Name: Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Ratten-Schwanzsehnen für biomechanische Studien. Diese Methode umfasst Extraktion, Querschnittsmessung und Bioreaktor-Beladung zur Gewährleistung von Gewebeviabilität.

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Dieser Artikel wurde von NSERC Grant # 299280, IRSST als ein Stipendium an G. Eltern und FRSQ als ein Bachelor-Student Research Award an M. Cyr unterstützt. Wir bedanken uns bei Yoan Lemieux-Laneville für die Durchführung der Manipulationen auf Video aufgezeichnet.

Vor jeder Manipulation, müssen Sie identifizieren die Gruppe der Sehnen verwendet je nach Experiment den Sie gerade führen und die Vorrichtung zu Ihrer Verfügung sein. Für unsere Zwecke wurden ventralen Sehnen gewählt, weil sie kleiner sind und somit leichter zu manipulieren, wenn die Messung der Querschnittsfläche auf und ergänzen sie in den Bioreaktor Kammer. Bitte beachten Sie, dass alle Instrumente autoklaviert oder sterilisiert mit 70% Ethanol. Darüber hinaus ist eine Sprühflasche mit 70% Ethanol neben jedem Arbeitsplatz aufgestellt, um die Experimentatoren Handschuhe vor jeder Operation zu sterilisieren. Teil 1: Extraction Nach der Resektion wird die Rute vorsichtig an den Extremitäten manipuliert, um eine Beschädigung des Gewebes. Auch die Erhaltung der Zellviabilität, sind alle Manipulationen in kalter Kochsalzlösung durchgeführt. 1A) Materialien: <ul><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> Crushed Eis </li><li> Oberflächenschutz </li><li> Schneidbrett </li><li> Individuelle Manipulation Platten </li><li> 2 500 ml Speisen </li><li> 2 2L Glasschalen </li><li> Klebeband </li><li> 1 Pinzette </li><li> 1 Pinzette </li><li> 1 Pinzette stehen </li><li> 1 Paar OP-Schere </li><li> 1 Skalpell </li><li> 1 Paar OP-Schere <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Individual Manipulation mit Orientierung Identifikation ("P" für "proximal") </li></ul> 1B) Work-Station: <ol><li> Breiten Sie die Oberfläche Beschützer und Stelle das Schneidebrett an der Spitze. </li><li> Füllen Sie jeweils zwei größeren Glasschalen zur Hälfte mit gestoßenem Eis und legen sie auf das Papier. </li><li> Stick ein Stück Klebeband an einer Ecke der Manipulation Platte und identifizieren sich mit einem Brief an den proximalen Ende geben. </li><li> Füllen Sie die beiden kleinen Glasschalen auf halbem Weg und alle Nuten der Manipulation Platten mit kalter Kochsalzlösung. Legen Sie sie in das große Glas-Schalen mit Eis. </li><li> Organisieren Sie alle sterilen Instrumenten auf der Oberfläche Beschützer. </li><li> Übertragen Sie die Rute in einer der Glas-Schale mit Kochsalzlösung. </li></ol> 1C) Manipulationen: <ol><li> Beachten Sie die Anatomie am proximalen Ende des Schwanzes, die Bauchseite von der Rückenseite zu unterscheiden. Die Bauchseite hat eine größere Anzahl von Sehnen und ein Blutgefäß, das durch leichtes Drücken der Schwanz bis zu winzigen Tropfen Blut zu produzieren überprüft werden kann. </li><li> Mit dem OP-Schere, schneiden Sie die Haut an der Dorsalseite des Schwanzes, wenn Sie die ventralen Sehnen (oder entlang der Bauchseite, wenn Sie die dorsalen Sehnen brauchen) extrahieren möchten. </li><li> Öffnen Sie den Schnitt am proximalen Ende und entfernen Sie die Haut mit einer Pinzette oder mit den Fingern und durch eine sorgfältige Manipulation der Schwanz endet. </li><li> Spülen Sie das Blut und die Haare in der Salzlösung und Transfer der Probe in den verbleibenden Glasschale mit frischen Lösung. Wechseln Sie die Handschuhe. Ein Transversalschnitt unter dem Lichtmikroskop zeigt die sechs Sehne Gruppen. Eine Sehne aus jeder Gruppe ist es, die kaudale Ende eines jeden Wirbel befestigt, so schneiden wir an der Bandscheibe zu neuen Sehnen entlang der Schnittlinie aussetzen. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Transversalschnitt der Rattenschwanz unter dem Lichtmikroskop. </li><li> Schneiden Sie das distale Ende durch den Knorpel 2-3 Wirbeln kürzer mit chirurgischer Schere. Setzen Sie den Schwanz auf dem Schneidebrett auf die Weichteile mit einem Skalpell und dann sofort wieder in den zugeschnittene Lösung. </li><li> Mit einer Pinzette herausziehen eine Sehne aus dem distalen Endstück. </li><li> Mit einem sanften halten an beiden Enden, statt der Sehne in die einzelnen Manipulationen Platte. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, bis keine mehr Sehnen aus gehänselt werden können und schneiden ein Wirbel kürzer, wenn neue Gewebe ausgesetzt werden müssen. </li></ol> Teil 2: Querschnittsfläche Messung 7 Wenn das Gewebe mechanische Charakterisierung oder Stimulation erfährt, sind seine mechanischen Eigenschaften durch die Normalisierung der Kraft im Inneren der Sehne zu betonen, beschrieben. Deshalb haben wir Querschnittsfläche zu bewerten. 2A) Materialien: <ul><li> Optic Mikrometer </li><li> Stereomikroskop </li><li> Digitalkamera </li><li> Edge-Anerkennung und Profil Rekonstruktionsalgorithmen 5,6 </li><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> 1 20-200 ul Micro Volumenpipette </li><li> 1 Hex Schlüssel für optische Mikrometer Anpassungen </li><li> 2 Pinzetten / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/&gt; Abbildung 3. Optic Mikrometer </li></ul> 2B) Work-Station: <ol><li> Öffnen Sie die Software (Digital-Kamera und Algorithmen). </li><li> Legen Sie die Optik Mikrometer, so dass genügend Platz vorhanden ist, um die Sehne in der Apparatur zu laden. </li><li> Organisieren Sie die Instrumente und Glasschale mit den extrahierten Sehnen in der Nähe. </li></ol> 2C) Manipulationen: <ol><li> Füllen Sie den Mess-Fach mit kalter Kochsalzlösung, bis beide Anker-Systeme untergetaucht sind. </li><li> Transfer der Sehne in das Fach, indem Sie die Enden mit einer Pinzette. </li><li> Mit Saug über die Mikro-Volumen Pipetten, ziehen eine Extremität in einer Zeit, in der Silizium-Rohr. Saugen Sie bis zum Ende erstreckt sich über die Welle Kragen. </li><li> Ziehen Sie die Stellringe an den Rohren zu komprimieren und installieren Sie das Gerät unter dem Stereomikroskop. </li><li> Bei 105X Vergrößerung, erstrecken sich die Sehnen unter Beachtung der Gewebe, bis die Falten nicht mehr wahrnehmbar sind. Stretch von zusätzlichen 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Tendon Projektion bei 105x Vergrößerung vor und nach dem Dehnen. </li><li> Stellen Sie Position und Fokus auf ein klares Bild von der Sehne über einen 180 °-Drehung zu halten. </li><li> Nehmen Sie ein Foto an alle 10 °-Drehung ohne Änderung Spannung, Fokus oder Position. Verwenden Sie nur die Welle für die Durchführung der Rotation. Wegen seiner Kegelform, können Sie diese Schritte an verschiedenen Punkten entlang der Sehne wiederholt werden. </li><li> Aktivieren Sie den Rand Anerkennung und Profil Rekonstruktionsalgorithmen, um die Datenbank, die Sie sich registriert haben zu analysieren. </li><li> Befreien Sie die Sehne durch Lösen der Welle Kragen und Einblasen von Luft in die Silikonschläuche mit dem Mikro Volumenpipette. </li><li> Setzen Sie die Sehne auf die Manipulation Platte wieder Handhabung durch den Enden. </li><li> Überprüfen Sie die Form des Profils Wiederaufbau erhalten und den Wert der Querschnittsfläche. </li></ol> Teil 3: Spülen So entfernen Sie Verunreinigungen, die während der vorangegangenen Manipulationen stattgefunden haben kann, sind die Gewebe unter Biosicherheitswerkbank gespült. 3A) Materialien: <ul><li> Kalter Kochsalzlösung (D-PBS) </li><li> Multiple-Nut Manipulation Platte </li><li> Individuelle Manipulation Platten </li><li> Klebeband </li><li> 2 Pinzetten </li><li> 1 Pinzette stehen </li></ul> 3B) Work-Station: <ol><li> Schalten Sie den Lüfter in der Biosicherheitswerkbank 15 Minuten im Voraus und reinigen Sie die Innenflächen mit 70% Ethanol. </li><li> Bringen Sie alle Instrumente im Inneren des Biosicherheitswerkbank. </li><li> Stick-Klebestreifen auf einer Ecke der einzelnen Platte mit dem proximalen Ende zu identifizieren. </li><li> Füllen Sie alle Rillen mit steriler Kochsalzlösung. </li></ol> 3C) Manipulationen: <ol><li> Führen Sie die Manipulation Platte mit den extrahierten Sehnen in den Schrank. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Sehne von ihrem Teller mit einem sanften Griff an jedem Ende. </li><li> Tauchen und sanft rühren die Sehne in der Salzlösung jedes Fach des Multiple-Nut Manipulation Platte, beginnend mit dem nächsten und Verfahren, um die am weitesten Nut. </li><li> Schließlich tauchen die Sehne in eine individuelle Manipulation Platte. </li></ol> Teil 4: Laden in Bioreaktor Kammer Zur Vermeidung weiterer Kontaminationen, sind die folgenden Manipulationen auch im Biosicherheitswerkbank durchgeführt. 4A) Materialien: <ul><li> Bioreaktor Kammer 4 </li><li> Sterile Anker </li><li> 1 Steriles Petrischale </li><li> Kalte Zelle kultivierten Medium (DMEM) </li><li> Cyanacrylat </li><li> 2 Pinzetten </li><li> Pinzetten stehen </li><li> 0,5-10 &amp;mgr; l Micro-Volumenpipette </li><li> 1 Lineal <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Bioreaktor Kammer </li></ul> 4B) Work-Station: <ol><li> Seit dem letzten Schritt wurde auch in Biosicherheitswerkbank realisierte Abbau unnötiger Tools geben Ihnen mehr Platz zum Arbeiten. </li><li> Bringen Sie alle anderen Instrumente im Schrank. </li></ol> 4C) Manipulationen: <ol><li> Legen Sie einen Anker auf die Manipulation Platte mit seiner Spule über der Sehne Extremität zentriert und Wunde im Gewebe und um die Spule. </li><li> Rollen Sie den Anker über und halten Sie die lose Extremität gleichzeitig sicherzustellen, dass das Gewebe an der Anker bleibt. Stop nach ¾ abbiegen. </li><li> Führen Sie das GleicheSchritte mit dem anderen Ende. </li><li> Roll beide Anker über gleichmäßig, bis es 6 cm zwischen den Zentren 1. </li><li> Lösen der Sehne, um es in die Lösung eintauchen und damit die Verankerung Abschnitten kurz antrocknen seiner mechanischen Eigenschaften 2-3 erhöhen. </li><li> Gießen Sie in der Petrischale Cyanacrylat und zeichnen 2.5μL in die Mikro-Volumen Pipetten. </li><li> Einen Tropfen Cyanacrylat auf die Wunde-up Gewebe ohne Sturz eines Klebers in der Salzlösung. Wiederholen, bis 2 Tropfen auf jeder Anker angewendet wurden. </li><li> Mit der Sehne noch völlig eingetaucht, 5 Minuten warten, bis der Kleber vollständig trocknen. </li><li> Während dieser Zeit füllen die Kammer Fach mit Kochsalzlösung. </li><li> Rehydrieren alle Gewebe mit Kochsalzlösung, um Schäden zu verhindern. </li><li> Durch die Manipulation nur die Anker, Transfer der Sehne in den Bioreaktor Kammer und schließen Sie es, um ein Auslaufen und Verschmutzung während der Übertragung zu verhindern. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis des Protokolls zeigt, dass, wenn richtig durchgeführt, unsere Gewebe strenger Isolierung und Herstellung Verfahrens es möglich, Gewebe Sterilität, die Lebensfähigkeit und Integrität aufrecht zu erhalten. Der erste ist, die einfache und repetitive Extraktionsmethode, können wir bis zum Schwanz Sehnen ohne Beschädigung der Kollagen-Netz, wie es durch eine mikroskopische Analyse von H &amp; E tainted Abschnitte nach der Extraktion realisiert beobachtet werden können extrahieren. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Tendon Kollagen-Netzwerk nach der Extraktion (5 um Längsschnitt mit H &amp; E gefärbten). Wir haben dann kultiviert Sehnen für bis zu 10 Tage und führte Sterilitätstests. Jeder Tag, inkubierten wir vernickelt verwendet Nährlösung auf Agar und es für 24 Stunden. Da kein bakterielles Wachstum beobachtet wurde, schlossen wir, dass unsere Manipulationen nicht zu einer Kontamination führen. Mit dem Profil Rekonstruktionsalgorithmus und optische Mikrometer, sind wir in der Lage, die Querschnittsfläche innerhalb einer Marge von 2% der Fehler 7 zu schätzen. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Profil Rekonstruktion eines RTT. Schließlich untersuchten wir die Lebensfähigkeit unter Verwendung des LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit für Säugerzellen nach dem Spülvorgang und nach zwölf Tagen Kulturdauer. Da eine große Mehrheit des grün fluoreszierenden lebenden Zellen erkennbar waren, können wir bestätigen, dass unser Verfahren zur Isolierung von erfolgreich Aufbewahrung lebender Gewebe. Der gleiche Test wurde zwei Stunden nach dem Anbringen der Sehne in den Bioreaktor Kammer durchgeführt. Wir Nachweis erbracht, dass die Entwässerung und kleben an der Anker noch nicht in das Gewebe zwischen den beiden Anker zu verbreiten. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Abbildung 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Tissue Lebensfähigkeit der Anker (grün = lebende Zellen, rot = tote Zellen)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Durch die Anwendung dieser experimentellen Verfahren, können wir eine Vielzahl von in vitro Studien durchführen zu dieser Art von Geweben. Da war zum Beispiel eine Studie über Gewebedegeneration durch die Anwendung der unter-Stimulation RTT für einen Zeitraum von zehn Tagen zu erfolgen. Jeder Tag, wir Gewebe mechanische Eigenschaften in nicht-destruktive Spannungsrelaxation Tests ausgewertet. Am Ende konnten wir RTT Spannungsverlauf zu beobachten und damit zu analysieren den Verlauf der mechanischen Eigenschaft...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reagenz</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Salzlösung</td></tr><tr><td>Glcose </td><td>Reagenz</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Salzlösung&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiotika-Antimykotika </td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Salzlösung&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Reagenz</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Kulturmedium&lt;br/&gt;3,7 g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagenz</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Kulturmedium&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiotika-Antimykotika</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Kulturmedium&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Okularmikrometer</td><td>Werkzeug</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulationsplatte</td><td>Werkzeug</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktorkammer</td><td>Werkzeug</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der rattenschwanzsehnen für biomechanik und mechanobiological studies

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rattenschwanzsehnen (RTT) sind ein gemeinsames biologisches Modell in experimentellen in vitro-Studien eingesetzt in den Bereichen Sehne Physiologie und Tendopathie. Arbeiten mit diesen Geweben ist eine Herausforderung, weil sie sehr empfindlich sind, und bis jetzt gab es keine streng detailliertes Protokoll für die Isolation. Angesichts dieser Herausforderungen haben wir Methoden und Instrumente entwickelt, um Manipulationen von RTT und Kontrolle Gewebeviabilität, Sterilität und Unversehrtheit zu erleichtern. Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur RTT für biomechanische und mechanobiological Studien vorzubereiten. Extraktion, Querschnittsfläche Messung, Spülen und Laden in den Bioreaktor Kammer: Unsere Arbeit ist in vier Hauptbereiche unterteilt. Bei jedem Schritt werden alle Verfahren, Materialien und Manipulationen im Detail vorgestellt, so dass sie leicht reproduziert werden kann. Darüber hinaus sind die spezifischen Instrumente entwickelt vorgestellt: eine Manipulation Platte verwendet werden, um RTT zu trennen, eine optische Mikrometer, um das Gewebe während der Querschnittsfläche Messung und eine Verankerung der Lage, die RTT auf einen Bioreaktor befestigen. Schließlich beschreiben wir die Ergebnisse nach mehreren Tests erhalten unsere Methoden zu validieren. Die Lebensfähigkeit, Sterilität und Unversehrtheit Auswertungen zeigen, dass unser Verfahren streng genug für Manipulationen fragile Gewebe wie Rattenschwanzsehnen sind.

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Rattenschwanzsehnen für biomechanische und mechanobiological Studien vorzubereiten. Einige Funktionen der wichtigsten Schritte in Vorbereitung sind nachgewiesen, beginnend mit der Extraktion Querschnittsfläche Messung, Spülen und Laden in den Bioreaktor Kammer.

Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies

Rattenschwanzsehnen (RTTs) sind ein gängiges biologisches Modell, das in experimentellen In-vitro-Studien in den Bereichen der Sehnenphysiologie und Tendinopathie eingesetzt wird. Die Arbeit ...

Das Video, das Sie gleich sehen werden, enthält die experimentellen Verfahren zur Isolierung und Vorbereitung der Rattenschwanzsehne für biomechanische und mechanobiologische Untersuchungen. Ziel dieses Beitrags ist es, die Methoden und Instrumente zu demonstrieren, die entwickelt und optimiert wurden, um die Gewebeviabilität, Sterilität und Integrität während des Vorbereitungsverfahrens zu gewährleisten. Wir werden mehrere Aspekte der wichtigsten Schritte der Vorbereitung besprechen, beginnend mit der Entnahme, gefolgt von der Messung der Querschnittsfläche, dem Spülen und schließlich dem Beladen in die Bioreaktorkammer.Beginnen wir. Die Extraktion ist der erste Schritt der Vorbereitung, um die Zellviabilität zu erhalten. Alle Manipulationen werden in kalter Seline-Lösung durchgeführt.Nachdem die Ratte euthanasiert wurde, wird der Schwanz reseziert, mit 70 %igem Ethanol abgespült und in eine Schale mit Zellen und Lösung überführt, die auf Eis gehalten wird. Um die Sehnenentnahme zu erleichtern, muss die Haut entfernt werden. Dabei ist zu berücksichtigen, dass wir mit ventralen Sehnen arbeiten.Da sie kleiner sind und sich leichter mit unseren Geräten handhaben lassen, wird ein Schnitt entlang der dorsalen Seite des Schwanzes vorgenommen. Die korrekte Orientierung des Schwanzes wird anschließend überprüft, indem die Anatomie am proximalen Ende betrachtet wird. Wie wir sehen können, weist die ventrale Seite eine größere Anzahl von Sehnen auf, und das Vorhandensein eines Blutgefses lässt sich anhand der austretenden Blutstropfen bestätigen.Bei vorsichtigem Zusammendrücken des Schwanzes wird der Schnitt vorgenommen. Beginnend am proximalen Ende und unter Verwendung einer chirurgischen Schere. Es ist darauf zu achten, den Schwanz an seinen Enden zu manipulieren.Wenn der Einschnitt abgeschlossen ist, wird die Haut entfernt, wobei ebenfalls am proximalen Ende mit den Fingern oder einer Pinzette begonnen wird. Auch hier wird darauf geachtet, den Schwanz nur an den Enden zu manipulieren. Anschließend wird der Schwanz in der Lösung gespült, um Haare und Blut zu entfernen.Das Präparat wird anschließend in eine Schale mit frischer Lösung überführt und auf Eis gehalten. Zu diesem Zeitpunkt wechselt der Experimentator die Handschuhe, um die Sehne freizulegen. Das distale Schwanzende wird um zwei bis drei Wirbel gekürzt.Die Wirbel sind die sichtbaren Bündel zwischen den Sehnenbündeln und können ertastet werden, wenn man mit den Fingern entlang des Schwanzes gleitet. Ein Blick auf die Lichtmikroskopie eines Querschnitts, der entlang des Wirbels angefertigt wurde. Die Skoal-Ende zeigt, dass es sechs verschiedene Sehnengruppen gibt, da die Sehne von jeder einzelnen am Wirbel ansetzt, und dass wir nur das ventrale Gewebe verwenden.Vier Sehnen werden bei jedem Schnitt herausgezogen, zwei aus den unteren Gruppen und zwei aus den seitlichen Gruppen. Zum Durchführen der Resektion können Sie eine chirurgische Schere verwenden, um die Bandscheibe zu durchtrennen, und ein Skalpell auf einem Schneidebrett für das weiche Gewebe. Zu diesem Zeitpunkt wird die ventrale Seite anhand der größeren Sehnenpolster erkannt.Nachdem die Orientierung überprüft wurde, werden die Sehnen vorsichtig mit einer Pinzette vom distalen Ende ausgehend entnommen; wenn keine weiteren Gewebestücke herausgelöst werden können, wird der Schwanz am Wirbelübergang abgetrennt, wie zuvor gezeigt. Nach der Entnahme wird das Gewebe unmittelbar in die Lösung getaucht und unter Spannunghaltung beider Enden in eine Manipulationsplatte überführt, die ebenfalls die Zellsuspension enthält und auf der ein Klebestreifen das proximale Ende markiert. Eine mikroskopische Analyse von H-und-E-gefärbten Längsschnitten zeigt, dass durch Anwendung dieser einfachen und wiederholbaren Methode das extrahierte Gewebestück ein gut ausgeprägtes und dicht gepacktes Kollagen-Netzwerk aufweist.Nach der Manipulation beschreiben wir die mechanischen Eigenschaften von Geweben, die mechanischer Stimulation unterzogen werden, indem wir die innere Kraft auf die Spannung normieren. Daher müssen wir ihre Querschnittsfläche bestimmen. Um dies zu erreichen, wird das Querprofil mithilfe einer Stereomikroskopie, die mit einer digitalen Kamera ausgestattet ist, rekonstruiert.Mithilfe dieser Methode bleibt die Gewebestruktur erhalten, da Schneelast oder mechanische Belastung direkt darauf ausgeübt werden. Die Digitalkamera nimmt Bilder der Projektion des Prüfkörpers aus einem 180°-Blickwinkel auf. Innerhalb eines Referenzrahmens lokalisiert ein Bildverarbeitungsalgorithmus die oberen und unteren Kanten des Probenkörpers.Anschließend wird ein Algorithmus mit der MATLAB-Software verwendet, um die Profilrekonstruktion durchzuführen. Ein optisches Mikrometer wurde entwickelt, um das Gewebe in der Fokusebene zu halten. Außerhalb dieses Bereichs ist die Projektion unscharf, und eine erneute Fokussierung würde das lokale Bezugssystem verschieben.Der Mikrometer verfügt über eine Messkammer zur Verhinderung der Gewebetrocknung. Zwei Positioniersysteme mit Drehbühne ermöglichen die Probendrehung und zwei Verankerungsvorrichtungen, die aus Silikonschläuchen bestehen, die gegen Farbmarkierungen an der Welle gedrückt werden. Zunächst wird die Messkammer mit kalter Zelllösung gefüllt, bis die Öffnungen der Silikonschläuche untergetaucht sind.Dann wird der Spaceman mit einer Pinzette unter ausschließlicher Berührung der Extremitäten in die Messkammer überführt. Mithilfe einer Mikrovolumenpipette werden die Sehnenenden durch einen Schnitt in die Silikonröhrchen eingezogen. Anschließend wird so lange aspiriert, bis das Ende über die Farbmarkierungen des Schafts hinausragt.Nachdem beide Seiten fertig sind, werden die Farben der Achse festgezogen, indem ein Bundschlüssel verwendet wird, um das Rohr zu komprimieren. Nun, da die Sehne fixiert ist, wird die Vorrichtung unter dem Stereomikroskop installiert. Die Sehne kann direkt über den Computerbildschirm bei einer Vergrößerung von 105 beobachtet werden.Zur Vereinheitlichung wird die Sehne so weit gedehnt, bis die Falten nicht mehr wahrnehmbar sind, gefolgt von einer zusätzlichen Deformation von 0,4 %. Da die Probe von 0 bis 170 Grad abgebildet wird, sind die Ausgangsposition und die Fokusanpassung erforderlich, um über den gesamten Umfang ein klares Bild zu erhalten. Tatsächlich werden 18 Aufnahmen angefertigt, wobei die Probendrehung zwischen jeder Ansicht um 10 Grad erhöht wird.Mithilfe dieser Methode ist es möglich, die Querschnittsfläche einer Rattenschwanzsehne zu schätzen, ohne das Gewebe zu beschädigen. Am Ende erhält man eine Profilrekonstruktion mit einem Fehler von 0,5 bis 2 %. Nach der Messung werden die Gewebe gespült, um eine Kontamination zu verhindern, die während der vorherigen Handgriffe aufgetreten sein könnte.Ein steriles Manipulationsplättchen mit frischer Einbettungslösung wird in den Schrank gebracht, wobei eines für den Spülvorgang verwendet wird und das andere das gespülte Sehnenstück aufnimmt. Der Experimentator desinfiziert seinen Handschuh mit 70 % Ethanol, bevor das entnommene Sehnenstück in den Sicherheitswerkbank eingeführt wird. Unter ausschließlicher Fixierung der Enden wird das Sehnenstück vorsichtig von Vertiefung zu Vertiefung transferiert.Schließlich wird es in eine einzelne Manipulationsplatte überführt, die ebenfalls sterile Zelllösung enthält. Zur Protokollvalidierung führten wir Tests zur Vitalität und Sterilität durch. Zunächst wurde die Zellviabilität mithilfe eines Live-Dead-Vitalitäts- und Zytotoxizitätskits für Säugetierzellen bewertet.Nach einer Kultivierung von 12 Tagen wurden eine große Mehrheit grün fluoreszierender lebender Zellen sichtbar, was bestätigt, dass die Isolierungsverfahren erfolgreich lebendes Gewebe erhalten haben. Anschließend wurden Untersuchungen durchgeführt, um eine Kontamination der verwendeten Kultur zu überprüfen. Das Medium wurde auf Agar ausgestrichen und 10 Tage lang inkubiert, da kein bakterielles Wachstum beobachtet wurde.Wir führten durch, dass unsere Manipulationen steril sind. Das Verankerungssystem nutzt die Vorteile der Gewebetrocknung und des Klebers für kleine Proben wie Rattenschwanzsehnen, wobei der Kleber in das Gewebe eindringt. Dadurch wird es in allen Untereinheiten fixiert, während die Trocknung die mechanischen Eigenschaften verbessert, um weitere Kontaminationen zu vermeiden.Der gesamte Beladungsvorgang wird unter einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, bei der alle Instrumente und Kammernbestandteile steril sind. Für den Beladevorgang wird die Bioreaktorkammer auf einer Positioniervorrichtung befestigt. Zwei mobile Arme sind so eingestellt, dass sie die Sehnenanker aufnehmen. Ein Deckel verschließt die Kammer, um Kontaminationen zu verhindern. Zuerst werden die Anker an den Enden der Manipulationsplatte platziert. Ihre Spulen sind mittig zur Längsachse der Nut und über dem Sehnenansatz ausgerichtet.Die Sehne wird dann um einen Anker aufgewickelt. Der Anker wird etwa drei Viertel einer Umdrehung lang weitergedreht, während der Gewebekörper in der Lösung verbleibt. Indem wir das lose Ende festhalten, stellen wir die Befestigung des Gewebes am Anker sicher.Derselbe Vorgang wird anschließend für das andere Extremitätsende wiederholt. Sobald beide Seiten fixiert sind, werden die Anker gleichmäßig auf- oder abgerollt, bis ein Abstand von sechs Zentimetern erreicht ist. Zwischen den beiden Enden werden zwei Tropfen à 2,5 Mikroliter Ocreate auf den verletzten Teil der Sehnen aufgebracht.Um die Adhäsion sicherzustellen, ist Vorsicht geboten. Um zu vermeiden, dass Klebstoff in die Zelllösung gelangt, sind mindestens fünf Minuten erforderlich, damit der Klebstoff vollständig trocknen kann. Zur Validierung unseres Protokolls führten wir Tests durch, um den Einfluss des Klebstoffs und der Austrocknung der Verankerungspunkte auf die Gewebeviabilität zu überprüfen.Nach zwei Stunden stellten wir fest, dass sich die Extremitätsbedingung nicht über das Gewebe hinaus ausgebreitet hatte. Tatsächlich gibt es eine klar definierte Farbgrenze, die die Grenze der rot fluoreszierenden toten Zellen am Verankerungspunkt und der Mehrheit der grünen lebenden Zellen des Gewebekörpers markiert. In der Zwischenzeit wird die Bioreaktorkammer mit frischem Kulturmedium gefüllt.Sobald die Wunde eines Sehnenabschnitts trocken ist, wird sie mit Zelllösung wieder befeuchtet. Anschließend wird das befestigte Gewebe mit einer Pinzette in die Kammer überführt. Der Deckel wird geschlossen, um weitere Kontaminationen zu vermeiden.Die Positioniervorrichtung wird entfernt, sobald die Kammer im Bioreaktor installiert ist. Wir haben soeben demonstriert, wie eine Rattenschwanzsehne für biomechanische und mechanobiologische Untersuchungen vorbereitet wird. Mithilfe dieser Verfahren können wir eine Vielzahl von In-vitro-Studien an diesen Geweben durchführen.Beispielsweise wurde eine Studie zur Gewebedegeneration durch Anwendung einer Unterstimulation über einen Zeitraum von 10 Tagen durchgeführt. Täglich bewerteten wir das Gewebe, die mechanischen Eigenschaften und den zerstörungsfreien Spannungsrelaxationstest. Am Ende konnten wir eine Spannungsänderung beobachten.Wir haben Belege dafür vorgelegt, dass unsere strengen Isolierungs- und Aufbereitungsverfahren es ermöglichen, die Gewebeviabilität, -integrität und -funktion aufrechtzuerhalten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.

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Wir beschreiben ein in vivo Protokoll zur Messung der Dorsalflexion des Fußes nach Stimulation des Peroneusnervs und Kontraktion des vorderen cruralen Kompartiments der Hintergliedmaße der Ratte. Solche Messungen sind ein unverzichtbares translationales Werkzeug zur Bewertung der Skelettmuskelpathologie und der Tissue Engineering-Ansätze zur Muskelreparatur und -regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Bewertung der Heilung sehnen in Ratten, die mit allogenen Platelet rich Plasma (PRP) oder Kochsalzlösung injiziert wurde, nach dem entfernen Teil der Achillessehne. Der Fortschritt der Heilung der Sehne zu mehreren Zeitpunkten mit verschiedenen Arten von Analysen ausgewertet.

Auswirkungen der allogenen Platelet-Rich Plasma (PRP) auf den Heilungsprozess des geschnittenen Achillessehnen von Ratten: eine methodische Beschreibung

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

In diesem Artikel stellen wir ein In-vitro- und In-situ-Protokoll vor, um eine Sehnenlücke von bis zu 1,5 cm zu reparieren, indem sie mit künstlichem Kollagentransplantat gefüllt wird.  Dies wurde durch die Entwicklung einer modifizierten Nahttechnik erreicht, um die mechanische Belastung zu tragen, bis das Transplantat in das Wirtsgewebe reift.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Das Protokoll beschreibt effiziente und reproduzierbare zahnfeste biomechanische Prüfverfahren für murine Sehnen durch die Verwendung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Vorrichtungen.

Biomechanische Prüfung von Murine tendons

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von ganzem Ischiasnervengewebe der Ratte für die elektrophysiologische Stimulation ex vivo und die Aufzeichnung in einem umweltregulierten, durchbluteten Salzbad mit zwei Kompartimenten.

Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Wir stellen eine maßgeschneiderte experimentelle Plattform und ein Gewebekulturprotokoll vor, das fibroknorpelige Veränderungen nachbildet, die durch das Impingement der Achillessehneninsertion in murinen Hintergliedmaßenexplantaten mit anhaltender Zelllebensfähigkeit verursacht werden, und so ein Modell für die Erforschung der Mechanobiologie des Sehnenimpingements bietet.

Maus-Hintergliedmaßen-Explantatmodell zur Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnen-Impingements

Hier stellen wir ein assembloides Modellsystem vor, um die zelluläre Wechselwirkung zwischen dem tragenden Sehnenkerngewebe und einem extrinsischen Kompartiment mit Zellpopulationen nachzuahmen, die durch Krankheit und Verletzung aktiviert werden. Als wichtigen Anwendungsfall demonstrieren wir, wie das System eingesetzt werden kann, um die krankheitsrelevante Aktivierung von extrinsischen Endothelzellen zu untersuchen.

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Lernen Sie die Präparation von Ratten-Schwanzsehnen für biomechanische Studien. Diese Methode umfasst Extraktion, Querschnittsmessung und Bioreaktor-Beladung zur Gewährleistung von Gewebeviabilität.

Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies

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