Name: Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Drosophila mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Strukturen und genetischer Einflüsse auf die Entwicklung.

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SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie die PEMFA Buffer mit 100 mM Pipes, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO 4. Den pH-Wert des Puffers auf 7,0. Die PEMFA Puffer sterilfiltriert und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten PBT, indem 1 ml Triton X-100 bis 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie 5% BSA (Rinderserumalbumin) mit 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0). </li><li> Bereiten Sie die Salzlösung mit 0,7% NaCl und 0,03% Triton X-100 in entionisiertem Wasser. </li><li> Bereiten Sie das Fixativ durch die Kombination von 4 Teilen PEMFA Puffer mit 1 Teil 37% Formaldehyd. </li></ol> 2. Sammlung von Embryos <ol><li> Bereiten Sie einen Käfig für die Drosophila-Stamm von Interesse, indem sie&gt; 100 fliegt in einer Kunststoff-Flasche mit einem Adapter mit Agar Fütterung Platte. </li><li> Lassen Sie den Käfig fliegt im Dunkeln bei Raumtemperatur für 72 Stunden, wechselnden Platten alle 8-12 Stunden, so dass die Fliegen, um den Käfig zu bekommen gewöhnt und halten nicht ihre Eier. </li><li> Für das Experiment sammeln Embryonen für 12 Stunden. Entfernen Sie die Petrischale aus dem Behälter und ersetzen Sie sie. Nehmen Sie die Petrischale entfernt und waschen die Embryonen von der Schüssel mit der Kochsalzlösung und einem sauberen Pinsel. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen in ein feines Sieb passieren. Spülen mit Kochsalzlösung, um überschüssige Hefe zu entfernen. </li><li> Mit einem Spatel vorsichtig abholen Embryonen und legen Sie sie in eine kleine Glasflasche mit einer Kappe. Fügen Sie zu 1 ml Kochsalzlösung. </li></ol> 3. Die Entfernung des Chorion und Dottergangzyste Membranen und Fixation <ol><li> Nach der Sammlung von Embryonen, bereiten Sie die Heptan-Fix-Lösung durch die Kombination von 50% Heptan und 50% Fixativ. Die Lösung wird mit Heptan oben und das Fixativ auf dem Boden geschichtet werden. </li><li> In dem Glasfläschchen waschen die Embryonen durch Inkubation in der Salzlösung für 5 Minuten. Entfernen Sie das überschüssige Salz mit einer Pasteurpipette. </li><li> Spülen Sie die Embryonen mit entionisiertem Wasser. </li><li> Dechorionate die Embryonen durch Inkubation in 50% Bleichmittel für 3 Minuten. </li><li> Spülen Sie den Embryonen gründlich mit entionisiertem Wasser. </li><li> Fix die Embryonen durch Inkubation für 30 Minuten in der Heptan-Fix-Lösung unter leichtem Schütteln. </li><li> Mit einer Pasteurpipette ersetzen die Fixiermittel (unterste Schicht) mit Methanol Verlassen des Heptan in die Röhre. Kräftig schütteln, um die Dotterhaut zu entfernen. Die devitellinized Embryonen wird am Ende der Röhre zu versenken. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen in eine neue Glasflasche mit einer Pasteurpipette. Spülen Sie den Embryonen fünfmal mit Methanol, inkubieren jedes Mal die Embryonen für 5 Minuten. </li></ol> 4. Antikörper-Färbung, Montage-und Visualisierungs- <ol><li> Rehydrieren die Embryonen in einem Gemisch aus 50% PBT-Lösung und 50% Methanol für 5 Minuten. Dann in 100% PBT-Lösung rehydriert für 5 Minuten. </li><li> Blockieren Sie die Embryonen durch Inkubation in 5% BSA mit 0,01% NaAcide Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Embryonen sind nun bereit für die Antikörper-Färbung. Bereiten Sie den primären Antikörper durch Verdünnen auf die geeignete Konzentration mit 5% BSA mit 0,01% NaAcide Lösung. Wir verwenden ein Antikörper gegen das Cystein-String-Protein (CSP), eine vesikuläre synaptischen Protein und ein Anti-HRP oder Meerrettichperoxidase-Antikörper, der eine neuronale spezifische-Kohlenhydratanteil in der Oberfläche Glykoproteine ​​und Etiketten aller Neurone erkennt. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht bei 4 ° C in den primären Antikörper-Lösung. </li><li> Am folgenden Tag, waschen Sie die Embryonen 10 Mal mit PBT über den Verlauf einer Stunde. </li><li> Bereiten Sie den sekundären Antikörper-Lösung durch Verdünnung der entsprechenden Konzentration. Wir verwenden Alexa Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1:200. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen für 2 Stunden in 4 ° C in den sekundären Antikörper-Lösung. </li><li> Waschen Sie die Embryonen 10 Mal mit PBT über den Verlauf einer Stunde. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in Vectashield Eindeckmedium. </li><li> Montieren Sie die Embryonen auf einem Glasträger und Dichtung das Deckglas mit Nagellack. Visualisieren Embryonen mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Zusammengeführt Abbildung 1: Eine repräsentative Bilder, die die embryonalen ZNS im Stadium 16-17, mit Antikörpern gegen CSP (rot) und HRP (grün). Beachten Sie die unterschiedliche Färbung der Kommissur. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> HRP-FITC "/&gt; Zusammengeführt Abbildung 2: Eine repräsentative Bilder, die die embryonale PNS bei Stufe 16-17 mit Antikörpern gegen CSP (rot) und HRP (grün). Beachten Sie die sich wiederholenden Mustern von peripheren Neuronen.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

Die Drosophila-Embryo ist ein leistungsstarkes System für die Untersuchung der zellulären und molekularen Veränderungen während der neuronalen Entwicklung. In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie man ganze Berg Embryonen für die Immunhistochemie vorzubereiten. Wir haben dieses Protokoll aus dem Protokoll in Carroll und Scott, 1985, beschrieben angepasst. Dieses Protokoll kann auch angepasst werden andere neuronale Antikörper-Test, sondern die Optimierung von Antikörpern getan werden sollte. Darüber hinaus kö...

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung des embryonalen nervensystems in whole-mount drosophila embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Die Drosophila-Embryo ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen der neuronalen Entwicklung. Hier beschreiben wir das Verfahren für die Visualisierung von Drosophila embryonalen Nervensystems mit Antikörpern gegen neuronale Proteine. Da die gesamte embryonalen peripheren Nervensystems und des zentralen Nervensystems sind gut auf der Ebene der einzelnen Zellen (..; Bodmer et al, 1987;. Dambly-Chaudière et al, 1986 Bodmer et al, 1989) charakterisiert, jede Aberrationen zu diesen Systemen können leicht identifiziert werden mit Antikörpern gegen verschiedene neuronale Proteine. Die Embryonen sind zu bestimmten Zeiten gesammelt, um sicherzustellen, dass die Embryonen in die richtige Entwicklungsstadien für die Visualisierung sind. Nach dem Sammeln werden die äußeren Schichten des Embryos, das Chorion Membran und der Dotter-Umschlag, der den Embryo umgibt, vor der Fixierung entfernt. Die Embryonen werden dann mit neuronalen Antikörpern und visualisiert mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper. Embryos in den Stadien 12-17 visualisiert werden, um die embryonalen Nervensystems zugreifen. Auf Stufe 12 des ZNS Keimstreifs beginnt Verkürzung und von Stufe 15 die endgültige Muster der Kommissur erreicht worden ist. Mit Stufe 17 des ZNS Verträge und die PNS ist voll erschlossen (Campos-Ortega et al. 1985). So Veränderungen in der Struktur des PNS und ZNS können leicht in diesen Entwicklungsstadien beobachtet werden.

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung inszeniert<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für die Visualisierung des embryonalen Nervensystems während der Embryogenese.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Der Drosophila-Embryo ist ein attraktives Modellsystem zur Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen der neuronalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Oph- und Melanogaster-Embryonen für die Ganzpräparat-Darstellung des Nervensystems vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus dem gewünschten Fliegenstamm gesammelt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Corium mit Bleiche zu entfernen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Heptan und Methanol aufzutragen, um die Vilin-Membran zu entfernen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Applikation von Antikörpern auf die Embryonen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Struktur des Nervensystems des Drosophila-Embryos mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Mutationen im sich entwickelnden Nervensystem spielen können. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie versehentlich Embryonen aus dem Reagenzglas heraussaugen können. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die benötigten Reagenzien vorbereiten, darunter P-E-M-F-A, Puffer PBC mit 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid in Salzlösung sowie Formaldeh

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Drosophila melanogaster-Larven bieten ein ideales Modellsystem, um die Mechanismen der axonalen Transport innerhalb Larven segmentalen Nerven zu untersuchen. Mit diesem Verfahren können 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen zu Wildtyp-Larven verglichen werden.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für...

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Quelle: Jeong, S. Visualisierung des axonalen Projektionsmusters embryonaler Motoneuronen in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Visualisierung von axonalen Projektionen in Drosophila Embryonen. Die Immunmarkierung von Motoneuronen, die präzise Dissektion zur Freilegung neuronaler Strukturen und die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen zusammen eine detaillierte neuronale Architektur, wobei die axonalen Projektionsmuster hervorgehoben werden.

Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

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Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

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Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

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Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

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Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Lernen Sie die Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Drosophila mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Strukturen und genetischer Einflüsse auf die Entwicklung.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

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