in die Mitte des Trägermediums zu bewegen.

Chloroform oder ein Heizstift kann verwendet werden, um den Abschnitt bei Bedarf zu dehnen. Ziehen Sie nach dem Dehnen die Spritze ein, um das Wasser abzulassen. Für empfindlichere Bänder oder ein langsameres Zurückziehen des Wassers lösen Sie die Spritze vom Schlauch, damit das Wasser tropfen kann.

Wenn der Wasserstand den Waferstand erreicht hat, drücken Sie das Band vorsichtig in die Mitte des Beckens und lassen Sie weiter abtropfen, bis das gesamte verbleibende Wasser vollständig aus dem Becken entfernt ist. Lassen Sie den Wafer in einer sauberen Umgebung trocknen. Die Trocknung dauert ca. 30 Minuten.

Wenn die Probe vollständig getrocknet ist, bringen Sie das Array in eine fest verschlossene Box, um sie vor Schmutzkontamination zu schützen. Und stellen Sie die Box für mindestens 30 Minuten in einen 60 Grad Celsius warmen Ofen. Um eine Übersichtskarte von REM-Bildern zu erhalten, die Schnittpositionen auf dem Wafer zeigt, verwenden Sie die integrierte optische Kamera, um ein SEM-Bild zu erfassen, das ein Band von Abschnitten abdeckt.

Um ein Mosaik zu erstellen, klicken und ziehen Sie das Kamerabild des Beispiels und starten Sie die automatische Erfassung. Verschaffen Sie sich Übersichten mit höherer Auflösung, um Zielstrukturen zu finden. Wenn nur wenige Abschnitte abgebildet werden müssen, verwenden Sie den zoombaren Viewer, um die aufgenommenen Bilder an ihren ursprünglichen Positionen anzuzeigen.

Sobald ein Abschnitt identifiziert wurde, der mit hoher Auflösung abgebildet werden soll, klicken und ziehen Sie, um einen Bildbereich zu erstellen, wählen Sie dann Einstellungen für die hochauflösende Bildgebung aus und speichern Sie die Einstellungen in einer Vorlage Um besonders kleine oder schwer zu erkennende seltene Ereignisse zu finden, verwenden Sie die Einstellungen für die hochauflösende Bildgebung in jedem 10. Abschnitt oder in einem Abschnitt pro Menüband, um manuell einen Bildbereich zu erstellen und die Bilder zu erfassen. Überprüfen Sie dann die Bilder und markieren Sie Abschnitte, die die Region von Interesse enthalten. Um mehr als 10 aufeinanderfolgende Abschnitte zu erfassen, verwenden Sie den Abschnittsfinder, um alle Abschnitte automatisch zu finden.

Wenn die Übersichtsbilder keine klaren Interessensgebiete zeigen, erfassen Sie Bilder mit höherer Auflösung der Abschnitte und verwenden Sie die Abschnittsvorschaufunktion, um die Bilder automatisch zu erstellen und zu erfassen. Um die optimalen Bildgebungseinstellungen zu bestimmen, aktivieren Sie die Live-Bildgebung in der Mikroskopsteuerungssoftware und navigieren Sie zu einer Region von Interesse, dann passen Sie die Bildgebungseinstellungen an, bis die Bilder klare Bereiche von Interesse zeigen, jedoch ohne eine übermäßig lange Bildaufnahme gemäß den Richtlinien des Herstellers. Um die Positionierung der Bildbereiche in aufeinanderfolgenden Abschnitten zu optimieren, zoomen Sie auf das gewünschte Bild und klicken Sie auf Positionsbestimmung starten, um die Genauigkeit der registrierten Schnittpositionen zu erhöhen.

Um einen Imaging-Bereich zu definieren, klicken und ziehen Sie auf einen beliebigen Abschnitt, während Sie die Alt-Taste gedrückt halten, und wählen Sie im Popup-Kontextmenü die Option "Kachelsatz-Array erstellen". Die Software erstellt Bildbereiche an derselben relativen Position in allen Abschnitten, die gefunden oder zuvor markiert wurden. Richten Sie dann die Pixelanzahl, die Pixelgröße, das Kachellayout und die Pixelverweildauer in jeder Bildserie nach Bedarf ein.

Um die Auto-Funktion zu konfigurieren, erstellen Sie eine separate Bildreihe für auto-Funktionen wie demonstriert, und verschieben Sie die Bildserie an eine Position auf dem Abschnitt, der kontrastreiche Strukturen enthält. Stellen Sie die Bildserie auf 1024 x 884 Pixel ein und wählen Sie eine Pixelgröße aus, die der höchsten in der Bildserie verwendeten Auflösung entspricht. Aktivieren Sie in der Liste der Autofunktionen Autofokus und Auto Stigmator.

Wählen Sie in den Steuerelementen für die Aufnahmesequenz die Option Bisection aus, und vergewissern Sie sich, dass das Bild der automatischen Funktion das erste Element in der Liste ist, und klicken Sie dann auf Alle erfassen, um die Bildaufnahme zu starten. Wenn alle Imaging-Serien erstellt und eingerichtet wurden, wird die Serie in einer Auftragswarteschlange aufgelistet. Die Erfassung mit niedriger Auflösung kann manuell oder automatisch direkt für ausgewählte Teile des Abschnitts oder eines ganzen Abschnitts mit Einzel- oder Mosaikbildgebung durchgeführt werden, gefolgt von Stitching.

Bilder aus dem ausgewählten Bereich können dann mit hochauflösenden Parametern aufgenommen werden, um Beispielsweise Mitochondrien, Kerne und Mikrovilli zu visualisieren. Nachdem die automatische Erfassung aufgelöster Mosaikkarten ausgewählt wurde, können mehrere Regionen von Interesse ausgeschnitten oder verwendet werden, um zusätzliche lokale Bildgebungsbereiche innerhalb der Regionen zu definieren. Obwohl verschiedene spezialisierte Zelltypen im Drosophila-Darm zufällig verteilt sind, können sie nach dem Screening der Bilder anhand hochauflösender Parameter visuell unterschieden werden, entweder aus einzelnen Abschnitten oder als Sammlung von Seriellen Bildern. Nach der Ausrichtung können die Stacks mit verschiedenen Softwarelösungen gerendert werden.

Die Array-Tomographie-Analyse ermöglicht es, viele sequenzielle Abschnitte auf dem einzelnen Wafer zu erzeugen und mit Niedrigauflösungsparametern zu screenen, um die allgemeinen Interessengebiete zu lokalisieren. Diese Bereiche können mithilfe fortschrittlicher Erfassungsparameter für die weitere Analyse anvisiert werden. Zum Beispiel sind mytotische Unterteilungen im Notum auf der ultrastrukturellen Ebene nicht leicht zu lokalisieren, da die Zellen im Vergleich zur Abszischzone relativ groß sind.

Mit dieser Methode können jedoch die automatischen mittelauflösenden Übersichtsbilder der Sprünge von 20 bis 40 Abschnitten zur Lokalisierung der sich teilenden Zellen verwendet werden. Das Array-Tomographie-Verfahren ermöglicht eine einfachere elektronenmikroskopische Datenanalyse. Wir ermutigen die Zuschauer, in die Beherrschung der Regeneration zu investieren und sich mit dem kartenbezogenen Workflow vertraut zu machen Unserer Erfahrung nach erfordern nur wenige Forschungsthemen die ultrastrukturelle Analyse ganzer Tiere oder ganzer Organe.

Unsere Methode hilft bei der schnellen Lokalisierung von Zellen und ihren Interaktionspartnern in Geweben.