Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, auf chromosomaler Ebene in lebenden Hefezellen R-N-A-D-N-A-Hybride zu erzeugen, indem die Hefezellen mit RNA-haltigen Oligos transformiert werden. Dies wird erreicht, indem ein einzelsträngiges, RNA-haltiges Oligo in teilende Hefezellen eingeführt wird. In einem zweiten Schritt lagern sich die mittels des RNA-haltigen Oligos transformierten Zellen auf selektivem Medium aus.

Dies ermöglicht das Wachstum von Zellen, in denen der RNA-Abschnitt des Oligos als Vorlage für die Korrektur des mutierten Markergens dient. Anschließend werden Hefe-Kolonien, die auf dem selektiven Medium wachsen, ausgewertet, um die Häufigkeit der Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den Transfer genetischer Information von der RNA-Sequenz des Oligos auf das mutierte Markergen im Hefe-Genom. Dies ergibt sich aus der Restriktionsverdauungsanalyse, der Sequenzanalyse und dem Alkalilabilitäts-Assay.

Hallo, ich bin HIN-Gründerin, dem Labor von Dr. Francesca an der Fakultät für Biologie am Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung von R-N-A-D-N-A-Hybriden auf chromosomaler Ebene in lebenden Hefezellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie die Anwesenheit von in genomische DNA eingebetteter RNA von Zellen toleriert wird, und um festzustellen, welche Faktoren die Stabilität von R-N-A-D-N-A-Hybriden in vivo beeinflussen.

Beginnen wir nun. Vor Beginn dieses Verfahrens alle Materialien, die für das Experiment verwendet werden, einschließlich Oligo-Röhrchen, Pipetten, Vortex-Racks, Versuchsbereich und Handschuhe des Untersuchers, mit RNasen-Deskontaminationslösung abwischen. Um jegliche mögliche RNasen-Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie im gesamten Verfahren RNasen-freies Wasser, chemische Reagenzien, Röhrchen und Pipettenspitzen.

Verwenden Sie ein RNA-haltiges Oligonukleotid, um genetische Information in die genomische DNA von Hefezellen einzubringen. Der hier verwendete Hefestamm enthält ein mutiertes Trip5-Gen mit einer Deletion von zwei Basen und einer Nonsense-Mutation. Ein solcher Hefestamm ist ein Tryptophan-auxotropher Mutant und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan.

Das RNA-haltige Oligo ist ein 65 MER mit einer zweibasigen DNA-Einlagerung, die zur Korrektur der Deletionsmutation konzipiert ist. Zusätzlich enthält das Oligo ein Ribonukleotid zur Korrektur der Nonsense-Mutation des trip five-Allels. Sobald es vorliegt, bereiten Sie das RNA-haltige Oligo gemäß der schriftlichen Anleitung zu einer 250 µM Stammlösung vor. 16 Stunden vor der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo impfen Sie an.

Fünf Milliliter reichhaltiges flüssiges Hefe-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium mit den trip fünf Mutanten-Hefezellen versetzen und die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius kultivieren. Nach der Übernachtkultivierung 1,5 Milliliter der Übernachtkultur in 50 Milliliter flüssiges YPD-Medium überführen. Die Zellen vier Stunden vor der Transformation vier Stunden lang in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute inkubieren.

Die RNA-haltigen Oligos und die entsprechenden DNA-Only-Oligos auf Eis geben. Die entsprechenden DNA-Only-Oligos dienen als positiver Kontrollansatz. Verdünnen Sie die Oligos mit RNA-freiem Wasser in RNA-freien Röhrchen auf 50 Mikromolar.

Bereiten Sie 70 Mikroliter jedes Oligos vor, um genügend Probe für drei Transformationen von einem Mol mit etwas überschüssiger Denaturierung zu haben; erhitzen Sie die RNA-haltigen und die reinen DNA-Oligos auf dem 100 °C-Heizblock für zwei Minuten, um sekundäre Strukturen der Oligos unmittelbar nach der Denaturierung zu beseitigen. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und belassen Sie sie dort, bis die Transformation erfolgt. Bereiten Sie Lösung eins und Lösung zwei unmittelbar vor der Transformation in RNA-freien Röhrchen vor. Überführen Sie die Zellkultur in ein 50-Milliliter-RNA-freies Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 3000 Umdrehungen pro Minute, entsprechend 1.562 ×g, für zwei Minuten.

Entfernen Sie das Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 Milliliter RNA-freiem Wasser. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, um das Kulturmedium und eventuell nach der letzten Zentrifugation vorhandene RNasen vollständig zu entfernen.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Lösung Eins. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3000 Umdrehungen pro Minute für zwei Minuten, verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 250 Mikroliter Lösung Eins zu den Zellen. Diese Zellmenge reicht für sieben bis acht Transformationen aus.

Geben Sie jeweils 50 Mikroliter der Zellsuspension in sieben RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend in drei Röhrchen 20 Mikroliter der 50 Mikromolar-RNA-haltigen Oligos hinzu. In drei weitere Röhrchen geben Sie 20 Mikroliter des 50 Mikromolar-DNA-Oligos allein und in ein Röhrchen 20 Mikroliter sterilem Wasser ohne Oligo als negative Kontrolle.

Fügen Sie dann 300 µL der Lösung zwei für jede der sieben Transformationsreaktionen hinzu. Vortexen Sie die Proben kräftig, um die Komponenten zu vermischen. Inkubieren Sie die Transformationsreaktionen nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 30 °C in einem Schüttler.

Erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang auf 42 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang mit 5.000 Umdrehungen pro Minute, was 2.236 × g entspricht. Entfernen Sie das SUP-Agens und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter sterilem Wasser für jeweils drei Reaktionsgefäße.

Entnehmen Sie eine Aliquot aus dieser Zellsuspension und verdünnen Sie jedes Aliquot mit steriler Wasser um den Faktor 100.000. Geben Sie etwa 15 sterile Glasperlen pro Platte hinzu und pipettieren Sie 100 Mikroliter der 100.000-fach verdünnten Zellen auf drei YPD-Platten. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der resuspendierten Zellen aus jeder Transformationsreaktion auf eine Petrischale mit synthetischem vollständigem festem Medium ohne Tryptophan und schütteln Sie die Platten gleichmäßig.

Entfernen Sie dann die Kügelchen. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius auf YPD-Platten und die auf synthetischem vollständigem festen Medium ohne Tryptophan ausgestrichenen Zellen vier bis fünf Tage bei 30 Grad Celsius. Zählen und vergleichen Sie die Anzahl der Kolonien, die auf dem selektiven Medium sowie auf YPD-Medium gewachsen sind, um die Genkorrekturfrequenz für das RNA-haltige Oligo, das DNA-Oligo und die Kontrolle ohne Oligo zu berechnen.

Es wird erwartet, dass keine Koloniebildung auf dem selektiven Medium erfolgt, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzugefügt werden. Streichen Sie mehrere zufällig ausgewählte transformierte Kolonien auf YPD-Medium, um Einzelkolonie-Isolate zu erhalten. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage bei 30 Grad Celsius, damit die Kolonien wachsen können. Nach der Inkubation wählen Sie mehrere Einzelkolonien aus und übertragen sie als Flecken auf YPD sowie auf das selektive Medium.

Synthetisches vollständiges festes Medium ohne Tryptophan: Nach einer Tag Inkubation wird Wachstum bei den mit den Oligos transformierten Zellen beobachtet, nicht jedoch bei der Kontrollstamm ohne Oligo auf dem selektiven synthetischen vollständigen festen Medium ohne Tryptophan. Als Nächstes entwerfen Sie ein Paar Primer, um den durch das RNA-haltige Oligo gezielten Bereich mittels Kolonie-PCR zu amplifizieren, um die Kolonie-PCR zu starten. Resuspendieren Sie die Zellen, die von den einzelnen Kolonien entnommen wurden, in 50 Mikrolitern Wasser, das eine Einheit Lyase enthält; inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von einer Inkubation in einem Wärmeblock bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen aufzubrechen und die genomische DNA in Lösung freizusetzen.

Bereiten Sie die PCR-Ansätze in PCR-Röhrchen vor, indem Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem angesetzten Röhrchen hinzufügen, und führen Sie die Amplifikationsreaktion gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Führen Sie die resultierenden Proben auf einem 1 %igen Agarosegel laufen, um das PCR-Produkt sichtbar zu machen. Da die genetische Information, die durch das RNA-haltige Oligo in diesem Experiment übertragen wird, eine neue VAN 91 1-Restriktionsstelle in der genomischen Zielregion der Hefe erzeugt, ist es möglich, die korrekte Informationsübertragung zu überprüfen, indem das PCR-Produkt mit dem Restriktionsenzym van 91 1 digeriert wird.

Richten Sie die Verdauungsreaktion so ein, dass sie sechs Mikroliter PCR-Produkt, Puffer, BSA, 0,5 Mikroliter des Restriktionsenzyms und sterilem Wasser auf 15 Mikroliter enthält. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie eine undigestierte Probe gemeinsam mit den digestierten Proben in derselben Reihe eines 2%-Agarosegels durch, um die durch den RNA-Abschnitt des RNA-haltigen Oligos übertragene genetische Modifikation zu beobachten.

Reinigen Sie die PCR-Produkte mithilfe eines PCR-Reinigungskits und bereiten Sie sie zur DNA-Sequenzierung vor. Reichen Sie die Proben zur Sequenzierung mit denselben Primern ein, die zur Amplifikation des Produkts verwendet wurden. Analysieren Sie abschließend die DNA-Sequenzierungsresultate mit einer Software, die die Alignierung mehrerer Sequenzen mit einer gewählten Referenzsequenz ermöglicht, um eine Alkali-Behandlung des RNA-haltigen Oligos für jede Reaktion bei einem Mol des RNA-haltigen Oligos oder des reinen DNA-Oligos in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen durchzuführen.

Fügen Sie dann vier Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung zur Hydrolyse oder vier Mikroliter Wasser als Negativkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius in einem Wasserbad, anschließend überführen Sie die Reaktion auf Eis.

Puffern Sie die Hydrolyse-Reaktion mit zwei Mikrolitern 1,2 molarer Salzsäure, vier Mikrolitern einer einmolaren Tris-Hydrochlorid-Lösung und vier Mikrolitern Wasser für die negative Kontrolle. Geben Sie sechs Mikroliter Wasser und vier Mikroliter einer einmolaren Tris-Hydrochlorid-Lösung hinzu. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis die Transformation durchgeführt werden kann.

Wie gerade beschrieben, bilden Hefe-Zellen, die ohne Oligo transformiert wurden, keine Kolonien auf dem synthetischen vollständigen Festmedium ohne Tryptophan fan. Umgekehrt bilden Zellen, die nach der Transformation mit einem Oligo, das RNA enthält, auf synthetischem vollständigem Festmedium ohne Tryptophan kultiviert wurden, nun Kolonien.

Hefe-Kolonien wachsen ebenfalls auf synthetischem vollständigem Festmedium ohne Tryptophan, nachdem die Zellen mit einem Nanomol des entsprechenden DNA-Oligos nur als Kontrolle transformiert wurden. Der Nachweis des genetischen Informationsaustauschs von dem RNA-haltigen Oligo auf die chromosomale DNA der Hefe ergibt sich aus der VAN 91 1-Restriktionsverdauung des PCR-Produkts, das den gezielten genomischen Bereich amplifiziert, wie gezeigt. Das PCR-Produkt des trip. Five-Lokus, amplifiziert aus der genomischen DNA des trip. Five-Mutantenstamms, ist sichtbar.

Auch dargestellt ist das PCR-Produkt, das aus genomischer DNA amplifiziert wurde, die aus einer Trip-plus-Kolonie stammt, die mit dem DNA-Only-Oligo gezielt wurde. Die mittels PCR aus genomischer DNA amplifizierten Produkte, die aus Trip-plus-Kolonien stammten, die mit dem RNA-enthaltenden Oligo gezielt wurden, wurden ebenfalls im Gel aufgetrennt. Die Ergebnisse der Restriktionsverdauung mit Van 91 1 derselben PCR-Produkte zeigen ein amplifiziertes PCR-Band von 278 Basenpaaren sowie die Verdauungsprodukt-Banden von 177 Basenpaaren und 101 Basenpaaren durch Van 91 1.

Die DNA-Sequenzierung zeigt hier die Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo. Ein DNA-Elektropherogramm des genomischen Bereichs, der durch das RNA-haltige Oligo gezielt wird, ist dargestellt. Das g in der DNA-Sequenz stammt von dem RG auf dem RNA-haltigen Oligo go.

Ebenfalls in einer Box dargestellt ist die Insertion der CG-Basensequenzen des Trip-Fünf-Bereichs der Trip-Plus-Transformanten, die durch das nur-DNA-Oligo und das RNA-enthaltende Oligo gezielt wurden und mit der des Trip verglichen werden. Die Reparatur-RNA, die das Oligo unten enthält, weist eine zweibasige DNA-Insertion und eine einbasige RNA-Substitution auf.

Der mit blauer Farbe und gelber Schattierung markierte Bereich zeigt, dass sowohl das RNA-haltige Oligo als auch das reine DNA-Oligo die Deletionsmutation und die Nonsensemutation in allen getesteten Proben präzise korrigiert haben; die gestrichelten Linien kennzeichnen die Position der Sequenz des RNA-haltigen Oligos. Eine alkalische Behandlung verhindert die Genkorrektur durch das RNA-haltige Oligo; die Transformationsfrequenz durch das RNA-haltige Oligo und das reine DNA-Oligo ist dargestellt. Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwerts aus drei unabhängigen Transformationen für jedes Oligo.

Das DNA-enthaltende Oligo zeigt eine ähnliche Transformationsfrequenz mit und ohne Natriumhydroxid-Behandlung. Umgekehrt sinkt die Transformationsfrequenz durch das RNA-enthaltende Oligo nach Behandlung mit Natriumhydroxid auf null. Daher ist die Probe mit dem RNA-enthaltenden Oligo nicht mit DNA-enthaltendem Oligo kontaminiert.

Daher ist die beobachtete Transformationsfrequenz spezifisch für das RNA-haltige Oligo. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man ein R-N-A-D-N-A-Hybrid auf chromosomaler Ebene bildet und den umgekehrten Transfer genetischer Informationen von RNA in die genomische DNA in Hefezellen nachweist. Bei dieser Methode ist es wichtig, hochwertige RNA-haltige Oligos zu verwenden und unter RNA-freien Bedingungen zu arbeiten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.