Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Oph- und Melanogaster-Embryonen für die Ganzpräparat-Darstellung des Nervensystems vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus dem gewünschten Fliegenstamm gesammelt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Corium mit Bleiche zu entfernen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Heptan und Methanol aufzutragen, um die Vilin-Membran zu entfernen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Applikation von Antikörpern auf die Embryonen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Struktur des Nervensystems des Drosophila-Embryos mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Mutationen im sich entwickelnden Nervensystem spielen können. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie versehentlich Embryonen aus dem Reagenzglas heraussaugen können. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die benötigten Reagenzien vorbereiten, darunter P-E-M-F-A, Puffer PBC mit 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid in Salzlösung sowie Formaldehyd-Fixierungslösung.

Bereiten Sie einen Käfig für den gewünschten Drosophila-Stamm vor, indem Sie die Fliegen mit Kohlendioxid betäuben und anschließend mindestens 100 Fliegen in eine Plastikflasche überführen, die einen Adapter mit einer Futterplatte aus Apfelsaft-Agar enthält. Stellen Sie den Fliegenkäfig 72 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Wechseln Sie die Futterplatten aus Apfelsaft-Agar alle acht bis zwölf Stunden, damit sich die Fliegen an den Käfig gewöhnen und ihre Eier für das Experiment nicht zurückhalten.

Nach der 72-stündigen Akklimatisierungsphase sammeln Sie die Embryonen 12 Stunden nach dem letzten Austausch der Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte. Entfernen Sie die Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte aus dem Legkäfig und ersetzen Sie sie durch Kochsalzlösung. Spülen Sie die Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte ab.

Sammeln Sie die Embryonen in einem feinen Sieb. Lösen Sie mit einem sauberen Pinsel vorsichtig alle Embryonen, die noch an der Platte haften. Spülen Sie die Embryonen im Sieb mit Salzlösung ab, um überschüssige Hefe zu entfernen. Heben Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Spatel auf und geben Sie sie in ein kleines Glasfläschchen.

Geben Sie etwa ein Milliliter Kochsalzlösung hinzu. Verschließen Sie dann das Gefäß und inkubieren Sie fünf Minuten lang, um die Embryonen zu waschen. Danach erfolgt die Sammlung der Embryonen.

Stellen Sie die Heptan-Fixierlösung her, indem Sie 50 % Heptan und 50 % Fixansatz miteinander vermischen. Die Lösung wird sich in zwei Schichten trennen, wobei sich oben Heptan und unten der Fixansatz befindet. Nach Ablauf von fünf Minuten entfernen Sie mit einer Pasteurpipette das überschüssige Salz aus dem Glasgefäß mit den Embryonen.

Spülen Sie die Embryonen mit entionisiertem Wasser, indem Sie etwa ein Milliliter entionisiertes Wasser auf das Glasröhrchen mit den Embryonen geben. Lassen Sie die Embryonen eine Minute lang stehen, bevor Sie das Wasser abgießen und durch eine 50 %ige Bleichmittel-Lösung ersetzen. Schütteln Sie das Röhrchen mehrmals von Hand und inkubieren Sie dann drei Minuten lang, um die Embryonen zu überziehen.

Die behandelten Embryonen sinken auf den Boden des Gefäßes. Embryonale CORs schwimmen oben. Entfernen Sie die Bleichlösung und die CORs nach der dreiminütigen Inkubation.

Nach der Dekoration die Embryonen gründlich mit entionisiertem Wasser spülen, wobei etwa ein Milliliter entionisiertes Wasser auf das Glasfläschchen mit den Embryonen gegeben wird. Die Embryonen eine Minute lang stehen lassen, bevor das überschüssige Wasser entfernt wird; verbliebene CORs schwimmen oben und sollten entfernt werden. Die Heptan-Fixierungslösung zu den Embryonen geben und diese 30 Minuten unter leichtem Schütteln inkubieren, um sie nach der Fixierung zu fixieren.

Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette das Fixativ, also die untere Schicht, wobei Heptan im Reagenzglas verbleibt. Geben Sie anschließend Methanol anstelle des Fixativs wieder in das untere Ende des Reagenzglases und verschließen Sie das Reagenzglas. Schütteln Sie es kräftig von Hand, um die Vitellinmembran zu entfernen. Danach werden die fixierten Embryonen auf den Boden des Reagenzglases absinken.

Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette das Methanol und die Hets aus dem Vial, wobei die deionisierten Embryonen zurückbleiben. Spülen Sie die Embryonen anschließend fünfmal mit Methanol, wobei das Methanol nach jeder Spülung mit einer Pasteurpipette abgenommen wird. Inkubieren Sie die Embryonen bei jeder Spülung jeweils fünf Minuten lang.

Die Embryonen in einer Mischung aus 50 % PBT-Lösung und 50 % Methanol für fünf Minuten inkubieren, um sie zu rehydrieren. Danach den Rehydrierungsprozess fortsetzen, indem die Embryonen für fünf Minuten in 100 % PBT-Lösung überführt werden. Anschließend die Embryonen blockieren, indem sie eine Stunde bei vier Grad Celsius in einer Lösung mit 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid inkubiert werden.

Bereiten Sie als Nächstes das Primärantikörper für die Färbung von Embryonen vor, indem Sie es mit einer Lösung aus 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid auf die geeignete Konzentration verdünnen. Die hier verwendeten Antikörper richten sich gegen das vesikuläre Cystein-String-Protein und das Anti-HRP-Antikörper. Anti-HRP erkennt eine neuronenspezifische Kohlenhydratmolekülgruppe, die in den Oberflächenglykoproteinen vorkommt und alle Neuronen markiert.

Die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius in der Primärantikörperlösung inkubieren. Die Embryonen zehnmal im Verlauf einer Stunde mit PBT waschen. Indem etwa ein Milliliter PBT auf das Glasfläschchen mit den Embryonen gegeben wird, die Embryonen sechs Minuten lang ruhen lassen, bevor das PBT entfernt wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang des Auftragens von PBT, der Inkubation und des Entfernens von PBT insgesamt zehnmal. Bereiten Sie die Sekundärantikörper-Lösung im Dunkeln vor, da sie lichtempfindlich ist, indem Sie sie auf die geeignete Konzentration verdünnen. Wir verwenden Alexa-Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1 zu 200.

Die Embryonen zwei Stunden bei vier Grad Celsius in der Sekundärantikörperlösung inkubieren. Das Glasgefäß mit den Embryonen und der Sekundärantikörperlösung mit Aluminiumfolie umwickeln, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Die Embryonen im Verlauf einer Stunde 10-mal mit PBT waschen.

Geben Sie Vektor-Schutz-Montagemedium zu den Embryonen hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius zur Montage. Saugen Sie die Embryonen mithilfe einer Pastellpipette zusammen mit etwas Montagemedium auf. Geben Sie die Embryonen und das Medium auf einen Objektträger.

Legen Sie ein Deckglas über die Embryonen und verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack. Visualisieren Sie die Embryonen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Das embryonale ZNS ist im Stadium 16 bis 17 dargestellt.

Cystin-Saite-Protein ist rot dargestellt. HRP-Neurone sind grün dargestellt. Beachten Sie die deutliche Färbung des Kommissurs in diesem repräsentativen Bild.

Das embryonale periphere Nervensystem ist im Stadium 16 bis 17 dargestellt. Wiederum ist das Cystin-String-Protein in Rot und die Neuronen in Grün dargestellt. Beachten Sie die wiederholten Muster der peripheren Neuronen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, aufmerksam mit den Embryonen umzugehen, um sie nicht versehentlich aus dem Reagenzglas zu entfernen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man oph fla-Embryonen für die Ganzpräparat-Darstellung des Nervensystems vorbereitet.