Name: Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie die adenovirale Cre-Rekombinase-Lieferung zur effizienten Gen-Exzision in primären embryonalen Maus-Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Rac1-Funktionen in der Aktin-Dynamik.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Rizaldy Scott am Mount Sinai Hospital in Toronto, Ontario danken für das Geschenk des primären Rac1 flox / flox embryonalen Maus-Fibroblasten. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse an NJ von der Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) und dem Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RG 327372-06) unterstützt. SH und MW werden von CGSMA und CGS-M Auszeichnungen von CIHR und NSERC bzw. unterstützt. Steve Hawley und Melanie Wills trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

Auftauen von Zellen <ol><li> Erhalten eingefroren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) (zuvor aus einzelnen Embryos primären Kulturen generiert) von flüssigem Stickstoff. </li><li> Thaw Zellen durch Eintauchen Fläschchen in 37 ° C Wasser mit wirbelnden, bis Inhalt vollständig aufgetaut. </li><li> Add 9 mL DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin zu einer 10cm Zellkulturplatte ergänzt wurde. </li><li> Fügen Sie die aufgetaute Zellsuspension tropfenweise auf die Platte, Rock die Platte vorsichtig, um Zellen und Platzteller in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator über Nacht zu zerstreuen. Beachten Sie, dass, wenn die Zellen empfindlich auf DMSO (aus dem Einfrieren Prozess) sind erste Medien mit frischen Medien ersetzt werden kann, nachdem die Zellen an der Platte (ca. 4 Stunden post plating) haften geblieben sind. Beachten Sie auch, dass Zusammenfluss der Zellen nach dem Auftauen ist abhängig von der Anzahl der Zellen eingefroren, die Erholung der Zellen nach dem Einfrieren und die Wachstumsrate der Zellen. </li></ol> Passagierung Zellen <ol start="5"><li> Wenn die Zellen zu praktisch 100% Konfluenz (dh: am nächsten Tag) gewachsen, absaugen den Medien und waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS. </li><li> Entfernen PBS und 1ml von Trypsin mit 10 mM EDTA und Platzteller in Inkubator für ungefähr 5 Minuten, damit sich Zellen von der Platte zu lösen. </li><li> Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen 9 mL der Medien auf die Trypsin-Zellen, Pipette 2-3 mal um Klumpen zu zerstreuen, 1ml dieser Suspension tropfenweise auf eine neue Platte mit 9 mL der Medien, und legen Sie diese in die 37 ° C Inkubator über Nacht . Die Anwesenheit von FBS in den Medien wird das Trypsin alternativ zu inaktivieren, können Zellen zuerst gewaschen werden, um zu verdünnen die Trypsin. </li></ol> Zählen und Beschichtung von Zellen auf Deckgläser <ol start="8"><li> Entfernen Zellen aus Inkubator, waschen und trypsinize wie vorher, nur dieses Mal add 5-6mL Medien zurück zu den trypsiniert Zellen anstelle von 9 mL. </li><li> Pipette Zellen gründlich, um eine vollständige Dissoziation in einer einzigen Zellsuspension zu gewährleisten, und entfernen Sie 15μL mit 15μL von Trypanblau in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. </li><li> Mix dieser Zelle / Trypanblau Suspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, und fügen Sie 15μL der Zählkammer. </li><li> Unter dem Mikroskop wird abgestorbenen Zellen erscheinen blau. Zählt die Anzahl der klar / farblos (Wohn-) Zellen in einer der 4X4 Gitter auf der Zählkammer. Wiederholen Sie diesen zählen die drei anderen 4X4 Grids (bezeichnet A, B, C und D) und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter Suspension zu berechnen: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"></li><li> Durch Protokoll-Optimierung, haben wir festgestellt, dass plating 30.000 Zellen Ergebnisse in geeigneter Zelldichte für die Visualisierung am Ende des Experiments. </li><li> Zur Berechnung des Volumens der Zellsuspension für 30.000 Zellen benötigt, verwenden Sie die folgende Gleichung: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Gleichung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 2"></li><li> Legen Sie nun ein steriles Deckglas in jedes Well einer sechs gut Schüssel und fügen 2 ml Medium in jede Vertiefung, und dann tropfenweise aus Ihrer Zellsuspension das Volumen für 30.000 Zellen benötigt in jedes Well. Beachten Sie, dass Glasdeckgläschen für dieses Experiment verwendet werden, wie wir die Visualisierung werden die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu einem späteren Zeitpunkt, da nicht alle Anwendungen werden notwendigerweise Mikroskopie und decken somit rutscht nicht erforderlich sein. </li></ol> Virus Transduction <ol start="15"><li> Nach mehreren Stunden oder über Nacht (genügend Zeit, um sicherzustellen, dass die Zellen auf die Deckgläschen haften), zu entfernen Medien und waschen Sie die Zellen mit 1 ml serumfreiem DMEM. </li><li> 1ml von serum-freien Medien in jede Vertiefung für die Zugabe des Virus. Für dieses Experiment wurde Adeno-Cre-Virus kommerziell von Vector Biolabs erhalten. </li><li> Vorherige Protokoll-Optimierung hat gezeigt, dass eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 500 hocheffiziente Gen-Transduktion bietet in primäre MEFs mit wenig oder keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. MOI kann wie folgt berechnet werden: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Gleichung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Gleichung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 4"></li><li> Fügen Sie das berechnete Volumen der Virus direkt in jede Vertiefung, die infiziert ist, schaukeln die Platte, um das Virus und Ort Zellen in die 37 ° C Inkubator über Nacht zu zerstreuen. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie den Virus-haltigen Medien aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in 1ml steriles PBS und fügen Sie dann 2 ml regulären Medien in jede Vertiefung. </li><li> Im Falle der Rac1-Zellen in diesem Experiment veranschaulicht, trat morphologischen Veränderungen in den Zellen bei etwa 72 Stunden nach der Transduktion. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Die Zellen wurden visualisierend durch Färbung mit dem Aktin-Farbstoff Phalloidin (für die Bildgebung dient nur) und abgebildet mit dem Leica TCS SP5-Multiphotonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an der Advanced Analysis Centre an der University of Guelph. Abbildung 1 zeigt die kontrahierte und längliche Morphologie der Rac1 flox / flox Zellen, Adeno-Cre-Virus im Vergleich zu den gleichen Zellen nicht zu Virus ausgesetzt wurden ausgesetzt. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vergleich zwischen Rac1 flox / flox Zellen mit Adeno-Cre-Virus (links) im Vergleich zu nicht infizierten Zellen aus der gleichen Quelle (rechts) infiziert.

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Canadian Council on Animal Care Set durchgeführt.

Das dazugehörige Video zeigt, wie ein rekombinantes Virus verbrauchsteuerpflichtige ein bestimmtes Gen in vitro mit Cre-Rekombinase verwendet werden kann. Die Entwicklung dieses Protokoll jedoch hat offenbaren einige spezielle Punkte wert Adressierung. <ul><li> Proper Sicherheitsvorkehrungen sollten immer dann eingesetzt, wenn mit Adenoviren werden. Ein Laborkittel und Handschuhe sollten immer getragen werden, während der Arbeit mit dem Virus. Medien und Plastmetall sollte mit 10% Bleichmittel für mindestens 30 Minuten behandelt werden, und Plastmetall sollte danach autoklaviert werden. </li><li> Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Virus Lager, da dies Virustiter beeinflussen und reduzieren somit Transduktionseffizienz. Kleine Mengen des Virus Lager sollten zunächst in separaten Röhren aliquotiert werden. </li><li> MOIs reichen von 5 bis 50 wurden während der Methodenentwicklung getestet und effiziente Transduktion Raten wurden in den meisten Fällen beobachtet, ohne negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Adeno-GFP wurde auch während der Methodenentwicklung zur schnellen Bildschirm Transduktion Effizienz. Diese Steuerung (oder einen leeren Vektor) sollte während des Experiments, dass virale Infektion allein sicher durchgeführt werden nicht in zellulären Veränderungen führen. Auch wenn Auslösen der floxed Gen von Interesse in Ihren Zellen in keiner zellulären Veränderungen (dh Veränderungen in Morphologie oder Lebensfähigkeit) Ergebnis, dann infizieren den gleichen Zelltyp mit Adeno-GFP ist ein wichtiges Steuerelement zu verwenden, um nachzuweisen, dass Viren Transduktion ist auftreten. </li></ul> Über die Untersuchung von Signalkaskaden in Kultur, hat das Adeno-Cre-Ansatz auch in vivo eingesetzt worden, um unter bestimmten Bedingungen zu entfernen Gene von Versuchstieren 3,4 und auf bestimmte Populationen von Zellen innerhalb eines Organismus 6 Beschriften. Das Adenovirus-System kann auch angepasst an anderer Gene als Cre-Rekombinase in Wirtszellen einzuführen. Zwei wesentliche Vorteile bei der Verwendung dieser Lieferung Vektors sind seine hohe Transduktion und Gentransfer Effizienz und mangelnde Integration mit Wirts-DNA. Allerdings kann die Generierung von neuen rekombinanten Adenoviren werden arbeitsintensiv. Die hier beschriebene Protokoll daher nutzt die Kraft des adenoviralen Systems durch die Nutzung der bisher entwickelten Adeno-Cre-Virus und Kupplung, die mit unseren floxed Allel von Interesse, Rac1. Durch diese bedingte knock out Experiment haben wir bestätigt, dass Transduktion mit dem Adeno-Cre Virus MEFs Tragen einer floxed Rac1-Allels in der Tat dazu führen Exzision Rac1 führt zu Veränderungen in der Zellmorphologie charakteristisch für Rac1-defizienten Zellen 2,5.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre-Virus</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME-Hochglukose-Medium 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS kanadischer Herkunft 500 mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>PEN-STREP 1×-Lösung 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirus-vermittelte genetische entfernung von signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen maus-fibroblasten

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Die Fähigkeit, genetisch bestimmte Komponenten entfernen von verschiedenen Zell-Signalkaskaden verfügt über ein integriertes Werkzeug in modernen Signaltransduktion Analyse. Eine besondere Methode, um diese bedingte Löschung zu erreichen, ist über die Verwendung des Cre-loxP-System. Dieses Verfahren beinhaltet flankierende das Gen von Interesse mit loxP-Stellen, die spezifischen Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase-Protein. Die Exposition der sogenannten floxed (flankiert von loxP site) DNA, dieses Enzym zu einer Cre-vermittelte Rekombination Veranstaltung in der loxP-Stellen und die anschließende Entfernung der dazwischenliegenden Gen 3. Mehrere verschiedene Methoden existieren, um die Rekombinase Cre auf der Website von Interesse zu verwalten. In diesem Video zeigen wir die Verwendung eines Adenovirus mit der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) von Embryonen mit einem floxed Rac1 Allel 1 erhalten zu infizieren. Unsere Gründe für die Auswahl Rac1 MEFs für unsere Experimente, dass eine klare morphologische Veränderungen können auf Streichung von Rac1, aufgrund von Änderungen in der Aktin-Zytoskelett 2,5 gesehen werden. 72 Stunden nach der viralen Transduktion und Cre Expression wurden die Zellen gefärbt mit dem Aktin-Farbstoff Phalloidin und abgebildet mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie. Es wurde beobachtet, dass MEFs, die dem Adeno-Cre-Virus ausgesetzt waren erschienen unter Vertrag und verlängerte in der Morphologie im Vergleich zu nicht infizierten Zellen, im Einklang mit früheren Berichten 2,5. Das Adenovirus Methode der Rekombinase Cre Lieferung ist vorteilhaft, da die Adeno-Cre-Virus ist leicht zugänglich und Gendeletion via Cre in nahezu 100% der Zellen kann mit optimierter adenoviralen Infektion erzielt werden.

In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Die Fähigkeit, spezifische Komponenten verschiedener Zellsignalungskaskaden genetisch zu entfernen, ist ein wesentliches Instrument in der modernen Signaltransduktionsforschung geworden ...

Die moderne genetische Analyse stützt sich stark auf Techniken, die die gezielte Entfernung spezifischer Gene aus Zellen, Organen oder ganzen Organismen ermöglichen. Diese Knockout-Experimente helfen dabei, die Funktion des Gens im zellulären Kontext aufzuklären. Die molekularen, morphologischen und physiologischen Phänotypen des Knockouts liefern alle Hinweise auf die Rolle der Genprodukte, die durch die gelöschte Sequenz kodiert werden.Bei Modellorganismen wie Mäusen ist eine gängige Methode zur Erzielung einer bedingten Genlöschung, das interessierende Gen oder Exon mit LoxP-Sequenzen zu flankieren, die als Erkennungssequenzen für das Cre-Rekombinase-Enzym dienen. Die irreversible Auslösung des sogenannten „floxed“-Allels wird dann durch Cre katalysiert, wodurch die Sequenz aus dem Genom entfernt wird. Es existieren verschiedene Methoden, um die Cre-Rekombinase in das System einzubringen, darunter solche, die in vivo durchgeführt werden, und solche, die direkt mit etablierten Zellen arbeiten.Für diese spezielle Anwendung verwenden wir ein Adenovirus, um Cree in Fibroblastenzellen zu liefern, die aus einer transgenen Maus mit einem flock-Allel isoliert und kultiviert wurden. Diese Methode führt zu einer Transgen-Übertragungseffizienz von nahezu 100 %. Wenn das Virus den Zellen verabreicht wird, wird es in eine endozytotische Vesikel aufgenommen und zur Kernhülle transportiert, wo seine DNA, einschließlich des gewünschten Transgens, durch den Kernporenkomplex in den Zellkern eindringen kann.Die zelluläre Maschinerie kann anschließend das injizierte Gen transkribieren und dessen Proteinprodukte in der Zelle wirken lassen. In diesem Fall schneidet das viral codierte Cre-Rekombinase-Enzym das floxed Allel aus dem Genom der Wirtszelle heraus. Wir stammen aus dem Jones-Labor an der University of Guelph in Guelph, Ontario, Kanada.In unserem Labor interessieren wir uns für das Konzept der Signaltransduktion und die Auswirkungen, die sich ergeben, wenn bestimmte Komponenten verschiedener Signaltransduktionskaskaden entfernt werden. Heute werden wir eine Kaskade untersuchen, die mit der Aktinorganisation in Verbindung steht. Die Signaltransduktion wird durch eine Reihe biochemischer Komponenten vermittelt, die Informationen weiterleiten und phänotypische Veränderungen wie die Neuorganisation von Aktin hervorrufen.Unser Protein von Interesse ist RAC1, ein kleines GTPase, das wichtig für die Vermittlung der Aktindynamik ist, einschließlich Zelladhäsion, Migration und Morphologie. In dieser Untersuchung werden wir das CRE/LOX-P-System verwenden, um dieses Gen zu entfernen und seine Rolle in der Zelle zu bestätigen. Zuvor wurden Fibroblasten von embryonalen Mäusen mit einem geflochtenen RAC1-Allel 12 Tage nach der Befruchtung isoliert.Diese Zellen wurden anschließend zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff gegeben, und wir beginnen damit, eine einzelne Phiole dieser Zellen aufzutauen, die einen Embryo repräsentiert. Bei Zellkulturversuchen ist es wichtig, ein steriles Umfeld beizubehalten. Dazu gehört, die freiliegenden Flächen eines zugelassenen Flusswerks zu reinigen sowie alle Reagenzflaschen und Laborgeräte, die in das Flusswerk eingebracht werden, mit 70 %igem Ethanol zu besprühen.Nachdem der Flussbrüster vorbereitet wurde, tauen Sie die Zellen auf, indem Sie das Gefäß in ein Becherglas mit Wasser von 37 Grad Celsius tauchen, bis der Inhalt flüssig ist. Anschließend desinfizieren Sie das Gefäß mit 70 % Ethanol und geben dann die Zellsuspension tropfenweise auf eine 10 cm-Platte, die neun Milliliter DMEM mit hohem Glukosegehalt enthält, das mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin ergänzt wurde.Streptomycin vorsichtig schwenken, um die Zellen zu verteilen, und die Platte in den 37-Grad-Inkubator mit 5 % CO2 stellen, wobei darauf geachtet werden muss, die Platte mit den entsprechenden Informationen zu beschriften. Die Zellen erreichen typischerweise innerhalb von 24 Stunden 100 % Konfluenz. Zu diesem Zeitpunkt können wir die Zellen auf eine neue Platte überführen.Führen Sie dies durch, indem Sie zunächst das alte Medium abpipettieren. Geben Sie fünf ml sterile PBS hinzu, um die Zellen zu spülen, und entfernen Sie diese anschließend ebenfalls. Geben Sie nun ein ml Trypsin, das 10 Millimolar EDTA enthält, hinzu.Stellen Sie die Platte für etwa fünf Minuten in den 37-Grad-Inkubator, damit sich die Zellen vom Substrat lösen können. Bringen Sie sie zurück in den Flussbrüter und geben Sie neun Milliliter Medium zurück in die trypsinisierte Platte, wodurch die Zellen im Verhältnis 1:10 verdünnt werden. Pipettieren Sie die Flüssigkeit mehrmals auf und ab, um Zellklumpen aufzubrechen, und entnehmen Sie anschließend ein Milliliter der Suspension, um es tropfenweise zu neun Millilitern frischem Medium in einer neuen 10-Zentimeter-Platte hinzuzufügen. Schwenken Sie die Platte erneut vorsichtig, um die Zellen zu verteilen, und stellen Sie sie in den 37-Grad-Inkubator.Wenn die Zellen Konfluenz erreicht haben, besteht der nächste Schritt darin, sie auf Glasdeckgläsern auszusäen, damit sie mittels Mikroskopie untersucht werden können. Bereiten Sie die Zellen mit derselben Technik vor, die bis zur Transfektion verwendet wird, einschließlich des Hinzufügens der Vektoren zu den Zellen und deren Inkubation bei 37 Grad Celsius. Während die Zellen sich von der Platte lösen, bereiten Sie eine 6-Loch-Platte mit Glasdeckgläsern vor, wobei je ein autoklaviertes Deckglas pro Mulde verwendet wird.Sobald sich die Zellen von der Platte gel&ouml;st haben, f&uuml;gen Sie f&uuml;nf bis sechs Milliliter Medium zu den trypsinierten Zellen hinzu. F&uuml;r die n&auml;chste Versuchsphase werden Zellz&auml;hlungen durchgef&uuml;hrt, um eine geeignete Anzahl von Zellen f&uuml;r eine effiziente Virusinfektion zu bestimmen. Um die Zellen zu z&auml;hlen, mischen Sie 15 Mikroliter Probe mit einer gleichen Menge Trypanblau, pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um gut zu vermischen, und geben Sie 15 Mikroliter dieser L&ouml;sung in das H&auml;mocytometer.Tote Zellen erscheinen bei dieser Präparation blau. Zählen Sie zur Berechnung der Anzahl der Zellen pro Mikroliter nur die lebenden oder farblosen Zellen im Vier-mal-Vier-Raster. Beginnen Sie mit dem Zählen der Zellen in vier separaten Rastern, A bis D, und bilden Sie den Mittelwert. Multiplizieren Sie diesen Wert anschließend mit zwei, um die Verdünnung in Trypanblau zu berücksichtigen.Da das Raster ein Zehntel eines Mikroliters enthält, mit 10 multiplizieren, um den Wert als Zellen pro Mikroliter auszudrücken. Anschließend das erforderliche Volumen bestimmen, indem die gewünschte Anzahl an Zellen durch die zuvor berechnete Zellkonzentration dividiert wird. Das berechnete Volumen der Zellsuspension tropfenweise zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte hinzufügen.Lassen Sie diese Zellen über Nacht im 37-Grad-Inkubator. Am folgenden Tag wird den Zellen Virus zugegeben. Das aus Vector B Labs bezogene Den-Creek-Virus wurde aliquotiert und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.Holen Sie sich dieses Virus und kehren Sie zur Flusshaube zurück. Entnehmen Sie die 6-Loch-Platte dem Inkubator und bringen Sie sie in die Haube. Aspirieren Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter serumfreiem DMEM.Geben Sie nun je ein Milliliter Medium ohne Serum in jede Vertiefung für die Zugabe des Virus. Für die Virusinfektion verwenden wir eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 500. Die Protokalloptimierung wurde zuvor mit verschiedenen MOIs durchgeführt, und wir stellten fest, dass eine MOI von 500 sehr effiziente Infektionsraten ergab, ohne die Zellviabilität merklich zu beeinträchtigen.Um die MOI zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung. Beginnen Sie mit der Berechnung der erforderlichen Anzahl an Viren, die sich durch Multiplikation der gewünschten MOI – in diesem Fall 500 – mit der Anzahl der Zellen pro Vertiefung, also 30.000, ergibt. Um das Volumen der Virusstammlösung zu bestimmen, das verwendet werden sollte, multiplizieren Sie die Anzahl der Viren mit 1000 und teilen dieses Ergebnis durch die Anfangskonzentration des Virus. In diesem Fall werden wir 1,5 Mikroliter Virusstammlösung zu jeder Vertiefung hinzufügen, die infiziert werden soll.Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um das Virus zu verteilen, und stellen Sie die Platte über Nacht in den 37-Grad-Inkubator. Am nächsten Morgen entfernen Sie das Virusmedium von den Zellen, waschen mit PBS und geben zwei ml reguläres Medium zu den Zellen hinzu. In diesem Experiment stellten wir fest, dass phänotypische Veränderungen in den Zellen nach etwa 72 Stunden auftraten.Mit dem Acton-Färbemittel behandelte Zellen wurden am Advanced Analysis Center der University of Guelph mit dem Leica T-C-S-S-P fünf mehrfachen konfokalen Mehrphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Dies zeigte morphologische Veränderungen zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen. Zellen, denen RAC eins fehlt, erscheinen im Vergleich zu den breiten, abgeflachten, nicht infizierten Zellen verlängert und dünn.Hier haben wir gezeigt, dass das ADOC-Faltungssystem eine robuste Methode für die effiziente Genübertragung in Zellen ist, die über die Untersuchung der Signaltransduktion hinausgeht. Sie können diese Methode jedoch auch verwenden, um Gene in Versuchstieren auszuschalten oder möglicherweise bestimmte Zellpopulationen in einem Organismus zu markieren. Das Adenovirus-System kann außerdem verwendet werden, um Gene, die nicht der Cree-Prinzipiengruppe angehören, einzuführen.Vorteile der Verwendung dieser Abgabemethode sind ihre hohe Affinität, Effizienz und die fehlende Integration in die DNA der Wirtszelle. Die Herstellung gemeinsamer Adenoviren kann jedoch arbeitsintensiv sein. Das hier beschriebene Protokoll nutzt daher die Leistungsfähigkeit des adenoviralen Systems unter Verwendung des zuvor entwickelten Ocre-Virus mit unserem geflockten RAC-One-Mes durch diesen bedingten Knockout haben wir gezeigt, dass.Die Morphologie hängt also tatsächlich teilweise vom kleinen GTPase RAC1 ab. Abschließend möchten wir vom Jones-Labor Ihnen danken, dass Sie sich unser Video angesehen haben, und wünschen Ihnen viel Erfolg in all Ihren zukünftigen Forschungsprojekten.

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