Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Die Autoimmunhypophysitis ist gekennzeichnet durch eine Vergrößerung der Hirnanhangdrüse und einen Mangel an einem oder mehreren Hypophysenhormonen. Die ursächlichen Autoantigene sind noch unbekannt. Hier wird ein Protokoll zur Aufbereitung von Hypophysenproteinen der Maus für die Verwendung bei der Erforschung dieser Krankheit demonstriert.

Zunächst werden Hypophysen aus euthanasierten Mäusen isoliert. Die Hypophysen werden dann homogenisiert, um die Zellen mechanisch aufzubrechen und zytosolische Proteine freizusetzen. Das Homogene wird durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geklärt und durch farbmetrische Assays, BCA-Assays und deren Qualität durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese bewertet.

Zum Schluss wird das wässrige Proteinhomogenat mit einem öligen Adjuvans vermischt. Diese Mischung wird dann in Mäuse injiziert, um ein Mausmodell zu schaffen, das einer Autoimmunhypophysitis ähnelt. Wie im Begleitvideo gezeigt, wurden vier Techniken beschrieben, um Hypophysitis bei Versuchstieren zu induzieren.

Die in diesem Artikel vorgestellte Technik, d. h. die Injektion von Hypophysenproteinen, die ein Influenza-Adjuvans mischen, ist das älteste aus den 1960er Jahren. Weitere Ansätze waren die Injektion von löslichen Glykoproteinen aus dem Rötelnvirus im Jahr 1992, die stereotaktische Injektion eines Adenovirus direkt in die Hypophyse im Jahr 2002 und die Transplantation einer Hypophyse aus einem Rattenstamm unter die Nierenkapsel eines anderen Rattenstamms im Jahr 2010. Der Hauptvorteil des adjuvanten Ansatzes von Florence besteht darin, dass er heutzutage weniger invasiv, konsistenter und vor allem präziser bei der Auslösung einer Krankheit ist, die dem menschlichen Gegenstück sehr ähnlich ist.

Obwohl seit den 1960er Jahren über die ausländische adjuvante Technik berichtet wird, schnitt sie bei der Induktion einer Hypophysitis schlecht ab. Als ich mit meiner Doktorarbeit begann, konnte ich mit Hilfe des veröffentlichten ausländischen Adjuvans-Protokolls nur eine moderate Hypophysitis-Instanz und einen moderaten Schweregrad ermitteln. Die Dinge verbessern sich erheblich, wenn ich die Idee habe, die Menge an Pitu-Proteinen, die in der EM-Emotion enthalten sind, um das Zehnfache zu erhöhen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Pathogenese der Autoimmunhypophysitis geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Autoimmunerkrankungen verwendet werden, für die die Autoantigene noch identifiziert werden müssen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, vor allem mit dem letzten Schritt, der Vorbereitung des Randes, zu kämpfen, da dies manuelle Fähigkeiten, Zeit und Engagement erfordert. Eine visuelle Demonstration ist daher entscheidend, um zu verstehen, wie eine geeignete Emulsion hergestellt werden sollte.

Die Auswirkungen dieser Technik gehen über den Bereich der Autoimmunität hinaus. Das Wissen, wie das in-Antigen für die Immunisierung vorbereitet wird, kann auch für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern oder für die Erprobung neuer Impfstoffe verwendet werden. Diese Technik wird von S Zoo heroic Ura und Mayland al gato aus meinem Labor demonstriert.

Die Hypophyse der Maus ist eine zylindrisch geformte Drüse, die an der Schädelbasis in einer Vertiefung des Keilbeins sitzt, die Terica genannt wird. Die Drüse wird seitlich von den Trigeminusnerven und anterior vom Chiasma des Sehnervs begrenzt. Er besteht aus einem größeren Frontlappen und einem kleineren, mittleren und hinteren Lappen.

Um die Hypophyse zu isolieren, enthaupten Sie die euthanasierte Maus mit einer Schere und machen Sie dann parallele Schnitte von der Rückseite zur Vorderseite des Schädels. Hebe das Gehirn an und drehe es nach hinten, um die Hypophyse freizulegen, die als Zylinder im Kontext eines gleichschenkligen Dreiecks erscheint. Mit der Hypophyse als Basis, den Trigeminusnerven als Seiten und dem Chiasma opticum als Scheitelpunkt.

Umkreisen Sie die Drüse mit den Spitzen einer geschlossenen Pinzette, um die umgebende Meninga zu durchbrechen. Nehmen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Hypophyse aus der Zelle von Turca und legen Sie sie in ein Plastikröhrchen auf Trockeneis. Sammeln Sie für eine Zubereitung 300 Hypophysen der Maus.

Diese Sammlung erfordert etwa neun Personenstunden. Sobald die Entnahme abgeschlossen ist, lagern Sie die Hypophyse bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Legen Sie ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen in ein Eisbad.

In das Röhrchen werden 250 Mikroliter Homogenisierungspuffer gegeben. Für jeweils 100 Hypophysen, die kurz vor der Homogenisierung entnommen werden, fügen Sie die Hypophysen der Maus zum Puffer hinzu. Platzieren Sie als Nächstes die Spitze des Polytron-Homogenisators, einen Generator mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, am Boden des Falcon-Röhrchens, das die Maus-Hypophysen enthält, und homogenisieren Sie den Puffer bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden.

Bewegen Sie den Schlauch vorsichtig auf und ab, während Sie ihn auf Eis halten. Dann das Homogenat eine Minute lang auf Eis ruhen lassen. Wiederholen Sie die Homogenisierungs- und Kühlschritte noch zwei weitere Male.

Diese schonende Homogenisierung soll die Zellen aufbrechen und die Proteine freisetzen, ohne die Zellkerne zu zerbrechen. Das Homogenat bei niedriger Geschwindigkeit, etwa 1000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, sedimentiert, die Zellkerne, ungebrochenes Gewebe und unlösliche Materialien wie Bindegewebe und denaturierte Proteinkomplexe. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Übertragen Sie das SNA, das jetzt als postnukleares Sat oder PNS bezeichnet wird, in ein neues Falcon-Röhrenlager. Das PNS auf Eis zieht das Pellet mit dem gleichen Volumen an Homogenisierungspuffer zurück wie zuvor, homogenisiert und zentrifugiert wie zuvor. Nachdem Sie die beiden PNS-Proben gepoolt haben, wird die Lösung in zahlreiche Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Lagern Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Dieses Proteinpräparat ist bei minus 80 Grad Celsius stabil, verliert aber nach und nach an Wirksamkeit. Daher wird empfohlen, es innerhalb von sechs Monaten nach der Zubereitung zu verwenden.

Behalten Sie ein kleines Aliquot von PNS bei, um die Proteinausbeute und -konzentration durch den Biy-Säure-Assay zu bestimmen. Dann bestimmen Sie die Proteinqualität durch Gelelektrophorese von 300 Hypophysen der Maus, die durchschnittlich ein Gesamtgewicht von etwa 570 Milligramm haben. Erwarten Sie eine Ausbeute von 60 Milligramm Hypophysenproteinen oder ein Milligramm Protein pro 10 Milligramm Gewebe.

Die Proteinkonzentration liegt typischerweise bei etwa 40 Milligramm pro Milliliter. Das hier angegebene Beispiel gilt für die Immunisierung von 10 Mäusen. Planen Sie, jeder Maus 100 Mikroliter Emulsion zu injizieren, die ein Milligramm Hypophysenprotein enthält, wodurch zwei zusätzliche Mäuse für Materialverluste während der Vorbereitung hier werden 12 Milligramm Proteinemulsion hergestellt.

Beginnen Sie damit, die gefrorenen Proteinaliquote schnell aufzutauen, indem Sie sie in Ihren Händen erwärmen. Passen Sie die Proteinkonzentration mit PBS auf 20 Milligramm pro Milliliter an. Als nächstes ziehen Sie 600 Mikroliter des Hypophysenproteinextrakts, was 12 Milligramm entspricht, in eine 2,5 Milliliter Gas Tite Hamilton Spritze Resuspend, vollständiges FRONS-Adjuvans oder CFA, das fünf Milligramm pro Milliliter hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält, indem Sie es manuell schütteln.

Ziehen Sie dann 600 Mikroliter des CFA in eine weitere 2,5-Milliliter-Hamilton-Spritze. Befestigen Sie eine 22-Gauge-Mikroemulgiernadel an der mit CFA gefüllten Spritze. Schieben Sie den Kolben langsam so, dass die Nadel mit CFA gefüllt ist.

Befestigen Sie dann das andere Ende der Nadel an der anderen Spritze, die mit Hypophysenproteinextrakt gefüllt ist, und befestigen Sie sie. Vermeiden Sie es, Luftblasen in den Spritzen einzuschließen. Schieben Sie den Kolben der CFA-Spritze langsam vor, um die Ölkomponente so in den wässrigen Hypophysenextrakt zu drücken, dass nur eine kleine Menge gemischt wird.

Schieben Sie dann den Kolben der Hypophysenextraktspritze zurück in die CFA-Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Menge des gemischten Materials schrittweise zu erhöhen, bis der gesamte Inhalt vermischt ist. Dieses weißliche und gleichmäßig verteilte Material stellt die Wasser- und Ölemulsion dar.

Sobald die Emulsion gebildet ist, wiederholen Sie den vollständigen Hin- und Herzyklus mindestens 500 Mal nach dem letzten Zyklus, die Spritzen enthalten eine Eins-zu-Eins-Wasser- und Ölemulsion, bei der die Hypophysenproteinkonzentration jetzt 10 Milligramm pro Milliliter beträgt. Die Emulsion ist gebrauchsfertig, um die Qualität der Emulsion zu testen, indem man sie in ein Becherglas mit Wasser gibt. Wenn die Emulsion richtig vorbereitet ist, bleibt der Tropfen kompakt und fest auf der Oberfläche.

Wenn die Emulsion von schlechter Qualität ist, verteilt sie sich und spaltet sich in kleinere Tropfen. Die Emulsion wird am selben Tag ihrer Herstellung in SJL-Mäuse injiziert, um eine experimentelle Autoimmunhypophysitis zu induzieren. Dieses Protokoll wird im begleitenden jo von vertical ausführlich beschrieben.

Sobald die Pitu-Drüse entnommen und die Techniken gemeistert wurden, kann man die Proteinanweisung in einer Stunde durchführen, wobei man daran denkt, auf dem Fasten und auf Eis zu arbeiten. Während dieses Schritts, Während der Vorbereitung des Eintauchens, der etwa eine Stunde dauert. Denken Sie daran, in der Anfangsphase des Mischens nach der Entwicklung langsam und geduldig zu arbeiten.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Autoimmunität, um die Mechanismen zu erforschen, durch die autoreaktive Lymphozyten das Zielorgan erkennen und infiltrieren. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Proteinextrakt aus der Hypophyse der Maus herstellt und wie man ihn mit Morbus Crohn Aju mischt, um eine Emulsion herzustellen, die bereit ist, als Immunogen verwendet zu werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Spritzen und kompletten Grippekanten, die inaktivierte und trockene mikrobakterielle Tuberkulose enthalten, gefährlich sein kann, wenn Sie sich versehentlich durchstechen.

Verwenden Sie also immer G-Glows und entsorgen Sie die Nadeln ordnungsgemäß, während Sie diesen Vorgang durchführen.