Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie
1. November 2021
Dieses Protokoll zielt darauf ab, die dynamischen Parameter (Vorsprünge, Retraktionen, Rüschen) von Vorsprüngen am Rand von sich ausbreitenden Zellen zu messen.
Es hat sich gezeigt, dass der Zellrand-Protrusionsassay direkt mit der Zellmigration korreliert. Daher kann es als vorläufige Methode zur Identifizierung kritischer Proteine und Signalmechanismen verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt sind. Die Methode ist schnell, einfach, kostengünstig und erfordert keine fluoreszierende Markierung oder Verwendung eines teuren Fluoreszenzmikroskops.
Das Verfahren wird Michal Gendler, ein Student aus meinem Labor, demonstrieren. Fügen Sie zwei Milliliter einer normalen Salzsäurelösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Geschirr dreimal mit zwei Millilitern PBS.
Verdünnen Sie Fibronektin bei 10 Mikrogramm pro Milliliterkonzentration in PBS und fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lösung in die Glasmittelschale hinzu. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie 1% BSA-Lösung und PBS vor und führen Sie es durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.
Denaturieren Sie die Lösung, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad inkubieren. Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Fügen Sie zwei Milliliter denaturierte BSA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Waschen Sie die Glasschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Vor 16 bis 18 Stunden Experiment bei 0,7 Millionen Zellen pro 10 Zentimeter Durchmesser Gewebekulturplatte, um 70 bis 80% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag zwei Milliliter Trypsinlösung in die Gewebekulturplatte geben und zwei bis drei Minuten inkubieren, bis sich die Zellen ablösen.
Fügen Sie fünf Milliliter des Mediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Zählen Sie mit einem Hämacytometer die Zellen und die Platte 20.000 Zellen in zwei Millilitern des gesamten Mediums in einer unteren Schale. Dann inkubieren Sie die Schale mit plattierten Zellen in einem Inkubator für 15 Minuten.
Schalten Sie das Heizgerät ein und stellen Sie es eine Stunde vor der Bildgebung auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie auch die Kohlendioxideinheit ein und stellen Sie sie auf 5% 10 Minuten vor der Bildgebung ein. Schalten Sie das Mikroskop und die Kamera ein.
Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen 40-fachen Trockenlinsenphasenkontrast ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Films auf 10 Minuten mit einem Zeitintervall von fünf Sekunden fest.
Nach 15 Minuten Inkubation die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in einen Adapter geben und fixieren. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in die Schlitze im Mikroskoptisch. Nehmen Sie den Schalendeckel ab, setzen Sie den Kohlendioxiddeckel auf und öffnen Sie das Kohlendioxidventil.
Suchen Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Beginnen Sie mit der Filmakquisition, nachdem Sie sich auf die Zelle konzentriert haben. Um die Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das gerade Werkzeug in der Bildanalysesoftware und machen Sie acht Linien von 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen in einer radialen Anordnung bei allen 45 Grad, einschließlich Lamelle und Zellkante.
Gehen Sie in der Hauptsymbolleiste zum Bild, wählen Sie Stacks und klicken Sie dann auf Reslice, um ein Kymographenbild zu erstellen, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt. Extrahieren und zählen Sie anhand der Kymographenbilder die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche in der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind, manuell und manuell. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 Minuten dar.
Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Um den Vorsprung zu bestimmen, zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M, um die Länge der Linie in Pixel zu messen und sicherzustellen, dass das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer bekannt ist, um die Länge in Mikrometer umzuwandeln.
Die Quantifizierung von Vorsprüngen, Reaktionen und Rüschen wurde manuell pro 10 Minuten durchgeführt, und die durchschnittliche Häufigkeit für Vorsprünge und Rückzug betrug 5,1 und 2,1 für Rüschen. Der repräsentative Kymograph hatte einen Protrusionsabstand von etwa 4,8 Mikrometern und eine Protrusionszeit von etwa 0,6 Minuten. Ein Beispiel für eine Zelle, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollte, wird dargestellt.
Die Kymographie-Analyse ergab, dass die Zelle in ihrer Ausbreitungsphase nicht vorhanden war und keine klaren Membranvorsprünge zeigte. Das Wichtigste ist, die richtigen Zellen für die Bildgebung auszuwählen. Eine richtige Zelle sollte sich in ihrer Ausbreitungsphase befinden und andere Zellen nicht berühren, um Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung zu vermeiden.
Die Methode kann als vorläufiges Werkzeug zum Testen der zytoskelettalen Dynamik mit Zellmotilität verwendet werden, bevor entschieden wird, mehr Ergebnisse durchzuführen, die Zellmigrationsassays erfordern.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen Zellrand-Vorläufer-Assay vor, um die dynamischen Parameter ausbreitender Zellen zu untersuchen, einschließlich Vorläuferbildung, Retraktionen und Ruffle. Diese Methode ist besonders bedeutend, da sie mit der Zellmigration korreliert und dabei hilft, entscheidende Proteine und Signalmechanismen, die an der Zellmotilität beteiligt sind, zu identifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellmigration
- Zellmotilität
- Dynamik des Zytoskeletts
Hintergrund
- Es besteht eine Korrelation zwischen Zellrand-Ausstülpungen und der Zellmigration.
- Der Assay ist einfach, kostengünstig und erfordert keine fluoreszenzmarkierten Reagenzien.
- Das Verständnis von Ausstülpungen kann Einblicke in das zelluläre Verhalten und die Mechanismen der Beweglichkeit liefern.
Verwendete Methoden
- Assay zur Untersuchung von Zellrandausstülpungen
- Adhärierte Zellen auf einer Glasbodenkulturschale
- Kymographie-Analyse zur Beurteilung von Ausstülpungen
Hauptergebnisse
- Die durchschnittliche Frequenz der Ausstülpungen betrug 5,1 pro 10 Minuten, bei Ruffles 2,1.
- Die Kymographie-Analyse ergab eine Ausstülpungsdistanz von etwa 4,8 Mikrometern.
- Es wurde die Bedeutung der Auswahl geeigneter Zellen in der Ausbreitungsphase für genaue Ergebnisse erkannt.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt einen zugänglichen Test zur Beurteilung der Zellmotilitätsdynamik vor.
- Diese Methode dient als vorläufiges Bewertungsinstrument, bevor komplexere Migrationsassays durchgeführt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Dynamik der Zellrandvorwölbungen dient als frühes, vorhersagendes Maß für die Zellmotilität und ermöglicht eine schnelle Beurteilung zytoskelettaler Regulatoren, bevor aufwändige Migrationsassays durchgeführt werden. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung, indem sie molekulare Störungen mit funktionellen Membrandynamiken verknüpft und mechanistische Entwicklungsrisiken in Entdeckungsworkflows reduziert. Durch ihr markierungsfreies und kostengünstiges Design eignet sie sich für das Hochdurchsatz-Screening von Signalwegen, die für die Wundheilung, die Immunantwort und die Krebsmetastasierung relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die Häufigkeit, Beständigkeit, Distanz und Geschwindigkeit von Ausstülpungen, um therapeutische Hypothesen zu Aktin-Regulatoren und Beweglichkeitswegen zu überprüfen.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine schnelle, markierungsfreie Untersuchung von Protein-Reduktionen oder Hemmstoffen, die die Dynamik des Cytoskeletts beeinflussen.
- Predictiver Wert: Stellt eine Korrelation zwischen den Dynamiken der Ausstülpungen und der Zellmigration her und unterstützt Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch anhand früher phänotypischer Ergebnisse.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, aus Kymographen abgeleitete Metriken (Anzahl der Ausstülpungen, Distanz, Geschwindigkeit) für einen standardisierten Vergleich über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg.
- Operativer Wert: Verwendet Phasenkontrastmikroskopie und leicht zugängliche Bildanalyse-Tools und verringert so die Abhängigkeit von spezieller Ausrüstung oder fluoreszierenden Sonden.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht Tests mit mehreren Bedingungen durch radiale Stichprobenahme von acht Membranbereichen pro Zelle, wodurch die Datenrobustheit erhöht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Modulation molekularer Zielstrukturen mit der funktionellen zellulären Dynamik in krankheitsrelevanten Systemen wie Fibroblasten oder Immunzellen.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob beobachtete phänotypische Effekte auf veränderte Ausstülpungsdynamik zurückgehen, anstatt auf sekundäre Zytotoxizität oder Adhäsionsdefekte.
- Biomarker-Korrelation: Ausstülpungsparameter können als translationale Biomarker dienen, wenn sie mit in-vivo-Beweglichkeit oder Invasionsphänotypen verknüpft sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielstrukturenbindung bis zur phänotypischen Validierung ein und fungiert als Bindeglied zwischen biochemischem Screening und funktionellen zellbasierten Assays.
- Entdeckungsbiologie: Untersucht, wie genetische oder pharmakologische Eingriffe in Aktinregulatoren (z. B. Arp2/3, Cofilin, Rho-GTPasen) die Auswuchsdynamik als Proxy für Beweglichkeit beeinflussen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse (z. B. Anzahl der Auswüchse pro 10 Minuten, Auswuchsgeschwindigkeit), die den Vergleich zwischen Wirkstoffbibliotheken oder genetischen Screens ermöglichen.
- Analytik: Die Kymographie bietet zeitliche und räumliche Auflösung der Membrandynamik und ermöglicht die Ermittlung kinetischer Parameter, die für die mechanistische Modellierung entscheidend sind.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Übertragung auf präklinische Modelle, indem bestätigt wird, dass Zielmoleküle konsistente Auswuchsphänotypen in primären oder krankheitsrelevanten Zelllinien hervorrufen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, kostengünstige Plattform, die wiederholt in Projekten zur Untersuchung der Zellmotilität in Entwicklung, Entzündung oder Onkologie eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem molekulare Störungen direkt mit quantifizierbaren Membrandynamiken verknüpft werden.
- Operativer Wert: Macht fluoreszierende Markierungen und teure Bildgebungshardware überflüssig, senkt die Hürde für Assays und erhöht die Zugänglichkeit.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem Zielstrukturen frühzeitig anhand eines prädiktiven, phänotypischen Ankers an die Zellmigration gefiltert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Übereinstimmung zwischen Ausstülpungsdynamik und Migrationspotenzial.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung, der Erstellung von Kymographen sowie der manuellen oder halbautomatisierten Analyse von Ausstülpungen.
- Benötigt die Phasenkontrastmikroskopie und Bildanalyse-Software, die in der Lage ist, Reslice- und Kymographen-Erstellung durchzuführen.
- Setzt eine Standardisierung der Zellansaatdichte, der Beschichtung des Substrats (Fibronectin/BSA) und der Umweltbedingungen (37 °C, 5 % CO2) zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Erfordert Schulung, um Zellen in der geeigneten Ausbreitungsphase zu identifizieren und konfluente oder kontaktierende Zellen zu vermeiden, die die Messung von Ausstülpungen verfälschen können.
- Auf die Ausbreitung an 2D-Substraten beschränkt; erfasst möglicherweise nicht vollständig 3D-Invasions- oder Migrationseigenschaften unter Einschränkung.
