Name: Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie RNA/DNA-Hybride in lebenden Hefezellen durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden erzeugt werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Informationsübertragung von RNA auf genomische DNA.

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Diese Arbeit wurde von der Georgia Cancer Coalition grant-R9028 unterstützt.

Gründe Ausnutzung der Verwendung von Thermo Scientific Dharmacon Oligos, 50 bis 80-mers, hier präsentieren wir ein Verfahren, basierend auf einem Gen-Korrektur-Assay, durch die Oligos genetischen Information, um genomische DNA von Hefezellen übertragen kann, folgende Glühen, das Ziel chromosomalen DNA. Erfolgreiche Ausrichtung von Oligos ist durch das Auftreten von Hefe-Kolonien in dem die voraussichtliche Phänotyp erzielt. Wenn die gewünschte genetische Veränderung innerhalb eines oder mehrerer Ribonukleotiden in der Oligo-Sequenz eingebaut durchgeführt wird, fließt die genetische Information direkt aus der RNA-Darm-Trakt der chromosomalen Ziel-DNA, also ein RNA / DNA-Hybrid bildet bei der chromosomalen Ebene während der Targeting-Prozess. Die Ribonukleotid / s aus einem Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo kann als Vorlage für Gen-Targeting über DNA-Reparatur-Synthese dienen oder in die DNA integriert werden und dienen als Vorlage bei der DNA-Replikation. In diesen Experimenten verwenden wir die Hefe / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotischen Modellsystem, aber einen ähnlichen Ansatz auch in anderen Organismen oder Zellen angewendet werden. In diesem Video, verwenden wir ein Thermo Scientific Dharmacon Oligo mit Homologie konzipiert, um ein Ziel Hefe genomischen Lokus und die einen Ribonukleotid in der Mitte, um eine Mutation im Zielgen zu korrigieren. Nach der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo beobachten wir die Korrektur der Ziel-Website bei einer bestimmten Frequenz, was bedeutet, dass die RNA-Darm-Trakt der Oligo in die chromosomale DNA konnten integriert werden und dienen als Vorlage für die DNA-Synthese während der DNA-Replikation gibt. Die genetische Information in der RNA-Darm-Trakt getragen wird stabil an die folgenden Generationen Zelle übertragen. Hier beschreiben wir die Schritte der Hefezelle Umbildung durch den Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo-und die Annäherung an die RNA Informationen übertragen in die chromosomale DNA zu erkennen. A. Aufbau der RNA-haltigen Oligo in diesem Experiment verwendet Wir haben ein RNA-haltigen Oligo um einen genetischen Defekt in der Hefe zu korrigieren konzipiert S. cerevisiae chromosomale DNA an der trp5 Locus. Der Hefestamm in das verwendete Protokoll enthält eine Mutante trp5 Gens mit einer Zwei-Basendeletion und eine Nonsense-Mutation (Abbildung 1A). Solche Hefestamm ist ein Tryptophan auxotrophen Mutante und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan. Die DNA-Sequenz des Gens TRP5 finden Sie auf der Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Die Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo im Sinne dieses Protokolls ist ein 65-mer mit einem 2-base DNA-Insertion, entwickelt, um die Deletionsmutation und ein Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation des trp5 Allel (Abbildung 1A) richtig zu korrigieren. Die Sequenz des Oligo ist wie folgt aufgebaut: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Diese Oligo wird von Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bei 200 nm-Maßstab und wird entsalzt, entschützt und ohne PAGE Reinigung. B. Herstellung der RNA-haltigen Oligo für Hefe-Transformation (modifiziert nach Storici et al., 2007 1) <ol><li> Wischen Sie Materialien, die für das Experiment mit Oligo Röhren, Pipetten, Wirbel, Racks, experimentellen Bereich und Handschuhe von den Prüfern mit RNase Dekontaminationslösung mögliche RNase Kontamination vor alles beginnt zu entfernen getragen verwendet werden. Verwenden RNase-freies Wasser, chemische Reagenzien, Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen in allen Schritten. Jeder Schritt in diesem Experiment sollte RNase-frei sein. </li><li> Resuspendieren Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo erhielt von der Firma zu 250 pMol / ul Stammlösung mit RNase-freiem Wasser und kräftig vortexen, um das Pellet zu lösen. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Unmittelbar vor der Transformation, tauen die RNA-haltigen Oligo auf Eis und verdünnter zu 50 pMol / ul mit RNase-freiem Wasser in RNase-freie Rohre. Jeder Wandel erfordert 1 nmol der RNA-haltigen Oligos. </li><li> Denaturieren eine gewählte Höhe der RNA-haltigen Oligos auf dem 100 ° C Hitze-Block für 2 min zur sekundären Strukturen des Oligos zu beseitigen. </li><li> Unmittelbar nach Denaturierung statt der Röhre auf dem Eis. Keep on ice bis Transformation. </li><li> Als Kontrolle in dem Experiment eine entsprechende DNA-Oligo nur verwendet wird. Diese Oligo ist von -20 ° C aufgetaut und zubereitet für die Transformation als RNA-haltigen Oligo, wie oben beschrieben. </li></ol> C. Transformation von Hefezellen mit Hilfe der RNA-haltigen Oligo <ol><li> Impfen 5 ml reichen YPD-Flüssigmedium mit der trp5 mutierten Hefezellen wachsen und bei 30 ° C über Nacht (siehe Materialien). </li><li> Übertragen 1,5 ml der Übernacht-Kultur in 50 ml YPD flüssigen Medium. </li><li> Inkubieren von Zellen in einer 30 ° C Schüttler (225 rpm) für 4h. </li><li> Bereiten Sie Lösung 1und Lösung 2 unmittelbar vor der Transformation in RNase-freie Röhrchen (siehe Materialien). </li><li> Übertragen Sie die Zellkultur zu einer 50 ml RNase-freies Röhrchen und drehen sich mit 3000 rpm, das entspricht bis 1562 g, für 2 min. Das Pellet aus der Zelle Niederschlag liegt bei ca.. 0,3 cm 3. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 ml RNase-freies Wasser und drehen sich mit 3000 rpm für 2 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 für 5 mal loswerden das Kulturmedium und RNasen, die vorhanden sein in dem Medium so weit wie möglich könnte. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 5 ml der Lösung 1 und Spin bei 3000 rpm für 2 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 250 ul Lösung 1. Diese Menge an Zellen reicht für 7-8 Transformationen. </li><li> Aliquot 50 pl der Zellsuspension in RNase-freien Reaktionsgefäßen, fügen Sie 20 ul RNA-haltigen Oligo funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul DNA-Oligo nur funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul sterilem Wasser ohne Oligo für die negative Kontrolle. Dann fügen Sie 300 ul Lösung 2 für jede Transformation Reaktion. Es gibt keine Notwendigkeit, Lachs-Sperma-DNA in den Prozess der Transformation hinzu, wie die Oligos fungieren als Träger selber. </li><li> Vortex kräftig zu mischen Komponenten homogen. </li><li> Inkubieren Transformation Reaktionen bei 30 ° C für 30 min in einem Shaker. </li><li> Hitzeschock bei 42 ° C für 15 min. </li><li> Spin down Zellen bei 5000 rpm, das entspricht 2236 g, für 4 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 100 ul sterilem Wasser. </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot dieser Zellsuspension und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser von 100.000-fache und Platte-Zellen auf einer YPD Platte mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Platte aller resuspendierten Zellen aus jeder Transformation Reaktion auf eine Petrischale aus Kunststoff komplette festen Medium ohne Tryptophan (SC-Trp) mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 4-5 Tage (Abbildung 2). </li></ol> D. Analyse von Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo <ol><li> Zählt die Anzahl der Kolonien auf der selektiven Medium (Abbildung 2) sowie auf YPD-Medium, das Gen-Korrektur-Frequenz für den RNA-haltigen Oligo berechnen, die DNA-only Oligo-und für die no-Oligo-Steuerung. Vergleichen Sie die Nummer erhalten. Spontane Rückkehr von der trp5 Allele mit dem Zwei-Basendeletionen und die Nonsense-Mutation ist weniger als 10-9 in den verwendeten Hefestamm, so erwarten wir keine Kolonien Bildung auf der selektiven Medium, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzu. </li><li> Streak aus mehreren zufällig ausgewählten Transformante Kolonien auf YPD-Medium, um einzelne Kolonie isoliert zu erhalten. Warten Sie zwei Tage für Koloniewachstum, dann nehmen Sie mehrere (mindestens 5) einzelne Kolonien und machen Flecken auf YPD und auf selektivem Medium. </li><li> Entwerfen Sie ein Paar von Primern für die Region (250-1.000 bp) durch die RNA-haltigen Oligo durch Kolonie-PCR (Abbildung 1B) gezielt zu verstärken. Das Verfahren für die Kolonie-PCR ist wie folgt (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 2). <ol><li> Die Zellen (ca. 1 mm3) aus den einzelnen Patches in 50 ul Wasser aufgenommen und fügen Sie 1 Einheit des Lyticase. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min, durch Inkubation in einem Heizblock folgte bei 100 ° C für 5 min zu den Zellen und Freisetzung genomische DNA in Lösung zu brechen. </li><li> PCR-Bedingungen: Die PCR-Reaktion umfasst 10 ul der Zelle Resuspension, 50 pmol jedes von Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 1 ul 10 mM dNTPs, 1 Einheit Taq-Polymerase, 5 ul 10x Puffer und mit sterilem Wasser bis zu einer eingestellten Endvolumen von 50 ul durchgeführt. Das PCR-Programm wird 3 min bei 95 ° C, 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C, eine letzte Verlängerung der Zeit von 7 Minuten bei 72 ° C, dann Proben werden bei 4 ° C gehalten Eine Verlängerung der Zeit von 1 min / kb ist für diese Reaktion angenommen. </li><li> Nach PCR werden die Proben auf einem 1% oder 2% (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe des PCR-Produkts) Agarosegel für die Beobachtung des PCR-Produkts (Abbildung 3) ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Wenn die genetische Information von der RNA-haltigen Oligo übertragen erzeugt eine neue Restriktionsschnittstelle in der Hefe genomischen Zielregion (Abbildung 1B), ist es möglich, die korrekte Übermittlung von Informationen durch Verdau des PCR-Produkts mit dem entsprechenden Restriktionsenzym zu überprüfen. Wenn keine Restriktionsschnittstelle durch die RNA-haltigen Oligo erzeugt wird, gehen Sie zu Schritt 6 weiter. Digest PCR-Produkte mit einem bestimmten Restriktionsenzym. Die Abbaureaktion umfasst 6 ul PCR-Produkt, Puffer, BSA (nicht benötigt für einige Enzyme, siehe Anleitung für das Enzym verwendet werden), 0,5 ul Restriktionsenzym und sterilem Wasser auf 15 ul. Die Proben werden für 1 h bei der Temperatur spezifisch für das verwendete Enzym inkubiert. </li><li> Führen Sie eine unverdaute Probe zusammen mit dem verdauten Proben auf der gleichen Zeile einer 2% igen Agarosegel zubeobachten die genetische Veränderung durch die RNA-Darm-Trakt des RNA-haltigen Oligo (Abbildung 3) übertragen. </li><li> Purify PCR-Produkte durch Verwendung eines PCR-Purification Kit und bereiten sie für die DNA-Sequenzierung. Submit Proben für die Sequenzierung mit dem gleichen Primer verwendet, um ein Produkt zu verstärken. </li><li> Analysieren Sie die DNA-Sequenzierung Ergebnisse mit Software, die Ausrichtung von mehreren Sequenzen mit einer ausgewählten Referenz-Sequenz (Abbildung 4) ermöglicht. </li></ol> E. Alkalibehandlung der RNA-haltigen Oligo (Abbildung 5) <ol><li> Für jede Reaktion add 1 nmol (4 ul von 250 pMol / ul Stammlösung) der RNA-haltigen Oligo-oder DNA-Oligo in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Add 4 ul 1 M NaOH für die Hydrolyse, oder alternativ add 4 ul H 2 O als negative Kontrolle, und inkubieren Sie bei 65 ° C im Wasserbad für 1 h Dann aus dem Wasserbad, um Eis zu bewegen. </li><li> Neutralisieren mit 2 ul von 1,2 M HCl, 4 ul 1 M Tris-HCl und 4 ul H 2 O, oder alternativ 6 ul H 2 O und 4 ul 1 M Tris-HCl für negative Kontrolle. Keep on ice bis Transformation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung des defekten trp5 Gens und des TRP5 Allel durch die RNA-haltigen Oligo korrigiert. A) Die trp5 mutierte Gen enthält einen 2-base-Deletion (schwarze Dreiecke) und 1-Basis Nonsense-Mutation (Stern). Die einsträngige RNA-haltigen Oligo mit 2-base Insertion (blaue Schleife) und 1-RNA Basenaustausch (rotes Rechteck) Erzeugen eines Van91 ich Restriktionsenzymstelle (dargestellt durch die Klammer) wird in Hefezellen transformiert, um die genetische Defekte zu korrigieren der trp5 Gen. B) Nach dem TRP5 Gen durch die RNA-haltigen Oligo (korrigiert Basen sind als blaue Rechtecke gekennzeichnet) repariert wird, ist die Van91 I-Stelle in die TRP5 Gen erzeugt. A 278 bp-Fragment mit nur einem Van91 I Restriktionsschnittstelle in TRP5 Gen PCR durch ein Paar von Primern (P1 und P2) verstärkt. Die 177 bp und 101 bp Fragmente nach Aufschluss der P1-und P2-PCR-Produkt von Van91 generiert I sind ebenfalls dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Transformation Ergebnis mit der RNA-haltigen Oligo. A) Hefezellen ohne Oligo verwandelt bilden keine Kolonie auf dem SC-Trp Medium, siehe Platten ab. B) Die Platten cg zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der RNA-haltigen Oligo umgewandelt. C) Platten hl zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der entsprechenden DNA-only Kontrolle Oligo umgewandelt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Detektion von genetischen Information Transfer vom RNA-haltigen Oligo Hefe chromosomale DNA durch Restriktionsverdau des PCR-Produktes verstärkt die gezielte genomischen Region. 2% Agarosegelelektrophorese von PCR-Proben, die durch P1 und P2 verstärkt und verdaut mit Van91 I Restriktionsenzym. Spuren 1, 8 und 15, DNA-Leiter mit Größen von 100, 200, 300, 400 und 500 bp angegeben auf der linken Seite; Spur 2, PCR-Produkt von trp5 locus von der genomischen DNA des trp5 Mutante verstärkt; Spur 3, PCR Produkt aus genomischer DNA aus einer Trp + Kolonie durch die DNA-Oligo nur gezielt abgeleitet verstärkt, Spur 9 bis 14, Van91 I Restriktionsverdau, Spur 4-7, PCR-Produkte von genomischer DNA aus Trp +-Kolonien durch die RNA-haltigen Oligo gezielt abgeleitet verstärkt der PCR-Produkte von Bahnen 2 bis 7. Die Präsenz der uncut-PCR-Produkt-Bands in den Bahnen 10 bis 14 können durch partielle Verdauung durch Van91 ich am TRP5 Locus (CCACATTCTGG) erläutert. In Anbetracht, dass die Schneiden Website für Van91 I (CCANNNN NTGG) können mehrere Sequenzen haben, kann die Seite in TRP5 erzeugt nicht die optimale Ziel für das Enzym. In der Tat, nach DNA-Sequenzierung aller oben genannten PCR Produkte, die wir erkennen keine weiteren Änderungen über die von der Oligos durchgeführt (siehe Abbildung 4). Die 278 bp PCR-Bande von P1 und P2-Primer und die Verdauung Produkt-Banden durch Van91 verstärkt I von 177 bp und 101 bp sind durch die Pfeile auf der rechten Seite angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 4Daumen" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4Thumb"></a> Abbildung 4. DNA-Sequenzierung Ergebnisse zeigen Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo. A) DNA Elektropherogramm der genomischen Region des RNA-haltigen Oligo ausgerichtet. Das G in der DNA-Sequenz (blau boxed) leitet sich von der RG auf der RNA-haltigen Oligo. Auch boxed ist das Einsetzen der CG Basen. Sequencing Ergebnisse aus allen anderen PCR-Produkte werden auch als clear wie dieses, mit fluoreszierenden Signale weit über dem Hintergrund. B) Sequenzen der TRP5 Region des Trp + Transformanten durch die DNA-only Oligo (T1) und der RNA-haltigen Oligo (T2-T5) entsprechen in der Konsensus-Sequenz auf dem Gipfel zielgerichtet und sind mit denen der trp5 mutierten Zellen im Vergleich vor Targeting durch die Oligos (Genomic DNA, rot schattiert). Die Reparatur-RNA-haltigen Oligo auf der Unterseite hat zwei-base DNA-Insertion und einer-base (G) RNA-Substitution in rot markiert. Die Regionen boxed in blau mit gelben Farbton zeigen, dass die RNA-haltigen Oligo sowie die DNA-Oligo nur präzise korrigiert die Deletionsmutation und Nonsense-Mutation in allen getesteten Proben. Die gestrichelten Linien markieren die Position des RNA-haltigen Oligo-Sequenz. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Alkalibehandlung verhindert Gen Korrektur durch den RNA-haltigen Oligo. Die Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo (R) in den roten Balken, und dass durch die DNA-only Oligo (D) ist in den blauen Balken angezeigt wird angezeigt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes für 3 unabhängige Transformationen für jedes Oligo. Die DNA-only Oligo zeigt ähnliche Transformation Frequenz ohne und mit NaOH-Behandlung. Anders fällt Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo auf 0 nach der Behandlung mit NaOH. Daher ist die Vorbereitung mit der RNA-haltigen Oligo nicht mit DNA-Oligo nur verunreinigt, so ist die beobachtete Umwandlung Frequenz spezifisch für den RNA-haltigen Oligo.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

Die Videoproduktion für diesen Artikel wurde von Thermo Fisher Scientific, die Reagenzien und Instrumenten in dieser Publikation verwendeten produziert gesponsert.

Die Tatsache, dass RNA kann genetische Information direkt zu übertragen, um genomische DNA in Zellen entdeckt wurde Ausnutzung der Verwendung von synthetischen RNA-haltigen Oligos (Dharmacon synthetisiert Oligos) 1. Es war der proof of principle, dass die Zellen RNA-Moleküle oder RNA-Sequenzen nur als Vorlagen für die DNA-Synthese verwendet werden kann. Die Verwendung von RNA-haltigen Oligos nicht nur um die Demonstration führte, dass genetische Informationen direkt aus RNA übertragen werden, um genomische DNA, ohne die Notwendigkeit eines Reverse Transkription DNA-Kopie Zwischen-, sondern auch der Beweis, dass RNA als homologe Vorlage kann in eingesetzt werden die Reparatur eines DNA-Schäden 1,3. Die Oligos kann der RNA-only gemacht werden oder enthalten nur eine einzige Ribonukleotid in eine DNA-Sequenz eingebettet, wie in dem Beispiel haben wir hier vorgestellt. Die RNA-haltigen Oligo hat einen eingebetteten Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation in der genomischen defekte trp5 Allel zu korrigieren. Die Übertragung der genetischen Information von der Ribonucleotid der genomischen DNA wird durch eine Änderung im Phänotyp (Zelle wächst auf dem Medium ohne Tryptophan) der Zielzellen enthüllt. Die Frequenz von Gen-Korrektur mit der RNA-haltigen Oligo wird gemessen und verglichen mit einer Kontroll-DNA-only-Oligo. Mit der Durchführung dieses Gen-Korrektur-Assay in verschiedenen Zell-Hintergründe, wo wir zu mutieren verschiedenen Hefe-Gene, können wir erkennen, welcher Faktor / s speziell beeinflussen gezielt durch die RNA-haltige Oligos. So können wir zeigen, Mechanismen, wie Zellen die Stabilität der RNA / DNA-Hybride zu regulieren. Durch einfaches Design verschiedene Varianten der RNA-haltigen Oligos können wir die Wahrscheinlichkeit für eine bestimmte RNA-Darm-Trakt als Vorlage in DNA-Modifikation dienen festzustellen, und wir können die Stabilität der RNA-Sequenzen in DNA eingebettet zu bestimmen. Darüber hinaus können wir erkennen, was sind die bevorzugten in vivo Substrate für Faktoren der Interaktion mit RNA / DNA-Hybride. Während einige in-vitro-Studien, vor allem unter Verwendung von kurzen RNA-haltigen Oligos, wurden durchgeführt, um die Funktion von Faktoren, die RNA in eine hybride erkennen kann, mit DNA, wie die RNase H Enzyme 4, die in vivo Funktionen von RNasen H sowie Charakterisierung wie die Identität von anderen Proteinen, die Auswirkungen auf RNA / DNA-Hybrid Stabilität bleiben meist unbekannt könnten. Die Möglichkeit zu nutzen RNA-haltigen Oligos, die eine beträchtliche Länge (50 bis 80-mere) und optimale Qualität (z. B. Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos) hat die Art und Weise zu untersuchen, ein breites Spektrum an molekularen Prozesse direkt in vivo in der offenen Zellen von Interesse. Wie in diesem Video, Transformation gezeigt mit RNA-haltigen Oligos erfordert im wesentlichen nur ein paar zusätzliche Schritte im Vergleich zu Transformation mit DNA-Molekülen, den Abbau durch RNasen zu verhindern. So kann die Transformation unter Verwendung von RNA-haltigen Oligos ist nicht auf die Hefe-System beschränkt, sondern auf jeden Organismus oder Zelltyp, wo Transformation von DNA Oligos beherrscht angewendet werden. Abschließend gezielt Zellen durch RNA-haltigen Oligos bietet die Möglichkeit, RNA / DNA-Hybride und Ribonukleotiden in DNA in vivo in Zellen eingebettet zu generieren. Die Stabilität, Funktion und Folgen dieser in vivo generierten RNA / DNA-Hybride können analysiert und charakterisiert werden, die möglicherweise die Aufdeckung unbekannter Mechanismen der DNA-Reparatur und aufschlussreiche neue Strategien für die Gen-Targeting.

A. Transformation Reagenzien und Medien (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Yeast Peptone Dextrose): Für 1 L, 10 g Hefeextrakt, 20 g Soja-Pepton, 20 g Dextrose. Fügen Sie 15 g Agar auf YPD festen Medien zu machen. Autoclave vor dem Gebrauch. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Lösung 1: 0,1 M Lithium-Acetat. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Wandel. Lösung 1 ist eine funktionierende Lösung, so ist es direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung hergestellt wird. Halten Sie bei Raumtemperatur. LiAc erhöht die Hefezellwand Permeabilität für DNA. </li><li> Lösung 2: 0,1 M Lithium-Acetat und 50% Polyethylenglykol 4000. Auch die Lösung 2 ist eine funktionierende Lösung, und es ist direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung angesetzt. Halten Sie bei Raumtemperatur. PEG Ablagerungen Oligos auf Hefezellen. </li><li> RNA-haltige Oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50 bis 80-mers, entsalzt, entschützt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 250 pMol / ul. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> DNA-Oligos nur, 5-80-mers, entsalzt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic komplette Medien fehlt Tryptophan) festen Medien. </li><li> 0,5 cm Durchmesser Glasperlen, durch Autoklavieren sterilisiert. </li><li> RNase-off: RNase-Dekontamination Lösung. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile Zentrifugenröhrchen. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile konische Rohre. </li><li> DNase / RNase-frei, steril Aerosol Pipettenspitzen mit ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colony PCR Materialien. <ol><li> DNA-Primer, entsalzt und nicht gereinigt. Man löst in sterilem Wasser auf 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Taq DNA Polymerase, Puffer, dNTPs. </li><li> PCR-Röhrchen. </li></ol> C. PCR-Aufreinigung. <ol><li> PCR Purification Kit. </li></ol> D. Gel-Elektrophorese. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE-Laufpuffer (45 mM Tris-Borat und 1 mM Ethylendiamintetraacetat) ab 10x TBE verdünnt. </li><li> Prestained Molekulargewichtsmarker. </li><li> DNA Loading Dye. </li></ol> E. Restriktionsverdau. <ol><li> Restriktionsenzyme, 10x Puffer, BSA. </li></ol> F. Alkalibehandlung für die RNA-haltigen Oligo. <ol><li> 1 M NaOH-Lösung. </li><li> 1,2 M HCl-Lösung. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7,4 Lösung. </li></ol>

generierung von rna / dna-hybride in genomischer dna durch transformation mit rna-haltigen oligonukleotiden

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetische kurzen Nukleinsäure-Polymere, Oligonukleotide (Oligos), sind die funktionellen und weit verbreitete Methoden der Molekularbiologie. Oligos erzeugt eine beliebige DNA-oder RNA-Sequenz enthalten sein und kann bereit sein, eine Vielzahl von Basis-und Zucker-Modifikationen zählen werden. Darüber hinaus können Oligos entwickelt, um spezifische Nukleinsäure Veränderungen imitieren und damit als wichtige Werkzeuge dienen dazu, Auswirkungen von DNA-Schäden und Mechanismen der Reparatur zu untersuchen. Wir fanden, dass Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos mit einer Länge zwischen 50 und 80 Nukleotiden kann besonders geeignet um zu studieren, in vivo, Funktionen und Folgen der chromosomalen DNA / RNA-Hybriden und der Ribonukleotiden zu DNA eingebettet. RNA / DNA-Hybride können leicht während der DNA-Replikation,-Reparatur und Transkription zu bilden, aber sehr wenig über die Stabilität der RNA / DNA-Hybride in den Zellen und in welchem ​​Umfang diese Hybriden kann die genetische Integrität der Zellen beeinflussen bekannt. RNA-haltige Oligos, daher stellen eine perfekte Vektor Ribonukleotiden in die chromosomale DNA einzuführen und erzeugen RNA / DNA-Hybride der gewählten Länge und Basenzusammensetzung. Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für die Aufnahme von Ribonukleotiden in das Genom der eukaryotischen Modellsystem Hefe / Saccharomyces cerevisiae /. Dennoch hat unser Labor genutzt Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos an RNA / DNA-Hybride bei der chromosomalen Ebene in verschiedenen Zellsystemen zu generieren, von Bakterien bis zu menschlichen Zellen.

Diese Arbeit zeigt, wie ein RNA / DNA-Hybrid bei der chromosomalen Ebene bilden und zeigen Übertragung der genetischen Information von RNA, um genomische DNA in Hefezellen.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetische kurze Nukleinsäurepolymere, Oligonukleotide (Oligos), sind die funktionalsten und am weitesten verbreiteten Werkzeuge der Molekularbiologie. Oligos können ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, auf chromosomaler Ebene in lebenden Hefezellen R-N-A-D-N-A-Hybride zu erzeugen, indem die Hefezellen mit RNA-haltigen Oligos transformiert werden. Dies wird erreicht, indem ein einzelsträngiges, RNA-haltiges Oligo in teilende Hefezellen eingeführt wird. In einem zweiten Schritt lagern sich die mittels des RNA-haltigen Oligos transformierten Zellen auf selektivem Medium aus.Dies ermöglicht das Wachstum von Zellen, in denen der RNA-Abschnitt des Oligos als Vorlage für die Korrektur des mutierten Markergens dient. Anschließend werden Hefe-Kolonien, die auf dem selektiven Medium wachsen, ausgewertet, um die Häufigkeit der Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den Transfer genetischer Information von der RNA-Sequenz des Oligos auf das mutierte Markergen im Hefe-Genom. Dies ergibt sich aus der Restriktionsverdauungsanalyse, der Sequenzanalyse und dem Alkalilabilitäts-Assay.Hallo, ich bin HIN-Gründerin, dem Labor von Dr. Francesca an der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung von R-N-A-D-N-A-Hybriden auf chromosomaler Ebene in lebenden Hefezellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie die Anwesenheit von in genomische DNA eingebetteter RNA von Zellen toleriert wird, und um festzustellen, welche Faktoren die Stabilität von R-N-A-D-N-A-Hybriden in vivo beeinflussen.Beginnen wir nun. Vor Beginn dieses Verfahrens alle Materialien, die für das Experiment verwendet werden, einschließlich Oligo-Röhrchen, Pipetten, Vortex-Racks, Versuchsbereich und Handschuhe des Untersuchers, mit RNasen-Deskontaminationslösung abwischen. Um jegliche mögliche RNasen-Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie im gesamten Verfahren RNasen-freies Wasser, chemische Reagenzien, Röhrchen und Pipettenspitzen.Verwenden Sie ein RNA-haltiges Oligonukleotid, um genetische Information in die genomische DNA von Hefezellen einzubringen. Der hier verwendete Hefestamm enthält ein mutiertes Trip5-Gen mit einer Deletion von zwei Basen und einer Nonsense-Mutation. Ein solcher Hefestamm ist ein Tryptophan-auxotropher Mutant und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan.Das RNA-haltige Oligo ist ein 65 MER mit einer zweibasigen DNA-Einlagerung, die zur Korrektur der Deletionsmutation konzipiert ist. Zusätzlich enthält das Oligo ein Ribonukleotid zur Korrektur der Nonsense-Mutation des trip five-Allels. Sobald es vorliegt, bereiten Sie das RNA-haltige Oligo gemäß der schriftlichen Anleitung zu einer 250 µM Stammlösung vor. 16 Stunden vor der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo impfen Sie an.Fünf Milliliter reichhaltiges flüssiges Hefe-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium mit den trip fünf Mutanten-Hefezellen versetzen und die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius kultivieren. Nach der Übernachtkultivierung 1,5 Milliliter der Übernachtkultur in 50 Milliliter flüssiges YPD-Medium überführen. Die Zellen vier Stunden vor der Transformation vier Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute inkubieren.Die RNA-haltigen Oligos und die entsprechenden DNA-Only-Oligos auf Eis geben. Die entsprechenden DNA-Only-Oligos dienen als positiver Kontrollansatz. Verdünnen Sie die Oligos mit RNA-freiem Wasser in RNA-freien Röhrchen auf 50 Mikromolar.Bereiten Sie 70 Mikroliter jedes Oligos vor, um genügend Probe für drei Transformationen von einem Mol mit etwas überschüssiger Denaturierung zu haben; erhitzen Sie die RNA-haltigen und die reinen DNA-Oligos auf dem 100 °C-Heizblock für zwei Minuten, um sekundäre Strukturen der Oligos unmittelbar nach der Denaturierung zu beseitigen. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und belassen Sie sie dort, bis die Transformation erfolgt. Bereiten Sie Lösung eins und Lösung zwei unmittelbar vor der Transformation in RNA-freien Röhrchen vor. Überführen Sie die Zellkultur in ein 50-Milliliter-RNA-freies Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 3000 Umdrehungen pro Minute, entsprechend 1.562 ×g, für zwei Minuten.Entfernen Sie das Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 Milliliter RNA-freiem Wasser. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, um das Kulturmedium und eventuell nach der letzten Zentrifugation vorhandene RNasen vollständig zu entfernen.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Lösung Eins. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten, verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 250 Mikroliter Lösung Eins zu den Zellen. Diese Zellmenge reicht für sieben bis acht Transformationen aus.Geben Sie jeweils 50 Mikroliter der Zellsuspension in sieben RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend in drei Röhrchen 20 Mikroliter der 50 Mikromolar-RNA-haltigen Oligos hinzu. In drei weitere Röhrchen geben Sie 20 Mikroliter des 50 Mikromolar-DNA-Oligos allein und in ein Röhrchen 20 Mikroliter sterilem Wasser ohne Oligo als negative Kontrolle.Fügen Sie dann 300 µL der Lösung zwei für jede der sieben Transformationsreaktionen hinzu. Vortexen Sie die Proben kräftig, um die Komponenten zu vermischen. Inkubieren Sie die Transformationsreaktionen nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 30 °C in einem Schüttler.Erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang auf 42 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang mit 5.000 Umdrehungen pro Minute, was 2.236 × g entspricht. Entfernen Sie das SUP-Agens und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter sterilem Wasser für jeweils drei Reaktionsgefäße.Entnehmen Sie eine Aliquot aus dieser Zellsuspension und verdünnen Sie jedes Aliquot mit steriler Wasser um den Faktor 100.000. Geben Sie etwa 15 sterile Glasperlen pro Platte hinzu und pipettieren Sie 100 Mikroliter der 100.000-fach verdünnten Zellen auf drei YPD-Platten. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der resuspendierten Zellen aus jeder Transformationsreaktion auf eine Petrischale mit synthetischem vollständigem festem Medium ohne Tryptophan und schütteln Sie die Platten gleichmäßig.Entfernen Sie dann die Kügelchen. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius auf YPD-Platten und die auf synthetischem vollständigem festen Medium ohne Tryptophan ausgestrichenen Zellen vier bis fünf Tage bei 30 Grad Celsius. Zählen und vergleichen Sie die Anzahl der Kolonien, die auf dem selektiven Medium sowie auf YPD-Medium gewachsen sind, um die Genkorrekturfrequenz für das RNA-haltige Oligo, das DNA-Oligo und die Kontrolle ohne Oligo zu berechnen.Es wird erwartet, dass keine Koloniebildung auf dem selektiven Medium erfolgt, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzugefügt werden. Streichen Sie mehrere zufällig ausgewählte transformierte Kolonien auf YPD-Medium, um Einzelkolonie-Isolate zu erhalten. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage bei 30 Grad Celsius, damit die Kolonien wachsen können. Nach der Inkubation wählen Sie mehrere Einzelkolonien aus und übertragen sie als Flecken auf YPD sowie auf das selektive Medium. Synthetisches vollständiges festes Medium ohne Tryptophan: Nach einer Tag Inkubation wird Wachstum bei den mit den Oligos transformierten Zellen beobachtet, nicht jedoch bei der Kontrollstamm ohne Oligo auf dem selektiven synthetischen vollständigen festen Medium ohne Tryptophan. Als Nächstes entwerfen Sie ein Paar Primer, um den durch das RNA-haltige Oligo gezielten Bereich mittels Kolonie-PCR zu amplifizieren, um die Kolonie-PCR zu starten. Resuspendieren Sie die Zellen, die von den einzelnen Kolonien entnommen wurden, in 50 Mikrolitern Wasser, das eine Einheit Lyase enthält; inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von einer Inkubation in einem Wärmeblock bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen aufzubrechen und die genomische DNA in Lösung freizusetzen.Bereiten Sie die PCR-Ansätze in PCR-Röhrchen vor, indem Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem angesetzten Röhrchen hinzufügen, und führen Sie die Amplifikationsreaktion gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Führen Sie die resultierenden Proben auf einem 1 %igen Agarosegel laufen, um das PCR-Produkt sichtbar zu machen. Da die genetische Information, die durch das RNA-haltige Oligo in diesem Experiment übertragen wird, eine neue VAN 91 1-Restriktionsstelle in der genomischen Zielregion der Hefe erzeugt, ist es möglich, die korrekte Informationsübertragung zu überprüfen, indem das PCR-Produkt mit dem Restriktionsenzym van 91 1 digeriert wird.Richten Sie die Verdauungsreaktion so ein, dass sie sechs Mikroliter PCR-Produkt, Puffer, BSA, 0,5 Mikroliter des Restriktionsenzyms und sterilem Wasser auf 15 Mikroliter enthält. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie eine undigestierte Probe gemeinsam mit den digestierten Proben in derselben Reihe eines 2%-Agarosegels durch, um die durch den RNA-Abschnitt des RNA-haltigen Oligos übertragene genetische Modifikation zu beobachten.Reinigen Sie die PCR-Produkte mithilfe eines PCR-Reinigungskits und bereiten Sie sie zur DNA-Sequenzierung vor. Reichen Sie die Proben zur Sequenzierung mit denselben Primern ein, die zur Amplifikation des Produkts verwendet wurden. Analysieren Sie abschließend die DNA-Sequenzierungsresultate mit einer Software, die die Alignierung mehrerer Sequenzen mit einer gewählten Referenzsequenz ermöglicht, um eine Alkali-Behandlung des RNA-haltigen Oligos für jede Reaktion bei einem Mol des RNA-haltigen Oligos oder des reinen DNA-Oligos in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen durchzuführen.Fügen Sie dann vier Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung zur Hydrolyse oder vier Mikroliter Wasser als Negativkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius in einem Wasserbad, anschließend überführen Sie die Reaktion auf Eis.Puffern Sie die Hydrolyse-Reaktion mit zwei Mikrolitern 1,2 molarer Salzsäure, vier Mikrolitern einer einmolaren Tris-Hydrochlorid-Lösung und vier Mikrolitern Wasser für die negative Kontrolle. Geben Sie sechs Mikroliter Wasser und vier Mikroliter einer einmolaren Tris-Hydrochlorid-Lösung hinzu. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis die Transformation durchgeführt werden kann.Wie gerade beschrieben, bilden Hefe-Zellen, die ohne Oligo transformiert wurden, keine Kolonien auf dem synthetischen vollständigen Festmedium ohne Tryptophan fan. Umgekehrt bilden Zellen, die nach der Transformation mit einem Oligo, das RNA enthält, auf synthetischem vollständigem Festmedium ohne Tryptophan kultiviert wurden, nun Kolonien.Hefe-Kolonien wachsen ebenfalls auf synthetischem vollständigem Festmedium ohne Tryptophan, nachdem die Zellen mit einem Nanomol des entsprechenden DNA-Oligos nur als Kontrolle transformiert wurden. Der Nachweis des genetischen Informationsaustauschs von dem RNA-haltigen Oligo auf die chromosomale DNA der Hefe ergibt sich aus der VAN 91 1-Restriktionsverdauung des PCR-Produkts, das den gezielten genomischen Bereich amplifiziert, wie gezeigt. Das PCR-Produkt des trip. Five-Lokus, amplifiziert aus der genomischen DNA des trip. Five-Mutantenstamms, ist sichtbar.Auch dargestellt ist das PCR-Produkt, das aus genomischer DNA amplifiziert wurde, die aus einer Trip-plus-Kolonie stammt, die mit dem DNA-Only-Oligo gezielt wurde. Die mittels PCR aus genomischer DNA amplifizierten Produkte, die aus Trip-plus-Kolonien stammten, die mit dem RNA-enthaltenden Oligo gezielt wurden, wurden ebenfalls im Gel aufgetrennt. Die Ergebnisse der Restriktionsverdauung mit Van 91 1 derselben PCR-Produkte zeigen ein amplifiziertes PCR-Band von 278 Basenpaaren sowie die Verdauungsprodukt-Banden von 177 Basenpaaren und 101 Basenpaaren durch Van 91 1.Die DNA-Sequenzierung zeigt hier die Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo. Ein DNA-Elektropherogramm des genomischen Bereichs, der durch das RNA-haltige Oligo gezielt wird, ist dargestellt. Das g in der DNA-Sequenz stammt von dem RG auf dem RNA-haltigen Oligo go.Ebenfalls in einer Box dargestellt ist die Insertion der CG-Basensequenzen des Trip-Fünf-Bereichs der Trip-Plus-Transformanten, die durch das nur-DNA-Oligo und das RNA-enthaltende Oligo gezielt wurden und mit der des Trip verglichen werden. Die Reparatur-RNA, die das Oligo unten enthält, weist eine zweibasige DNA-Insertion und eine einbasige RNA-Substitution auf.Der mit blauer Farbe und gelber Schattierung markierte Bereich zeigt, dass sowohl das RNA-haltige Oligo als auch das reine DNA-Oligo die Deletionsmutation und die Nonsensemutation in allen getesteten Proben präzise korrigiert haben; die gestrichelten Linien kennzeichnen die Position der Sequenz des RNA-haltigen Oligos. Eine alkalische Behandlung verhindert die Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo; die Transformationsfrequenz durch das RNA-haltige Oligo und das reine DNA-Oligo ist dargestellt. Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwerts aus drei unabhängigen Transformationen für jedes Oligo.Das DNA-enthaltende Oligo zeigt eine ähnliche Transformationsfrequenz mit und ohne Natriumhydroxid-Behandlung. Umgekehrt sinkt die Transformationsfrequenz durch das RNA-enthaltende Oligo nach Behandlung mit Natriumhydroxid auf null. Daher ist die Probe mit dem RNA-enthaltenden Oligo nicht mit DNA-enthaltendem Oligo kontaminiert.Daher ist die beobachtete Transformationsfrequenz spezifisch für das RNA-haltige Oligo. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man ein R-N-A-D-N-A-Hybrid auf chromosomaler Ebene bildet und den umgekehrten Transfer genetischer Informationen von RNA in die genomische DNA in Hefezellen nachweist. Bei dieser Methode ist es wichtig, hochwertige RNA-haltige Oligos zu verwenden und unter RNA-freien Bedingungen zu arbeiten.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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