Name: Intrakranielle orthotopen allogene von Medulloblastom Cells bei immungeschwächten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Lernen Sie die orthotope Allotransplantation von Medulloblastomzellen in immungeschwächte Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorwachstum und neurologischen Symptomen für die Krebsforschung.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), der Hirntumor bei Kindern Foundation und den National Institutes of Health (NS042205) unterstützt.

1. Micro-Dissektion der tumortragenden Kleinhirn und Dissoziation von Tumorgewebe <ol><li> Retrieval von Tumorgewebe <ol><li> Kranke Mäuse mit Medulloblastom oft runted und Display Hydrocephalus und typische neurologische Symptome, einschließlich posterior Lähmung und Unfähigkeit zur Haltung wieder, wenn umgeworfen. Zum Abrufen von Tumorgewebe, euthanize Mäusen durch Kohlendioxid Einatmen. Es ist imporant nicht Genickbruch, eine Prozedur, die Druck erzeugt, um den hinteren Schädel und kann Tumorgewebe Integrität Kompromiss führen. </li><li> Enthauptung ist unmittelbar nach dem Tod mit einer Schere durchgeführt, das Entfernen von Haaren und Muskelgewebe so viel wie möglich für eine gute Visualisierung des Schädels. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kimwipe mit 95% Ethanol getränkt. </li><li> Verwenden einer feinen Schere, um eine Öffnung entlang der Mittellinie des Schädels geschnitten, und entfernen Schädel Gewebe mit feinen Pinzette, an welcher Stelle das ganze Gehirn einschließlich tumortragenden Kleinhirn ausgesetzt ist. </li><li> Während die cerebella von gesunden Erwachsenen gut definierten Hemisphären und Vermis-Display, sind die cerebella von Tumor-tragenden Mäusen oft vergrößert, amorph mit einer glatten Oberfläche und auffällige Blutgefäße. Mit sterilen Techniken, rufen Sie die Kleinhirntumor mit einer Pinzette und in eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Mg 2 + und Ca 2 +. </li></ol> Hinweis: Alle Instrumente sind in 95% Ethanol und Dampf vor dem Gebrauch autoklaviert desinfiziert. </li><li> Die Dissoziation von Tumorgewebe <ol><li> Übertragen Sie die Tumorgewebe von PBS zu 50% Accutase (verdünnt in PBS), die etwa 4-mal das Volumen des Tumorgewebes ist, Hackfleisch das Gewebe mit einer feinen Schere für 3 Minuten bei Raumtemperatur, durch Inkubation bei 37 ° C für 4 Minuten , nach denen das Gewebe erfährt repetitive Pipettieren mit einer 1-mL Pipetman für weitere 3 Minuten. Diese Methode sollte Ausbeute eine Mischung aus Einzelzellen und kleine zelluläre Aggregate. </li><li> Verdünnen Sie die Zellsuspension 3-fach mit PBS und zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1000xg die Zellen zu pelletieren. (Die oben beschriebenen Verfahren haben in &quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot; beschrieben worden, JoVE in press) </li> Zellpellet in frisch zubereiteten neuralen Stammzellen Medium, bestehend aus Neurobasal Medium mit Glutamin, Penicillin-Streptomycin, N2, B27, menschlichen EGF (25 ng / mL) und basic FGF (25 ng / mL). Berechnen Sie die Zelldichte der Lösung und entsprechende weitere Verdünnungen mit zusätzlichen neuralen Stammzellen Medium, so dass man 4 ul-Lösung mit einer entsprechenden Anzahl von dissoziierten Tumorzellen, zB 5x10 5 Last, in einen sterilen Kegel-Spitze 10 &amp;mgr; l Spritze. Die genaue Zahl der Zellen geimpft werden sollten durch den Forscher nach bestimmten experimentellen Anforderungen bestimmt werden. Halten Sie die Zell-Lösung in einem Mini 200 ul Mikrozentrifugenröhrchen (PCR-Röhrchen) auf Eis. </ol></li></ol> 2. Narkoseverfahren für die Empfängermäuse Für den chirurgischen Eingriff, ist eine Desinfektion Bereich für Nager Operation für die Dauer des Verfahrens benötigt werden. Im Idealfall richten Sie eine lange Bank mit getrennten, aber benachbarten Gebieten für tierische Vorbereitung, OP-Feld und Tier Erholung. OP-Handschuhe, nicht Untersuchungshandschuhe sind für die Operation erforderlich. Aseptische Technik ist, indem behandschuhten Hände oberhalb der Taille gehalten und nur verwendet, um sterile Objekte aus einem trockenen und sterilen Oberfläche zu behandeln. <ol><li> Eine Mischung aus Ketamin (100 mg Ketamin pro 1 kg Maus Gewicht) und Xylazin (10 mg Xylazin pro 1 kg Maus Gewicht) ist für die Anästhesie verwendet. Verwalten Sie die Anästhetika intraperitoneal. </li><li> Es dauert in der Regel 3-5 Minuten für die Anästhesie ihre volle Wirkung zu nehmen. Bestimmen Sie, ob eine Maus vollständig betäubt von toe / Schwanz kneifen wird. Legen Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen der Maus. Bringen Sie die vollständig narkotisierten Maus zum OP-Feld, die ständige Überwachung, um sicherzustellen, dass die Maus ist in der Regel zu atmen. </li></ol> 3. Intrakranielle Pfropfung der Tumorzellen <ol><li> Shave der dorsalen hinteren Kopfbereich der Maus, mit einer Haarschneidemaschine, mit der hinteren Schädel über das Mittelhirn und Kleinhirn zu enthüllen. </li><li> Bewerben Betadine Lösung auf dem exponierten Kopfhaut mit einem Wattestäbchen, durch Abwischen mit einem Alkohol-Pad gefolgt. Wiederholen Sie diese beiden Sterilisationsschritte zweimal. </li><li> Machen Sie einen Viertel-Zoll-Schnitt in der hinteren Kopfhaut mit einem sterilisierten Skalpell. Bohren Sie ein 0,5 mm Bohrloch 2 mm nach rechts und 2 mm hinter der Lambda mit einer sterilen Dentalbohrers. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einen stereotaktischen Rahmen durch Einhaken seine Schneidezähne auf den Rahmen zu halten. Vorsichtig steigen und die Position der Kegel-Spitze 10 l-Spritze mit 4 ul Tumorzellen Lösung in das Bohrloch geladen. Sobald die Abschrägung der Nadel der Spritze unterhalb des Schädels Oberfläche, descend für weitere 3 mm und steigen dann für 0,5 mm. Langsam injizieren die gewünschte Menge von Tumorzellen, mit einem stetigen Kraft in einem 30 Sekunden Zeitfenster, in dem Kleinhirn des Empfängers. Lassen Sie die Nadel an ihrer Stelle nach Abschluss der Injektion für weitere zwei Minuten. Dann entfernen Sie die Nadel und Spritze. Clip die Wunde mit einem autoclip. </li><li> Halten Sie die Maus auf eine wärmende Decke nach der Operation zur Aufrechterhaltung ihrer Körpertemperatur. Mobilität und Atemmuster wird kontinuierlich beobachtet werden. Sobald Sie die Maustaste wieder aus der Narkose, setzen Sie ihn wieder in eine sterile Gehäusekäfig. Monitor täglich für Futter-und Wasseraufnahme, Verhalten, Pflege, und Rot-Färbung der Augen. Überprüfen Sie auf Anzeichen einer Infektion an der Inzisionsstelle. Entfernen Sie die autoclips am Tag 7 nach der Operation. Pflegen Sie die Maus für einen Durchschnitt von 2-6 Monaten und Opfer die Anzeige typischer Medulloblastom Symptome für weitere Studien. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Sekundäre Medulloblastome in Empfängermäuse entwickelt hoch ähnelten denen der primären Tumore. Die cerebella tragenden sekundären Tumoren waren oft vergrößert, amorph mit ektopischen Blutgefäße sichtbar, wenn sie als Ganzes-Halterungen angesehen. Immunhistochemische Analysen der sekundären Tumorgewebe ergab, dass die Tumorzellen stark proliferative sind, äußern starke SmoM2-YFP und Marker der Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen wie Math1 und Pax6. Wenn dissoziiert und kultiviert mit berichtete Methoden (&quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot;, JoVE in press), die sekundäre Medulloblastom Tumorzellen rasch erweitert werden kann, zum Ausdruck mehrere Stammzell-Marker sind klonogenen und kann weiter zu initiieren Tumorbildung bei transplantierten in zusätzliche immunsupprimierten Empfängern. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Typische ganzen-mount und Schnitte eines sekundären Medulloblastom Gewebe Ein typisches Beispiel für sekundäre Medulloblastom Gewebe entwickelt 26 Tage nach der Injektion von 5x10 5 primären Tumorzellen. Hämatoxylin Färbung zeigt den typischen zellulären Morphologie Medulloblastom, darunter hohe nukleare / Plasma-Relation und Kernpolymorphie. Diese sekundären Tumorzellen sind hoch proliferative wie Ki67 Ausdruck angegeben und sie auch kräftig ausdrücken membranöse SmoM2-YFP. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Sekundäre Medulloblastom-Zellen können kultiviert und erweitert werden in vitro Mit dem Protokoll für die primäre Maustaste Medulloblastom-Zellen (&quot;Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stammzellen&quot;, JoVE in press) beschrieben, können diese sekundären Medulloblastom-Zellen kultiviert und erweitert werden für mehrere Passagen. Das Bild zeigt den gleichen repräsentativen Tumorkoloniebildung bei 4 Tage und 14 Tage kultiviert. Die kultivierten Tumorzellen sind bipolar, mit wenig Zytoplasma und oft strahlen aus einem dichten Kern der zellulären insgesamt verlängert. Sie zeigen nicht das Wachstum Kontakt Hemmung. Die kleinen runden Zellen sind rote Blutkörperchen.

<ol><li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li>
<li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li>
<li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li>
<li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li>
</ol>

Mehrere kritische Faktoren für eine erfolgreiche Medulloblastom Zelle Allotransplantaten, dass die Erträge sekundäre Tumorbildung sind wie folgt zu gewährleisten: Erstens, verwenden Sie nur 50% Accutase für Gewebedissoziation und nicht über-digest das Gewebe als verlängerte Enzymbehandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen. Nutzen Sie auch nur die 1 mL Größe Pipetman als kleinere Tipps auch erzeugen kann körperliche Schäden an der dissoziierten Zellen. Es ist schön, eine Mischung aus ...

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1×</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1×</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50 %</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument</td><td>Stoelting Co.</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Foredom-Flexibor, Hängeausführung</td><td>Stoelting Co.</td><td>58650</td><td></td></tr><tr><td>Großer Probenhalter</td><td>Stoelting Co.</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L-Spritze, 26 Ga., Schräganschnitt</td><td>Stoelting Co.</td><td>51105</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer .75 mm</td><td>Stoelting Co.</td><td>51455-3</td><td></td></tr></tbody></table>

intrakranielle orthotopen allogene von medulloblastom cells bei immungeschwächten mäusen

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Medulloblastom ist der häufigste pädiatrische Tumor des Nervensystems. Eine große Anzahl von Tierversuchen hat am Kleinhirn Granulat Neuron Vorstufen (CGNPs) als Zell-of-Origin für Medulloblastom 1-4 ausgerichtet. Allerdings deuten die vielfältigen klinischen Präsentationen Medulloblastom Subtypen bei menschlichen Patienten (knotige, desmoplastischen, klassische und große Zelle / anaplastischen), und die Tatsache, dass Medulloblastom in einer Untergruppe von menschlichen Patienten, die keine ektopische Expression von CGNP Marker 5 ist gefunden, dass die zellulären und molekularen Ursachen der Medulloblastom sind komplexer und weit davon entfernt, vollständig entschlüsselt. Daher ist es wichtig, festzustellen, ob es eine Alternative gibt Medulloblastom Tumorzelle-of-Origin auf dem Zelltyp-spezifische therapeutische Modalität entwickelt werden können basiert. Zu diesem Zweck wird intrakraniellen orthotopen Allotransplantaten von genetisch markierten Tumorzellen Arten durch nachträgliche Analysen der sekundären Entwicklung von Tumoren in Empfängern gefolgt ermöglichen die Bestimmung der zellulären Herkunft der Tumor-initiierende Zellen. Hier beschreiben wir die experimentelle Protokoll für intrakranielle orthotopen Allotransplantaten von Medulloblastom Zellen aus primären Tumorgewebe, und dieses Verfahren kann auch zur Transplantation von Zellen aus etablierten Zelllinien verwendet werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Spaltung von Maus Medulloblastom Gewebe und anschließende allogene der Tumorzellen in immunsupprimierten Empfängermäuse um sekundäre Medulloblastom einzuleiten.

Intrakranielle orthotopen allogene von Medulloblastom Cells bei immungeschwächten Mäusen

Das Medulloblastom ist der häufigste Tumor des Nervensystems im Kindesalter. Eine Vielzahl von Tierstudien hat sich auf die körnigen Neuronen des Kleinhirns konzentriert ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, allogene Medulloblastomtumorzellen in einen immungeschwächten Wirt einzubringen, um ein sekundäres Tumorwachstum auszulösen. Dies wird erreicht, indem primäres Medulloblastomgewebe zunächst in Einzelzellen und kleine zelluläre Aggregate zerlegt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, immungeschwächte Mäuse auf eine intrakranielle Injektion vorzubereiten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht in der Mikroinjektion von Tumorzellen in das Kleinhirn des Wirts. Die abschließenden Schritte des Verfahrens umfassen die Pflege und Beobachtung der Wirtstiere mit transplantierten Tumorzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels der sichtbaren neurologischen Symptome und der histologischen Analyse die Bildung eines sekundären Medulloblastoms bei den Wirtstieren belegen.Mit dieser Technik können zentrale Fragen der Krebsbiologie beantwortet werden, beispielsweise die Bestimmung des zellulären Ursprungs eines Tumors sowie wichtige Faktoren für die Initiation und Ausbreitung von Tumoren. Mikrodissektieren und dissociieren Sie das Tumorgewebe aus einem medulloblastom, wie in dem begleitenden Videoartik

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Neurowissenschaften

Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Dieses Video zeigt die Implantation von Tumorzellen in das Gehirn von Mäusen durch intrakranielle Injektion.

Intrakranielles orthotopisches Modell: Ein Verfahren zur Implantation von Krebszellen in das Gehirn von Mäusen

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

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Intranasale Abgabe von therapeutischen Stammzellen an Glioblastom in einem Mausmodell

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