Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System
28. August 2010
Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen Ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.
In der Entwicklungsbiologie werden verschiedene Tierarten für Experimente verwendet. Die Rot-Embryo-Kultivierungstechnik wurde in den 1950er Jahren etabliert und vor der Einführung moderner genetischer Manipulationstechniken in der hawaiianischen Landwirtschaft weiterentwickelt. Geschwächte Direktoren zielen gezielt auf Bereiche des Lebens mit Tod oder Transfektion von Genen ab, da Embryonen manipuliert werden können und somit als Mikroskop dienen; daher ist die Kultur ganzer Embryonen ein äußerst nützliches Werkzeug.
Wenn wir den dynamischen Entwicklungsprozess von Maorian-Embryonen nach der Implantation untersuchen möchten, ist das Wachstum der Maorian-Embryonen entscheidend von dem funktionellen Präsentator abhängig, was die Kulturzeit begrenzt. Im Allgemeinen können wir Embryonen im Zeitraum des embryonalen Tages 8,5 bis 14,5 bei der Ratte und E 6,5 bis 12,5 bei der Maus kultivieren.
Im Labor kultivieren wir Ratten- und Mausembryonen mithilfe eines rotierenden Kultursystems. Dieses Kultursystem ist am gebräuchlichsten und am besten geeignet für die Kultivierung von Ratten- und Mausembryonen während der Hauptentwicklungsphase der Trächtigkeit, also nach E 11,5 bei Ratten und E 9,5 bei Mäusen.
In diesem Video möchten wir unseren Standardprotokoll für die Hungernährung unter Verwendung von E12,5-RU-Embryonen vorstellen. Unter diesen Bedingungen kann der Embryo zwei Tage lang kultiviert werden, was ausreichend ist, um verschiedene wirksame Manipulationen in der Horlandwirtschaft zu untersuchen. Es gibt zwei kritische Schritte für den Erfolg.
Zunächst sollte das Präparationsverfahren genau durchgeführt werden, um den Embryo, insbesondere die Rindengefäße, nicht zu beschädigen. Zweitens sollte das Verfahren so schnell wie möglich erfolgen. Dies gilt insbesondere für ältere Embryonen.
Beispielsweise müssen E 10,5-Maus-Embryonen innerhalb von 30 Minuten übertragen werden. Wir wandten die Ganzembryonen-Kulturmethode für die Kultivierung von sechs mutierten rechten Embryonen an. Beispielsweise analysieren wir den Migrationsverlauf von Neurore-Zellen im Mutanten, indem wir eine kleine Anzahl von Zellen mit Farbstoff markieren oder Level-Zellen in Embryonen mit weißem Typ und mutiertem Hintergrund transplantieren.
Außerdem haben wir eine Methode zur Genübertragung in kultivierte Maus- und Hühnerembryonen mittels Elektroporation, die elektrischen Stromstoß nutzt, etabliert. Wir können Konstrukte exogener Gene, dominant-negativer Formen und siRNAs einfach in Bereiche des sich entwickelnden Gehirns einführen. Daher lassen sich Genfunktionen leicht durch Funktionsverlust- und Funktionsgewinn-Experimente analysieren.
Wir untersuchen außerdem das Verhalten von Zellen, die mit GFP oder RFP markiert wurden, unter Verwendung von Organkultur oder Schnittkultur, anschließend oder in Kombination mit Landwirtschaft. So können Sie eine Vielzahl von Experimenten mittels Lio-Kultur in Kombination mit anderen Techniken durchführen.
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Übersicht
Dieses Video-Protokoll demonstriert die Kulturtechnik für gesamte Embryonen bei Rattenembryonen nach E12,5 unter Verwendung eines rotierenden Flaschenkultursystems. Diese Methode ermöglicht die Kultur ex vivo während kritischer Phasen der mittleren Gestation.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Entwicklungsbiologie
- Embryologie
- Ex-vivo-Kultivierungstechniken
Hintergrund
- Die Ganzembryokultivierungstechnik ist seit den 1950er Jahren etabliert.
- Sie ermöglicht die Manipulation von Embryonen für genetische Untersuchungen.
- Embryonen können während bestimmter Entwicklungsphasen kultiviert werden.
- Das Wachstum hängt von der funktionellen Anwesenheit des Embryos ab.
Zweck der Studie
- Untersuchung dynamischer Entwicklungsprozesse von Embryonen nach der Implantation.
- Bereitstellung eines standardisierten Verfahrens für die Kultur ganzer Embryonen.
- Erleichterung der Forschung in der Entwicklungsbiologie.
Verwendete Methoden
- Ganzembryonalkultivierungstechnik
- Kultivierungsverfahren mit rotierenden Flaschen
- Ex-vivo-Bedingungen für Rattenembryonen
- Kultivierungszeiträume vom embryonalen Tag 8,5 bis 14,5
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kultivierung von Rattenembryonen nach E12,5.
- Demonstration standardisierter Verfahren für die Embryomanipulation.
- Erkenntnisse zu den kritischen Wachstumsphasen von Embryonen.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Kultur ganzer Embryonen ist ein wertvolles Werkzeug in der Entwicklungsbiologie.
- Sie ermöglicht die Untersuchung der embryonalen Entwicklung unter kontrollierten Bedingungen.
- Standardisierte Methoden verbessern die Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Rotator-gestützte Kultursystem für ganze Embryonen (WEC) ermöglicht die direkte Manipulation und Beobachtung von Nagetierembryonen während kritischer Phasen der mittleren Gestation und unterstützt so die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckung. Diese ex vivo-Plattform erlaubt präzise genetische und zelluläre Eingriffe und erleichtert die funktionelle Zielvalidierung sowie die Untersuchung von Signalwegen, bevor in vivo-Studien durchgeführt werden. Aufgrund ihrer Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit stellt sie eine wertvolle Ressource für translationsmedizinische Forschung und die Priorisierung von Projekten in der Entwicklungsforschung und bei der Modellierung von Erkrankungen dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte genetische oder zelluläre Manipulation zur funktionellen Zielstrukturvalidierung in Säugetierembryonen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Verlust- und Gewinn-von-Funktion-Studien in einem kontrollierten Ex-vivo-System ermöglicht werden.
- Erleichtert die Klärung von Signalwegen und die Überprüfung von Hypothesen an entscheidenden Entwicklungszeitpunkten.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung der Auswirkungen von kandidatenbasierten Interventionen auf die embryonale Entwicklung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, manipulierbare embryonale Systeme für nachgeschaltete phänotypische Screening-Verfahren oder mechanistische Assays vor.
- Ermöglicht die reproduzierbare, quantitative Beurteilung von Entwicklungsresultaten nach genetischen oder chemischen Störungen.
- Unterstützt die Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays für vergleichende Studien über Genotypen oder Interventionen hinweg.
- Ermöglicht die zuverlässige Evaluierung der Funktion von Substanzen oder Genen in einem physiologisch relevanten Kontext.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung auf krankheitsrelevante Entwicklungsstadien zur Modellierung angeborener Störungen oder Genfunktionen.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem mechanistische Untersuchungen an intakten Embryonen ermöglicht werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem entwicklungsbedingte Risiken früh im Prozess geklärt werden.
- Erleichtert die Entdeckung und Validierung von Biomarkern in einem kontrollierbaren und manipulierbaren System.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Rotator-WEC-System verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem es hypothesengetriebene Manipulationen und die quantitative Analyse der embryonalen Entwicklung ermöglicht. Als Bindeglied zwischen In-vitro-Assays und In-vivo-Modellen bietet es eine einzigartige Plattform für mechanistische Studien und die Absicherung von Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch direkte genetische oder zelluläre Eingriffe.
- Screening: Bietet assaysbereite, reproduzierbare embryonale Systeme für quantitative phänotypische Auswertungen.
- Analytik: Ermöglicht die Messung entwicklungsgeschichtlicher, migrationsbezogener oder molekularer Ergebnisse zur vergleichenden Analyse.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe mechanistische Erkenntnisse mit präklinischem Krankheitsmodellierung und der Validierung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, anpassungsfähige Plattform für den wiederholten Einsatz in mehreren Entdeckungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare ex-vivo-Arbeitsabläufe für Entwicklungsstudien.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz, indem biologische Risiken frühzeitig geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets im Entdeckungsstadium.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Embryologie, Mikrodissektion und ex vivo-Manipulationstechniken.
- Benötigt spezialisierte Rotationskulturgefäße und mikroskopische Ausrüstung.
- Erfordert strenge, übergreifende Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann je nach Nagetierstamm oder Entwicklungsstadium Anpassungen erfordern.
- Die Kulturdauer ist durch die embryonale Abhängigkeit von der Plazentafunktion begrenzt, was den Analysezeitraum einschränkt.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
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The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
