Name: Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Zellkanten-Überstandsanalyse zur Untersuchung von Zellmotilität und Zytoskelettdynamik mittels Lebendzellmikroskopie. Diese kostengünstige Methode erfordert keine Fluoreszenzmarkierung und dient als Vorabtest für Migrationsassays.

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse NIH MH115939, NS112121, NS105640 und R56MH122449-01A1 (an Anthony J. Koleske) und von der Israel Science Foundation (Stipendiennummer 1462/17 und 2142/21) (an Hava Gil-Henn) unterstützt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee (IACUC) der Bar-Ilan-Universität genehmigt.
HINWEIS: Eine grafische Schritt-für-Schritt-Darstellung des in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Zellkultur
HINWEIS: Die im Protokoll verwendeten Zellen sind embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus, die aus E11,5-13,5-Embryonen von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen erzeugt wurden. Primäre MEFs wurden gemäß dem Jacks-Laborprotokoll13 erzeugt. Zellen aus fünf verschiedenen Embryonen wurden zusammen gepoolt und durch Infektion mit einem retroviralen Vektor, der SV40 Large T-Antigen exprimierte, verewigt, gefolgt von einer Selektion mit 4 mM Histidinol für 3 Wochen.
<ol><li>Kulturzellen in Gewebekulturplatten, die Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) enthalten, das 1 g/L Glukose, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält (siehe Materialtabelle), in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellen bis zu 90% -95% Konfluenz und teilen Sie sie sich alle 2-3 Tage im Verhältnis 1: 5 auf.</li>
</ol>2. Glasboden-Schalenbeschichtung
HINWEIS: Die Beschichtung der Glasbodenschale sollte unter sterilen Bedingungen in der Gewebekulturhaube durchgeführt werden.
<ol><li>Fügen Sie 2 ml 1N HCl-Lösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu (Table of Materials) und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur (RT). HINWEIS: Diese Phase dient dazu, Rückstände aus dem Glas zu entfernen, die die Bildgebung später unterbrechen können.</li>
	<li>Waschen Sie die Glasbodenschale dreimal mit jeweils 2 ml 1x PBS (Table of Materials).</li>
	<li>Verdünnen Sie Fibronektin (siehe Materialtabelle) auf 10 μg/ml in 1x PBS. Geben Sie 200 μL der verdünnten Fibronektinlösung in die Glasmitte der Schale. Bei 37 °C (Gewebekultur-Inkubator) für 1 h inkubieren. HINWEIS: Alternativ kann die Glasbodenschale über Nacht bei 4 °C auf einer ebenen Fläche inkubiert werden.</li>
	<li>Während der Inkubationszeit der Fibronektinbeschichtung bereiten Sie 1% BSA-Lösung (Table of Materials) in 1x PBS vor, filtern Sie durch 0,2 μm und denaturieren Sie sie durch Inkubation bei 70 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad.</li>
	<li>Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit je 2 ml 1x PBS.</li>
	<li>2 ml denaturierte BSA-Lösung in die Glasmitte geben und 1 h bei 37 °C inkubieren (Gewebekultur-Inkubator). HINWEIS: Alternativ kann die Glasbodenschale über Nacht bei 4 °C auf einer ebenen Fläche inkubiert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Glasbodenschale 3 Mal mit je 2 ml 1x PBS. HINWEIS: Die Inkubation von Glasbodenschalen mit Fibronektin sollte mindestens 1 h bei 37 °C durchgeführt werden, um die Oberfläche richtig zu beschichten. Eine kürzere Inkubationszeit führt möglicherweise nicht zu einer ordnungsgemäßen Beschichtung, und infolgedessen ist der Zellphänotyp möglicherweise nicht mit der Integrinaktivierung verbunden. Die BSA-Schicht ist inert und beeinflusst die Protrusionsdynamik nicht und soll freie potenzielle Stellen für eine integrinunabhängige Zelladhäsion blockieren. Die BSA muss vor der Beschichtung denaturiert werden, um zu verhindern, dass sie Zellapoptose induziert, die die Zellkantendynamik beeinflussen kann.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung
<ol><li>Sechzehn bis achtzehn Stunden vor dem Experiment die Zellen plattieren, um am nächsten Tag einen Zusammenfluss von 70% -80% zu erreichen. Für MEFs, Platte 0,7 x 106 Zellen pro 10 cm Durchmesser Gewebekulturplatte einen Tag vor der Durchführung des Experiments. HINWEIS: Für ein erfolgreiches Protrusionsexperiment ist es wichtig, dass die Zellen während ihrer logarithmischen Wachstumsphase verwendet werden. Um dies zu erreichen, sollten die Zellen am Tag des Experiments einen Zusammenfluss von 70% -80% erreichen. Eine höhere Zelldichte führt zu einer längeren Ausbreitungszeit und/oder einer Behinderung der Anheftung während des Experiments.</li>
	<li>Am Experimenttag 2 ml Trypsinlösung (Materialtabelle) pro Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 cm hinzufügen und 2-3 Minuten in einem Gewebekulturinkubator inkubieren, bis sich die Zellen ablösen. Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml des vollständigen Mediums hinzufügen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und beschichten Sie 20.000 Zellen in 2 ml des gesamten Mediums auf einer Glasbodenschale, die wie oben beschichtet ist (Abschnitt 2). HINWEIS: Die Anzahl der zu plattierenden Zellen hängt von der Größe und dem Typ der Zellen ab. Für größere oder mehr verteilte Zellen sollten Sie nur 10.000 Zellen platten, um genügend Zellen für die Bildgebung zu haben. Es ist wichtig, einzelne Zellen auszuwählen, die sich nicht berühren, da der Kontakt von Zelle zu Zelle das zellintrinsische Ausbreitungsverhalten verändern kann.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Glasbodenschalen mit plattierten Zellen im Gewebekultur-Inkubator für 15 min. HINWEIS: Während dieses Stadiums haften die Zellen am Fibronektinsubstrat und breiten sich darüber aus. Bei der Messung von Vorsprüngen während der Zellausbreitung sollten sich die Zellen nach der Beschichtung und vor der Bildgebung 15 Minuten lang ausbreiten können. Die Bildgebung kann innerhalb eines Zeitfensters zwischen 15 Minuten und ~ 1 h nach der Beschichtung und in jedem Fall vor Beginn der Migration der Zellen durchgeführt werden.</li>
</ol>4. Mikroskopaufbau und Bildgebung
HINWEIS: Es stehen verschiedene Lebendzellmikroskopiesysteme zur Verfügung. Das hier verwendete System ist ein inverses Mikroskop Leica AF6000, das mit CO2- und Heizgeräten ausgestattet ist und an eine digitale CMOS-Kamera ORCA-Flash 4.0 V2 angeschlossen ist.
<ol><li>Schalten Sie das Heizgerät vor der Bildgebung mindestens 1 h ein und stellen Sie es auf 37 °C ein.</li>
	<li>Schalten Sie die CO2-Einheit mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung ein und stellen Sie sie auf 5% CO2 ein.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera und den Computer ein.</li>
	<li>Öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie den Ordner aus, in dem die aufgenommenen Bilder gespeichert werden sollen, und geben Sie einen Dateinamen ein. Speichern Sie jeden Film als neue Datei.</li>
	<li>Stellen Sie die Vergrößerung auf ein 40-fach trockenes Objektiv, Phasenkontrast. Stellen Sie das Zeitintervall auf 5 s ein, die Gesamtdauer des Films auf 10 min.</li>
	<li>Nach 15 Minuten Inkubation der plattierten Zellen legen Sie die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in den Adapter und fixieren sie. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in den Schlitz im Mikroskoptisch.</li>
	<li>Nehmen Sie den Geschirrdeckel ab und setzen Sie stattdessen den CO2-Deckel auf. Öffnen Sie das CO2-Ventil. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die CO2-Abdeckung sauber ist, bevor Sie sie auf die Glasbodenschale legen. Ein schmutziges Cover verringert die Qualität von Filmen. Wischen Sie die Unterseite des CO2-Deckels mit einem fusselfreien Tuch ab, das mit 70% Ethanol getränkt ist, um Staub und Schmutz zu entfernen. Ein zweites Mal mit einem trockenen, fusselfreien Tuch abwischen.</li>
	<li>Sehen Sie sich die Zellen an und finden Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass die Zelle im Fokus ist, und starten Sie die Filmakquisition.</li>
</ol>5. Bildanalyse
HINWEIS: Die Bildanalyse wird mit ImageJ (Table of Materials) wie folgt durchgeführt:
<ol><li>Öffnen Sie den aufgenommenen Film in ImageJ.</li>
	<li>Mit dem Geraden-Werkzeug in der Hauptsymbolleiste können Sie acht Linien mit jeweils 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen, einschließlich der Lamellen- und Zellkante, in einer radialen Anordnung alle 45° erstellen, wie in Abbildung 2A dargestellt.</li>
	<li>Wechseln Sie in der Hauptsymbolleiste zu Image > Stacks > Reslice. Dies ergibt ein Kymographenbild, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt (Abbildung 2B). Diese Aktion sollte für jede Zeile aus den acht Zeilen separat ausgeführt werden.</li>
	<li>Extrahieren und zählen Sie manuell aus den jeweiligen Kymographbildern die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 min dar (Abbildung 2C, D). HINWEIS: Rüschen können von anderen Strukturen anhand ihrer dunklen Erscheinung in der Phasenkontrastmikroskopie und ihrer zentripetalen Bewegung unterschieden werden, die am Zellrand beginnt und an der Grenze des Zellkörpers endet, was in den erworbenen Filmen beobachtet werden kann. Bei der Quantifizierung von Protrusion, Retraktion und Rüschenfrequenz sollten Filme als Kontrolle für die Quantifizierung und insbesondere für die Definition von Rüschen beobachtet werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Für jeden der erzeugten Kymographen stellt die X-Achse den Abstand und die Y-Achse die Zeit dar.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 5.6.1-5.6.2 aus, um den Vorsprung zu messen.<ol>
<li>Zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M in ImageJ, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen.</li>
		<li>Um die Länge von Pixel in μm umzurechnen, stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Pixel zu μm bekannt ist. HINWEIS: Das μm-zu-Pixel-Verhältnis ist die physikalische Länge eines Pixels auf der CCD-Kamera / Gesamtvergrößerung. Die Pixelgröße ist charakteristisch für jeden Kameratyp. Für die in dieser Studie verwendete Kamera beträgt beispielsweise die Pixelgröße 6,5 μm x 6,5 μm, die physikalische Länge 6,5 μm und die von uns verwendete Vergrößerung das 40-fache. Daher beträgt das μm-Pixel-Verhältnis unserer Kamera 0,1625 μm/Pixel. In der Analyse würde für eine Linie mit einer Länge von 30 Pixeln der Überstandungsabstand 30 Pixel x 0,1625 μm/Pixel = 4,875 μm betragen (Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Schritte 5.7.1 bis 5.7.2 aus, um die Protrusionszeit (Persistenz; die Zeit, die ein Vorsprung vor dem Zurückziehen verbringt) zu messen.<ol>
<li>Zeichne eine horizontale Linie vom Anfang des Vorsprungs (von links nach rechts) bis zum Bereich des höchsten Gipfels. Drücken Sie M in ImageJ, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen.</li>
		<li>Um die Länge von Pixeln in Minuten umzurechnen, berechnen Sie das Verhältnis von Pixel zu Min. Dieser Wert hängt vom Intervall zwischen den Bildern ab. HINWEIS: In diesem Beispiel beträgt das Intervall zwischen den Bildern 5 s, das Min/Pixel-Verhältnis 0,0833 und die horizontale Zeilenlänge 8 Pixel. Daher beträgt die Überstandungszeit 8 Pixel x 0,0833 min/Pixel = 0,6664 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen und berechnen Sie die Rückzugszeit ähnlich wie die Hervorstosszeit für eine Linie, die horizontal an der Basis des Vorsprungs gezeichnet wird, von wo aus sich die Spitze des Vorsprungs zu seiner Basis rechts befindet (Linie X2 in Abbildung 3).</li>
	<li>Berechnen Sie die Protrusionsgeschwindigkeit, indem Sie den Protrusionsabstand durch die Protrusionszeit dividieren. Berechnen Sie die Rückzugsgeschwindigkeit, indem Sie den Vortriebsabstand durch die Rückzugszeit dividieren. In diesem Beispiel wird die Protrusionsgeschwindigkeit als 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min berechnet, und die Rückzugsgeschwindigkeit ist identisch, da die Linie, die die Zeit darstellt, gleich lang ist. HINWEIS: Beim Vergleich verschiedener Zelltypen, d.h. Zellen, die Wildtyp- und Mutantenkonstrukte desselben Proteins exprimieren, ist es unerlässlich, eine verblindete Analyse durchzuführen, damit keine Verzerrung eingeführt wird.</li>
</ol>

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<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
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<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Die Zellkanten-Protrusionsdynamik, bestehend aus Vorsprüngen, Rückzug und Rüschen, ist sowohl eine Voraussetzung als auch ein potenzielles geschwindigkeitsbegrenzendes Ereignis in der Zellmotilität. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode zur Messung der Dynamik von Zellrandvorsprüngen während der Ausbreitung. Diese Methode ermöglicht eine kurzzeitige Bildgebung, generiert eine erhebliche Datenmenge, erfordert keine fluoreszierende Markierung von Zellen oder teure Fluoreszenzmikroskopiegeräte und könnte a...

Die Zellmigration ist ein kritischer Prozess, der die Entwicklung und Funktion aller lebenden Organismen steuert. Die Zellmigration tritt sowohl unter physiologischen Bedingungen wie Embryogenese, Wundheilung und Immunantwort als auch unter pathologischen Zuständen wie Krebsmetastasen und Autoimmunerkrankungen auf. Trotz Unterschieden in den Zelltypen, die an verschiedenen Migrationsereignissen beteiligt sind, teilen alle Zellmotilitätsereignisse ähnliche molekulare Mechanismen, die in der Evolution von Protozoen zu Säugetieren konserviert wurden und gemeinsame zytoskelettale Kontrollmechanismen beinhalten, die die Umgebung erfassen, auf Signale reagieren und das Zellverhalten als Reaktion modulieren können1.
Ein Anfangsstadium der Zellmigration kann die Bildung hochdynamischer Vorsprünge an der Vorderkante der Zelle sein. Hinter dem Lamellipodium befindet sich die Lamelle, die Aktin an Myosin II-vermittelte Kontraktilität koppelt und die Adhäsion auf das darunter liegende Substrat vermittelt. Lamellipodien werden durch extrazelluläre Reize wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Zelladhäsionsrezeptoren induziert und durch Aktinpolymerisation angetrieben, die die physikalische Kraft liefert, die die Plasmamembran vorantreibt2,3. Viele Signal- und Strukturproteine sind daran beteiligt; unter ihnen sind Rho-GTPasen, die koordiniert mit anderen Signalen wirken, um aktinregulierende Proteine wie den Arp 2/3-Komplex, Proteine der WASP-Familie und Mitglieder der Formin- und Spire-Familien in Lamellipodia2,4,5 zu aktivieren.
Neben der Aktinpolymerisation ist eine Myosin-II-Aktivität erforderlich, um kontraktile Kräfte am Lamellipodium und an der vorderen Lamelle zu erzeugen. Diese Kontraktionen, auch definiert als Zellrand-Rückzug, können auch aus der Depolymerisation von dendritischem Aktin an der Zellperipherie resultieren und sind entscheidend für die Entwicklung der lamellipodialen Vorderkante und ermöglichen es dem Protrusion, die Flexibilität der extrazellulären Matrix und anderer Zellen zu erkennen und die Richtung der Migration zu bestimmen6,7,8 . Zellrandvorsprünge, die sich nicht an das Substrat anheften können, bilden periphere Membranrüschen, blattartige Strukturen, die auf der ventralen Oberfläche von Lamellipodien und Lamellen erscheinen und sich relativ zur Migrationsrichtung rückwärts bewegen. Da sich das Lamellipodium nicht am Substrat festsetzt, bildet sich darunter ein hinteres Lamellipodium und drückt das erste Lamellipodium mechanisch in Richtung der oberen ventralen Oberfläche. Die Aktinfilamente in der Rüsche, die früher parallel zum Substrat waren, werden jetzt senkrecht zu ihm, und die Rüsche ist jetzt über dem vorrückenden Lamellipodium positioniert. Die Rüsche, die sich rückwärts bewegt, fällt zurück in das Zytosol und stellt einen zellulären Mechanismus zum Recycling von lamellipodialem Aktin dar9,10.
Hier beschreiben wir einen Assay zur Messung der Zellkanten-Protrusionsdynamik. Der Protrusionsassay verwendet Zeitraffer-Videomikroskopie, um die Protrusionsdynamik einzelner Zellkanten für 10 Minuten während der Spreizphase der Zelle zu messen. Die Protrusionsdynamik wird analysiert, indem Kymographen aus diesen Filmen generiert werden. Im Prinzip liefert ein Kymograph detaillierte quantitative Daten von sich bewegenden Partikeln in einem raumzeitlichen Diagramm, um ein qualitatives Verständnis der Zellranddynamik zu erhalten. Die Intensität des sich bewegenden Teilchens wird für alle Bildstapel in einem Zeit-Raum-Diagramm dargestellt, wobei die X-Achse und die Y-Achse Zeit bzw. Entfernung darstellen11. Diese Methode verwendet eine manuelle Kymographenanalyse mit ImageJ, um detaillierte quantitative Daten zu erhalten, die das Abrufen von Informationen aus Filmen und Bildern bei niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis und / oder hoher Merkmalsdichte sowie die Analyse von Bildern ermöglichen, die in Phasenkontrast-Lichtmikroskopie oder schlechter Bildqualität aufgenommen wurden.
Der hierin beschriebene Zellkanten-Protrusionsdynamik-Assay ist eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode. Als solches und weil es nachweislich direkt mit der Zellmigration korreliert11,12, kann es als vorläufige Methode zum Testen der Zytoskelettdynamik verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt ist, bevor entschieden wird, ressourcenintensivere Methoden durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht es auch die quantitative Messung, wie genetische Manipulationen (Knockout-, Knockdown- oder Rettungskonstrukte) von Zytoskelettproteinen die Zytoskelettdynamik mit einer einfachen Plattform beeinflussen. Der Assay ist ein lehrreiches Modell zur Erforschung der Zytoskelettdynamik im Kontext der Zellmigration und könnte zur Aufklärung der Mechanismen und Moleküle verwendet werden, die der Zellmotilität zugrunde liegen.

<table><tbody><tr><td>10 cm Zellkulturplatten</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>Medium enthält hohe Glukose (4,5 g/L D-Glukose)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1xDPBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin aus menschlichem Plasma, flüssig, 0,1%, geeignet für Zellkultur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschalen</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1,5-N</td><td>35 mm Glasbodenschale, Schalengröße 35 mm, Vertiefungsgröße 20 mm, #1,5 Deckglas (0,16-0,19 mm).</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Verfügbar unter: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>Mikroskopaufnahmesoftware ausgestattet mit einem ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Inverses Hellfeldmikroskop (40x, NA 1.3 ) ausgestattet mit Phasenkontrastoptik, einem Inkubator und einer CO2-Einheit mit LAS AF-Erfassungssoftware ausgestattet mit einem ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-Kamera .</td></tr><tr><td>L-Glutamin-Lösung</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der zellkanten-Überstandsdynamik während des streuens mittels lebendzellmikroskopie

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen beruht auf einer koordinierten Regulation der Zellmigration. Die Zellmigration ist ein wesentliches Ereignis beim Aufbau und der Regeneration von Geweben und entscheidend für die Embryonalentwicklung, die immunologischen Reaktionen und die Wundheilung. Eine Dysregulation der Zellmotilität trägt zu pathologischen Störungen wie chronischen Entzündungen und Krebsmetastasen bei. Zellmigration, Gewebeinvasion, Axon- und Dendritenauswuchs beginnen alle mit Aktinpolymerisations-vermittelten Zellrandvorsprüngen. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode zur bildgebenden und quantitativen Analyse der Zellkantenprotrusionsdynamik während der Ausbreitung. Diese Methode misst diskrete Merkmale der Zellkantenmembrandynamik, wie Vorsprünge, Rückzug und Rüschen, und kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich Manipulationen von Schlüssel-Aktinregulatoren auf Zellkantenvorsprünge in verschiedenen Kontexten auswirken.

In dem in Abbildung 2 beschriebenen Experiment wurden immortalisierte MEFs auf Glasbodenschalen plattiert, die mit Fibronektin vorbeschichtet waren, um die durch denaturierte BSA blockierte integrinvermittelte Signalübertragung zu aktivieren, um freie potenzielle Stellen für die Zelladhäsion zu blockieren, die nicht von der Integrinaktivierung abhängig ist. Um die logarithmische Wachstumsphase bei 70%-80% Zusammenfluss von Zellen am Tag des Experiments zu erreichen, wurden 16 h vor dem Exper...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die dynamischen Parameter (Vorsprünge, Retraktionen, Rüschen) von Vorsprüngen am Rand von sich ausbreitenden Zellen zu messen.

Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Es hat sich gezeigt, dass der Zellrand-Protrusionsassay direkt mit der Zellmigration korreliert. Daher kann es als vorläufige Methode zur Identifizierung kritischer Proteine und Signalmechanismen verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt sind. Die Methode ist schnell, einfach, kostengünstig und erfordert keine fluoreszierende Markierung oder Verwendung eines teuren Fluoreszenzmikroskops.Das Verfahren wird Michal Gendler, ein Student aus meinem Labor, demonstrieren. Fügen Sie zwei Milliliter einer normalen Salzsäurelösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Geschirr dreimal mit zwei Millilitern PBS.Verdünnen Sie Fibronektin bei 10 Mikrogramm pro Milliliterkonzentration in PBS und fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lösung in die Glasmittelschale hinzu. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie 1% BSA-Lösung und PBS vor und führen Sie es durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.Denaturieren Sie die Lösung, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad inkubieren. Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Fügen Sie zwei Milliliter denaturierte BSA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Waschen Sie die Glasschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Vor 16 bis 18 Stunden Experiment bei 0,7 Millionen Zellen pro 10 Zentimeter Durchmesser Gewebekulturplatte, um 70 bis 80% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag zwei Milliliter Trypsinlösung in die Gewebekulturplatte geben und zwei bis drei Minuten inkubieren, bis sich die Zellen ablösen.Fügen Sie fünf Milliliter des Mediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Zählen Sie mit einem Hämacytometer die Zellen und die Platte 20.000 Zellen in zwei Millilitern des gesamten Mediums in einer unteren Schale. Dann inkubieren Sie die Schale mit plattierten Zellen in einem Inkubator für 15 Minuten.Schalten Sie das Heizgerät ein und stellen Sie es eine Stunde vor der Bildgebung auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie auch die Kohlendioxideinheit ein und stellen Sie sie auf 5% 10 Minuten vor der Bildgebung ein. Schalten Sie das Mikroskop und die Kamera ein.Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen 40-fachen Trockenlinsenphasenkontrast ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Films auf 10 Minuten mit einem Zeitintervall von fünf Sekunden fest.Nach 15 Minuten Inkubation die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in einen Adapter geben und fixieren. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in die Schlitze im Mikroskoptisch. Nehmen Sie den Schalendeckel ab, setzen Sie den Kohlendioxiddeckel auf und öffnen Sie das Kohlendioxidventil.Suchen Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Beginnen Sie mit der Filmakquisition, nachdem Sie sich auf die Zelle konzentriert haben. Um die Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das gerade Werkzeug in der Bildanalysesoftware und machen Sie acht Linien von 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen in einer radialen Anordnung bei allen 45 Grad, einschließlich Lamelle und Zellkante.Gehen Sie in der Hauptsymbolleiste zum Bild, wählen Sie Stacks und klicken Sie dann auf Reslice, um ein Kymographenbild zu erstellen, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt. Extrahieren und zählen Sie anhand der Kymographenbilder die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche in der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind, manuell und manuell. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 Minuten dar.Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Um den Vorsprung zu bestimmen, zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M, um die Länge der Linie in Pixel zu messen und sicherzustellen, dass das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer bekannt ist, um die Länge in Mikrometer umzuwandeln.Die Quantifizierung von Vorsprüngen, Reaktionen und Rüschen wurde manuell pro 10 Minuten durchgeführt, und die durchschnittliche Häufigkeit für Vorsprünge und Rückzug betrug 5,1 und 2,1 für Rüschen. Der repräsentative Kymograph hatte einen Protrusionsabstand von etwa 4,8 Mikrometern und eine Protrusionszeit von etwa 0,6 Minuten. Ein Beispiel für eine Zelle, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollte, wird dargestellt.Die Kymographie-Analyse ergab, dass die Zelle in ihrer Ausbreitungsphase nicht vorhanden war und keine klaren Membranvorsprünge zeigte. Das Wichtigste ist, die richtigen Zellen für die Bildgebung auszuwählen. Eine richtige Zelle sollte sich in ihrer Ausbreitungsphase befinden und andere Zellen nicht berühren, um Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung zu vermeiden.Die Methode kann als vorläufiges Werkzeug zum Testen der zytoskelettalen Dynamik mit Zellmotilität verwendet werden, bevor entschieden wird, mehr Ergebnisse durchzuführen, die Zellmigrationsassays erfordern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

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