Name: Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Ligand-lytische Peptide die protozoazide Aktivität gegen Termitendarm-Protozoen in vitro und in vivo testen. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie und Mikroinjektion für innovative Schädlingsbekämpfung.

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Wir danken Dr. Allison Richard, ehemaliger Direktor des LSU-Peptid-Anlage für das fluoreszierende Liganden Synthese, die Interdisciplinaray Center for Biotechnology Research, UF für den Liganden-lytische Peptid-Synthese und die Socolovsky Mikroskop-Anlage für den Zugang zur Fluoreszenz-Mikroskopen. Die Finanzierung wurde durch die SERDP Exploratory Development Program (SEED) des Department of Defense, Department of Energy and Environmental Protection Agency, der Biotechnologie AgCenter Interdisziplinäres Team Programm und den Bundesstaat Louisiana zur Verfügung gestellt.

Versuch 1: Extraktion von Termitendarm unter anaeroben Bedingungen Protozoen <ol><li> Verwenden Sie ein Fan-Box (Coy Laboratories) in einer Glove-Box ständig zirkulieren Luft durch ein Trockenmittel und Typ D Katalysator Stak-Paks gegen Feuchtigkeit und Sauerstoff zu kontrollieren und zu beseitigen unebene Temperaturen. Füllen Sie das Handschuhfach mit einem kontinuierlichen Strom von Stickstoff für 20 bis 30 min. Monitor-Sauerstoff mit einem Sauerstoff-Sensor (C-squared, Inc.) für 1 h Verwenden Sie Stickstoff zu erreichen und aufrechtzuerhalten anaeroben Bedingungen, wenn nötig. </li><li> Bereiten Trager U-Medien (Trager 1934) und pH-Wert auf 7,0. Sparge den Filter sterilisiert Medien im Handschuhfach mit einer Mischung von 2,5% Wasserstoff, 5% Kohlendioxid und 92,5% Stickstoff 1 h Sauerstoff zu entfernen. </li><li> Silanisieren allen Materialien einschließlich Objektträger, Mikrozentrifugenröhrchen, Pipetten, Gläser etc. in den Versuchen mit Sigmacote verwendet werden, um die Adsorption von Protozoen zu verhindern oder Peptide auf Oberflächen (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Da Termitendarm Protozoen strikt anaeroben Organismen sind, müssen sie nicht dem Sauerstoff ausgesetzt werden. Deshalb sind die folgenden Schritte unter anaeroben Bedingungen in einer Glove-Box (siehe 1.1) durchgeführt. Mit einer Pinzette tauchen den ganzen Körper eine Termite Arbeiter in 70% Ethanol und schwenken Sie für ca. 10 s auf Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Arbeiter aus dem Ethanol und lassen auf eine saubere Kimwipe für etwa 20 s. trocken Verwenden Sie eine sterile spitzen Pinzette an den Arbeitnehmer Bauch halten und sichern Sie sich die Spitze des Bauches mit einem anderen Paar Pinzette vorsichtig den Darm nach oben oder unten in einem Winkel von 45 Grad. Wenn der Darm an einer geraden Winkel und mit zu viel Kraft gezogen wird, ist es wahrscheinlich, auseinander zu brechen. Platz 10 guts in einem Tropfen von 100 ul Trager U Medien auf einen Objektträger. </li><li> Pierce den Mumm mit einem Paar sterile feinen Sezieren Sonden zur Freigabe der Protozoen und sanft Übertragung der Darminhalt mit 200 ul Pipette in ein 1 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul Trager U-Medien. Nach Berücksichtigung der Sedimentation Darmwand Fragmente (5 s), Transfer 900 ul des Überstandes in ein frisches Röhrchen. </li><li> Transfer 10 ul der Protozoen Kultur zu einer sigmacoted Objektträger und den Zustand der unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung Protozoen. </li><li> Bereiten Kontroll-Kulturen der aeroben Protozoen Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp., Euglena sp. Und Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) sowie einer Übernachtkultur von Escherichia coli in den Kulturmedien durch den Lieferanten zu empfehlen. </li></ol> Experiment 2: Add-Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt die Protozoen und die Bakterienkulturen zur Bindung an die Oberfläche Membranen und Zellwände Test Wir haben bereits Phagen-Display-Bibliotheken (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA) verwendet zu 19 Heptapeptid-Sequenzen, die Protozoen (Protokolle zur Verfügung zu http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf) binden zu identifizieren. Ein Ligand mit einer Peptidsequenz (ALNLTLH), die Ähnlichkeiten mit vermeintlichen Glykoproteine ​​aus der Trypanosoma brucei Membran bekannt zeigte, wurde synthetisiert und gekoppelt mit einem C-terminalen fluoreszierende Sonde (EDANS, 5 - ((2-Aminoethyl) amino) naphthalin-1-sulfonsäure Säure, lmax = 341 nm, λem = 471 nm) über Solid-State-Peptid-Synthese (SSP) mit der EDANS NovaTag Harz (EMD Biosciences). Hier zeigen wir, dass der Ligand an den Protozoen, die aus der Termitendarm und andere frei lebende Protozoen, aber nicht die Bakterien isoliert wurden, bindet. <ol><li> Kultur der Protozoen wie in Exp. 1. Fix Protozoen mit 10% Formaldehyd bei 4 ° C für 12 h </li><li> Centrifuge die Protozoen-Lösung (30 xg, 10 min), den Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit den festen zweimal in 1 ml Trager U Medien Protozoen. Re-suspend das Pellet in 1 ml Trager U-Medien. Auch fix andere Protozoen, und E. coli-Bakterien für die Kontrollen. </li><li> Inkubieren der festen Mikroorganismen für 1-2 h mit einer Lösung von synthetisierten Liganden gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff EDANS (hergestellt in Wasser) in einer Endkonzentration von 50 uM. Der Ligand löst in Wasser besser als Trager U-Medien. </li><li> Beachten Sie die Mikroorganismen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung bei einem Absorptionsmaximum bei 341 nm und einer Emission im blauen Bereich bei 471 nm. </li></ol> Versuch 3: Testen protozoacidal Aktivität des Liganden gekoppelt an eine lytische Peptid in vitro (Protozoen Kultur) Ein Konjugat des Liganden und die lytische Peptid Hecate (Mutwiri et al. 2000) war zuvor bei der LSU Protein-Fazilität synthetisiert. <ol><li> Silanisieren Materialien und bereiten Termitendarm Protozoen Kultur in der anaeroben Handschuh Box eins beschrieben in Exp. 1. </li><li> Bereiten Kulturen der aeroben Bekämpfung von Mikroorganismen (zB E. coli und die frei lebenden Einzeller Arten T. pyriformis). </li><li> In der anaeroben Umgebung des Handschuhfachs, Pipette 6 Aliquots von 198 ul von Protozoen Kultur in 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Add 2 ul einer 100 uM Lösung von Ligand-lytische Peptid auf die Hälfte der Aliquots (Endkonzentration 1 M) der Termitendarm Protozoen Kultur. Add 2 l Wasser, die andere Hälfte der Aliquots (Kontrollen). </li><li> Auf dem Labortisch, bereiten ähnliche Aliquots von E. coli und T. pyriformis mit 1 uM lytische Peptid-Ligand-lytische Peptid oder Wasser. </li><li> Nach 1 h Transfer 10 ul jeder Protozoen Kultur, um die Folien. Vergleichen Sie die Überlebensrate der behandelten Protozoen auf, dass der Kontrollen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. </li><li> Nach 1 h, Platte 100 ul von rd. 10 -4 Verdünnung der E. coli Kulturen auf BHI und bei 37 ° C über Nacht. Vergleichen Sie die Zahlen der koloniebildenden Einheiten auf den Tellern. </li></ol> Experiment 4: Die Injektion des Liganden gekoppelt mit einem fluoreszierenden Farbstoff in in der Termite Enddarm <ol><li> Pull Nadeln (Model GD-1, 1 X 900 mm) mit einem Narishige PC-10 Glasmikropipette Abzieher mit einem zweistufigen Wärme-Ebene (65 und 48) eine Spitze Größe von 20-30 &amp;mgr; m zu erhalten. Bestätigen Sie die Größe der Spitze durch die Messung unter dem Mikroskop mit einem Mikrometer. </li><li> Füllen Sie eine Nadel mit ca. 30 ul 50 uM von fluoreszenzmarkierten Liganden suspendiert in Wasser mit einer angehängten Spritze. Füllen Sie eine andere Nadel mit Wasser für das Steuerelement. Befestigen einer Mikropipette (0,5 ul Kapazität und 32 mm Länge, Drummond Scientific Company) mit einer Halterung in einem Mikromanipulator. Bringen Sie eine Nadel, um das Einspritzsystem Halter in einem zweiten Mikromanipulator. Set ersten Injektion Parameter auf ca. 1 s Impulsdauer und 10-12 psi Injektion. Schieben Sie die Nadel langsam in die Mikropipette und injizieren Sie die Lösung mit einem Pedal-angetriebenen Hochgeschwindigkeits-elektronisches Einspritzsystem mit einer Pulslänge Kontrolle angebracht, um eine kontrollierte Stickstoffgasstrom, was bedeutet, dass ein konstantes Volumen reproduzierbar injiziert wird gewährleistet. Nach der Injektion, entfernen Sie die Mikropipette und notieren Sie die Länge der injizierten Lösung mit einem Messschieber. Berechnen Sie das injizierte Volumen aus den bekannten Parametern der Mikropipette. Passen Sie den Druck von Stickstoffgas und die Pulslänge bis 0,3 ul-Lösung in einer einzigen Injektion zu vertreiben. </li><li> Squeeze Ende einer Termite Arbeiter Bauch mit weichen Pinzette keine Ausscheidungen in den Enddarm zu entfernen. Immobilisieren Termite Arbeiter durch Kühlen auf Eis für 5 min. </li><li> Machen Empfängern zur Aufnahme von Termiten Arbeiter durch Abschneiden 100 ul Pipettenspitzen mit einem Skalpell. Schneiden Sie die Spitze auf eine Länge von 10 bis 12 mm und verwenden Sie je nach Größe der Termiten. </li><li> Befestigen Sie den Empfänger an den Mikromanipulator. Einen Arbeiter auf einer Petrischale auf seiner dorsalen Seite und saugen den Arbeiter mit dem Kopf voran in den Hörer mit einem Stickstoff-Saugpumpe, so dass die Endstation der Arbeiter ragt aus dem Empfänger. </li><li> Halten Sie die Termiten in den Empfänger sorgfältig Voraus gefüllt Nadel mit dem Mikromanipulator, um es in Arbeiter Anus einzufügen. Inject 0,3 ul der Lösung (fluoreszenzmarkierten Liganden oder Wasser für Kontrollen). </li><li> Legen Sie die Arbeiter mit Liganden oder Wasser in separate Petrischalen injiziert mit feuchtem Filterpapier und halten sie bei 26 ± 2 ° C mit 78% RH </li><li> Auszurotten Mumm von der injizierten Termiten und sammeln die Protozoen nach 24 h, wie oben gezeigt in Exp. 1. Fix und beobachten Sie die Protozoen wie in Exp gezeigt. 2. </li></ol> Experiment 5: Testen protozoacidal Aktivität des Liganden gekoppelt an eine lytische Peptid in vivo (Injektion in Termiten Enddarm) <ol><li> Silanisieren Materialien wie in Exp. 1. </li><li> Bereiten Sie eine 500 uM Lösung des Liganden-lytische Peptid in Wasser. </li><li> Führen Sie die Schritte 3,1) durch 3,4) auf Glas Nadeln, Empfänger und Termiten Arbeiter vorzubereiten. </li><li> Nach dem Verfahren in 3.5 beschrieben) injizieren 0,3 ul der Ligand-lytische Peptid-Lösung (Behandlung) oder Wasser (Kontrolle) in den Enddarm von 20 Termite Arbeiter. </li><li> Halten Termiten für 24 h, auszurotten guts von mehreren Arbeitnehmern und beobachten Darminhalt unter dem Mikroskop wie in 3.6 beschrieben). und 3,7). </li><li> Sobald ein Tod in der Termitendarm Protozoen bestätigt wird, halten verbleibenden behandelten Termiten und steuert in Petrischalen mit feuchtem Filterpapier und beobachten Sterblichkeit täglich. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Experiment 1: In der Regel Vorderdarm, Mitteldarm und Enddarm sind in einem Stück erhalten, wenn das Verfahren korrekt ist (Abbildung 1a) gefolgt. Die Protozoen wohnen in hoher Dichte in der anaeroben Teile der Enddarm und kann durch Einstechen in die Enddarm mit einer Pinzette (Abbildung 1b 1 &amp; 2) freigesetzt werden. Die größte protozoa Arten im Darm von der Formosa unterirdischen Termite ist der spindelförmige P. grassii, die 200-300 mu m lang und 150 &amp;mgr; m breit ist und mit dem bloßen Auge gesehen werden. Die zweitgrößte Arten ist die birnenförmige H. hartmanni (50 bis 140 mu m lang und 30-80 &amp;mgr; m breit). Die kleinste Art ist das kegelförmige S. leidyi (15-50 &amp;mgr; m lang und 8-30 &amp;mgr; m breit;. Lai et al 1983). Die Protozoen Arten sind in Abbildung 2 dargestellt. Unter optimalen Kulturbedingungen die drei Arten von Protozoen aus dem Darm von Termiten Formosan unterirdischen isoliert bleiben lebendig und gesund für mindestens 72 h in anaeroben Trager U-Medien (Abbildung 3a). Allerdings, wenn Kultur nicht optimal sind Protozoen schnell sterben. Wenn es Sauerstoff Rückstände in den Medien sind, wird die Bewegung der Protozoen sofort einzustellen. Wenn osmotische Druck ist zu hoch oder Membranintegrität der Oberfläche Membran der Protozoen wird wölben und die Zellen Bruch (Abb. 3b) gefährdet ist. Wenn osmotische Druck ist zu niedrig oder Membranen sind gefährdet, wird Protozoen schrumpfen und schrumpfen (Abbildung 3c). Experiment 2: Wir haben bestätigt, dass der Ligand an eine fluoreszierende Sonde gebunden, alle drei Arten von aus dem Enddarm von Formosa unterirdischen Termiten in nachweisbaren Dichten Protozoen gekoppelt. Ligandenbindung erfolgt auf der gesamten Zelloberfläche (Abbildung 4). Bindungsstellen sind im vorderen Bereich des auf der axostyle (ein Blatt von Mikrotubuli) und Kern in P. Protozoen konzentriert grassii. Wir beobachteten einige lückenhaft Autofluoreszenz von Holzspänen durch die Protozoen aufgenommen. Allerdings ist Autofluoreszenz in der Regel leicht von spezifischen Bindung des Liganden zu erkennen, da es keine Autofluoreszenz der Oberfläche, die axostyle und den Zellkern (Abbildung 4). Wir haben auch erkannt Fluoreszenz in allen getesteten frei lebenden aeroben Protozoen Spezies (Abbildung 5), was bedeutet, dass der Ligand Strukturen allgemein, um Protozoen bindet schlägt. Es wurde jedoch kein Ligandenbindung für E. beobachtet coli. Versuch 3: Ein uM von Ligand-lytische Peptid tötete alle drei Arten von aus dem Darm von Formosa unterirdischen Termite Arbeitnehmer und der frei lebenden T. Protozoen pyriformis in vitro in weniger als 10 min, während Kontrollen am Leben geblieben. Abbildung 6 zeigt den fortschreitenden Verlust der Membran-Integrität der Termitendarm Protozoen behandelt mit Ligand-lytische Peptid. Membranen Ausbuchtung und Bruch, Protozoen schrumpfen und sterben. Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der E. beobachtet coli-Kolonien zwischen den Behandlungen von Ligand-lytische Peptid und Wasser. Lytische Peptid ohne Ligand, aber die Zahl der E. coli-Kolonien erheblich (Abbildung 7). Dies deutet darauf hin, dass die Bindung des Liganden zu einem gewissen Grad schützt nicht Zielmikroorganismen von Lyse. Experiment 4: Wenn 0,3 ul 50 uM der fluoreszenzmarkierten Liganden in den Enddarm von Termiten Arbeiter injiziert wurde, die Bindung an P. grassii, S. leidyi und H. hartmanni wurde über Fluoreszenzmikroskopie ähnlich Exp bestätigt. 2 (Abbildung 4). Termite Darmgewebe nicht fluoreszieren. Experiment 5: Injektion von 0,3 ul 500 uM Ligand-lytische Peptid tötete alle drei Arten von im Darm von Termiten Formosan unterirdischen innerhalb von 24h Protozoen. Termiten starben innerhalb von 10 Tagen nach Verlust ihrer symbiotischen Protozoen. Zuvor injiziert Husseneder und Collier (2009) die gleiche Konzentration an lytische Peptid in Termiten Mut. Ohne den beigefügten Liganden, dauerte es mehr Zeit, bis die in den Darm (72 h) Protozoen und die Termiten tot waren (sechs Wochen). Dies deutet darauf hin, dass der Ligand protozoacidal Effizienz der lytische Peptide, wahrscheinlich durch die Bindung des lytischen Peptiden an der Protozoen erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. a: Formosan unterirdischen Termitendarm auf einer Folie, die die wichtigsten Abschnitte des Darms (Vorder-, Mittel-, Enddarm); b 1 &amp; 2: Enddarm ist mit einer Pinzette durchbohrte den Darminhalt mit den Protozoen freizugeben. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die drei Arten von Flagellaten Protozoen im Enddarm der Formosa-Termite unterirdischen gefunden: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni und c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Protozoen in Kultur, Protozoen a) Gesunde, b) Protozoen mit prall gefüllten Membranen, c) vertrocknet Protozoen. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Bestätigung der Bindung des Liganden an einen fluoreszierenden Sonde gut Termiten gekoppeltProtozoen (von oben nach unten: P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi), behandelt mit fluoreszenzmarkierten Liganden und unbehandelten Kontrollen (Es werden Autofluoreszenz). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Ligandenbindung an frei lebenden aeroben Protozoen, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, und d) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Die Behandlung der mit a) Wasser (Kontrolle) und b) 1 nM Ligand-lytische Peptid Protozoen. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. E. coli-Kolonien auf den Platten (10 -4 Verdünnung): a) mit Wasser (Kontrolle), b) behandelt Behandelt mit 1 uM Ligand-lytische Peptid, c) Behandelt mit 1 uM lytische Peptid.

<ol><li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+%CE%B2CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li>
<li>Husseneder, C., Collier, R. E. Paratransgenesis for termite control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusseneder%2C+C+%22Insect+Symbiosis%22">Insect Symbiosis</a>. Bourtzis, K., Miller, T. A. 3, CRC Press LLC. Boca Raton, Florida. Volume 3 361-376 (2009).</li>
<li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+engineered+bacteria+%28Escherichia+coli%29+to+monitor+ingestion%2C+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li>
<li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li>
<li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li>
<li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+%28Isoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Haw.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li>
<li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li>
<li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide%2C+d-Hecate%2C+on+Trichomonads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li>
<li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate%2C+Trichomonas+termopsidis%2C+and+of+certain+other+termite+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li>
</ol>

Ligand-lytische Peptide wurden erfolgreich verwendet, um effektiv anzugreifen und zu zerstören Krebszellen (Hänsel und Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basierend auf diesem Konzept entwickelten wir ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche bindet Protozoen im Darm von Formosa unterirdischen Termiten und gekoppelt an einen lytische Peptid mit dem Ziel, diese zu verpflichten Zellulose-Verdauung Symbionten im Darm von Termiten zu zerstören, um Termiten zu erreichen Steuerung (Husseneder und Collier 2009)...

<table><tbody><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td></td></tr><tr><td>EDANS</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anaerober Handschuhkasten</td><td>Coy Laboratories, Inc.</td><td>Spezialanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Intellus Umweltregler</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I36NL</td><td></td></tr><tr><td>PC-10-Glas-Mikropipettenzieher</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Glasnadeln (Modell GD-1, 1 × 900 mm)</td><td>Narishige International</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Leitz-Mikromanipulatoren</td><td>Vermont Optechs, Inc.</td><td>ACS01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokappen</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0005</td><td></td></tr><tr><td>LEICA-Fluoreszenzbildgebungssystem</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMRxA2</td><td></td></tr><tr><td>LEICA-Diskettiermikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>LEICA-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Olympus-Diskettiermikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

testen protozoacidal aktivität von ligand-lytische peptide gegen termite gut protozoen in-vitro- (protozoen kultur) und in vivo (mikroinjektion in termite enddarm)

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

Wir entwickeln einen neuartigen Ansatz zur unterirdischen Termiten, die zu verringerten Vertrauen auf den Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln führen würde. Subterranean Termiten sind abhängig von Protozoen in der hindguts der Arbeitnehmer auf effizient verdauen Holz. Lytische Peptide haben gezeigt, dass eine Vielzahl von einzellige Parasiten (Mutwiri et al. 2000) zu töten, und auch im Darm von der Formosa unterirdischen Termite, Coptotermes formosanus (Husseneder und Collier 2009) Protozoen. Lytische Peptide sind Teil des unspezifischen Immunsystems von Eukaryoten, und zerstören die Membranen von Mikroorganismen (Leuschner und Hänsel 2004). Die meisten lytische Peptide sind nicht geeignet, höheren Eukaryonten schaden, weil sie keinen Einfluss auf die elektrisch neutralen Cholesterin-haltigen Zellmembranen von höheren Eukaryonten (Javadpour et al. 1996). Lytische Peptid Aktion kann auf bestimmte Zelltypen durch die Zugabe eines Liganden ausgerichtet sein. Zum Beispiel berichtete Hansel et al. (2007), dass lytischen Peptiden konjugiert mit Krebs Zellmembran-Rezeptor-Liganden verwendet werden könnten, um Brustkrebszellen zerstört werden, während lytische Peptide allein oder konjugiert mit nicht-spezifische Peptide wurden nicht wirksam. Lytische Peptide wurden auch konjugiert menschlichen Hormonen, die an Rezeptoren binden auf Tumorzellen für die gezielte Zerstörung von Prostata-und Hodenkrebs-Zellen (Leuschner und Hänsel 2004). In diesem Artikel präsentieren wir Techniken verwendet, um die protozoacidal Aktivität eines lytischen Peptids (Hecate) gekoppelt an ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche der Membran aus dem Darm der Formosa-Termite unterirdischen Protozoen bindet demonstrieren. Diese Techniken umfassen Ausrottung der Darm von Termiten Arbeiter, Protozoen anaerobe Kultur des Darms (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), mikroskopische Bestätigung, dass der Ligand mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, um den Termitendarm bindet Protozoen und andere frei lebende Protozoen, aber nicht um Bakterien oder Darmgewebe. Wir zeigen auch, dass der gleiche Wirkstoff gekoppelt an eine lytische Peptid effizient tötet Termitendarm in vitro (Protozoen Kultur) und in vivo (Mikroinjektion in Enddarm der Arbeitnehmer) Protozoen, ist aber weniger bacteriacidal als die lytische Peptid allein. Der Verlust der Protozoen führt zum Tod der Termiten in weniger als zwei Wochen. In Zukunft werden wir genetisch Ingenieur Mikroorganismen, die in der Termite Enddarm und die Ausbreitung durch eine Termitenkolonie als &quot;Trojanische Pferde&quot; zu Ligand-lytische Peptide, die in der Termitendarm Protozoen zu töten und anschließend zu töten die Termiten in der Kolonie würde ausdrücken können überleben . Ligand-lytische Peptide auch nützlich sein könnte für die Entwicklung von Medikamenten gegen einzellige Parasiten.

Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese Protozoen<em&gt; In-vitro-</em&gt; (Anaerobe Protozoen Kultur) und<em&gt; In vivo</em&gt; (Injektion in den Termiten Enddarm).

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

Wir entwickeln einen neuartigen Ansatz zur Bekämpfung von unterirdischen Termiten, der zu einer verringerten Abhängigkeit vom Einsatz chemischer Pestizide führen würde. Unterirdische ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nachzuweisen, dass ein synthetisierter Ligand spezifisch an die celluloseverdauenden Protozoen im Darm von Rattenbautermieten (Formosan subterranean termites) bindet und dass der mit einem lytischen Peptid gekoppelte Ligand diese Protozoen in vitro in anaerober Protozoenkultur sowie in vivo durch Injektion in den Hinterdarm der Termiten abtötet. Dies wird erreicht, indem zunächst unter anaeroben Bedingungen die Protozoen aus dem Darm arbeitsteiliger Termiten extrahiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bindung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Liganden an die Darmprotozoen der Termiten in vitro zu bestätigen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, nachzuweisen, dass das Ligand-gekoppelte lytische Peptid Termiten-Darmprotozoen in vitro abtötet. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Injektion eines fluoreszenzmarkierten Liganden und eines Ligand-gekoppelten lytischen Peptids in den Hinterdarm der Termite, um die Bindung an und die Zerstörung der Darmprotozoen in vivo zu bestätigen. Mithilfe von Protozoen-Kulturinjektionen in den Hinterdarm der Termite und der Fluoreszenzmikroskopie zeigen wir, dass ein an ein lytisches Peptid gekoppelter Ligand an die Darmprotozoen bindet und diese effizient in vitro und in vivo abtötet.Die Bindung des Liganden an das lytische Peptid erhöhte die Toxizität gegenüber Protozoen im Vergleich zum alleinigen lytischen Peptid. Obwohl die Toxizität gegenüber Nicht-Zielorganismen wie E. coli vermindert wurde, wahrscheinlich weil der Ligand nicht an die bakterielle Zellmembran bindet, führt der Verlust der Protozoen zum Absterben der Termiten innerhalb von weniger als zwei Wochen. Die vorgestellte Technik, LIG-colitische Peptide zur Abtötung der symbiotischen Protozoen im Darm von Untergrundtermiten einzusetzen, ist Teil der Bemühungen, alternative Methoden zur Bekämpfung von Termiten zu entwickeln.Da Termiten weniger auf Chemikalien angewiesen sind, sterben sie, wenn keine Symbionten in ihrem Darm vorhanden sind. Wir isolieren Protozoen aus dem Termitendarm, um zu zeigen, dass das Ligand an die Protozoen bindet und das lytische Ligand-Peptid die Protozoen abtötet. Holzpartikel innerhalb der Protozoen zeigen Autofluoreszenz. Daher ist es wichtig, die Ergebnisse von Protozoen, die mit fluoreszierendem Liganden behandelt wurden, mit unbehandelten Protozoen zu vergleichen.Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, injizieren wir Peptide direkt in den Hinterdarm, da die Proteasen im Mitteldarm und der Vordarm sie verdauen würden, wenn die Peptide den Termiten verfüttert würden. Mithilfe von Phage-Display-Bibliotheken von New England Bio Labs identifizierten wir 19 Hep-Peptidsequenzen, die an Protozoen binden. Wir wählten einen der Liganden mit einer Peptidsequenz aus, die Ähnlichkeiten mit hypothetischen Glykoproteinen aufweist, wie sie von der Trypanosoma brucei-Membran bekannt sind.Nach der Peptidsynthese koppelten wir das synthetisierte Peptid über eine Festphasen-Peptidsynthese an eine C-terminale fluoreszierende Sondierungsmarke unter Verwendung des E-D-A-N-S Novatech Harzes, um die lytischen Eigenschaften der Peptidkonjugate zu untersuchen. In diesem Verfahren verwenden wir ein Konjugat aus dem synthetisierten Liganden und dem zuvor am LSU-Proteinlabor einen Tag vor der Experimentierung hergestellten lytischen Peptid ate. Verwenden Sie Sigma Coat, um alle verwendeten Materialien zu passivieren und die Absorption von Protozoen oder Peptiden an Oberflächen zu verhindern.Tragen Sie eine gleichmäßige Schicht auf und lassen Sie sie über Nacht trocknen, bevor Sie sie am folgenden Tag verwenden. Bereiten Sie in einer Handschuhbox einen Lüfterkasten vor, um die Luft bei Raumtemperatur kontinuierlich durch Trockenmittel- und Typ-D-Katalysator-Stapelmodule zu zirkulieren, um die Feuchtigkeits- und Sauerstoffkonzentration über eine Stunde lang zu senken. Füllen Sie die Handschuhbox mit einem kontinuierlichen Strom von Stickstoff für 20 bis 30 Minuten und verwenden Sie bei Bedarf zusätzlichen Stickstoff, um die anaeroben Bedingungen aufrechtzuerhalten.Bereiten Sie als Nächstes Traeger-U-Medien vor und stellen Sie den pH-Wert auf sieben ein. Belüften Sie das filtersterilisierte Medium über eine 200-Mikroliter-Spitze, die an einem Schlauch befestigt ist, mit einer Mischung aus 2,5 % Wasserstoff, 5 % Kohlendioxid und 92,5 % Stickstoff für eine Stunde, um Sauerstoffrückstände in der Handschuhbox zu entfernen. Sobald die Materialien bereit sind, entnehmen Sie mit einer Pinzette einen Termitenarbeiter aus einer Petrischale und tauchen Sie den gesamten Körper vorsichtig in einen Becher, der mit 70 % Ethanol gefüllt ist, wobei Sie die Termite mit der Pinzette etwa 10 Sekunden lang halten. Um Oberflächenkontaminationen zu entfernen, nehmen Sie den Arbeiter aus dem Ethanol heraus und lassen Sie ihn etwa 20 Sekunden lang auf einem sauberen Kim-Tuch trocknen.In der Handschuhbox bereiten Sie einen silanisierten Objektträger mit 100 Mikrolitern Trager-U-Medium zur Sammlung des Termitendarms und ein Gefäß mit 900 Mikrolitern Trager-U-Medium zur Sammlung der Protozoen vor. Verwenden Sie dann ein Stereomikroskop und ein Paar sterile feine Pinzetten, um den Hinterleib der Arbeitertermiten zu halten, und greifen Sie mit einem weiteren Paar Pinzetten die Spitze des Hinterleibs, um den Darm vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad nach oben oder unten herauszuziehen. Versuchen Sie, Mittel- und Hinterdarm jeweils als ein Stück zu gewinnen. Legen Sie die entnommenen Därme in einen Tropfen von 100 Mikrolitern Trager-U-Medium auf einen Objektträger.Schieben Sie als Nächstes die hinteren Därme mit einem Paar steriler feiner Präparationsbestecke durch, um die Protozoen freizusetzen, und übertragen Sie vorsichtig den Darminhalt mit einer 200-Mikroliter-Pipette in ein 1-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 900 Mikroliter Traeger-Medium enthält. Lassen Sie fünf Sekunden zur Sedimentation von Darmwandfragmenten zu und übertragen Sie 900 Mikroliter des Überstandes in ein frisches Röhrchen. Übertragen Sie zehn Mikroliter der Protozoenkultur auf ein sigma-beschichtetes Mikroskop. Verschieben und überprüfen Sie den Zustand der Protozoen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergr&ouml;&szlig;erung. Bereiten Sie Kontrollkulturen aerob lebender Protozoen, Tetra piriformis, Am&ouml;ben, Ug, Gleaner und Paramecien sowie eine &Uuml;bernachtkultur von E. coli im Kulturmedium gem&auml;&szlig; den Empfehlungen des Herstellers unmittelbar nach dem Erhalt der Protozoen vor, fixieren Sie die Protozoen aus dem Termitendarm sowie andere Protozoenkontrollen und E. coli mit 10 % Formaldehyd bei vier Grad Celsius f&uuml;r 12 Stunden. Zentrifugieren Sie danach die Protozoenl&ouml;sung bei 30-facher Erdbeschleunigung f&uuml;r 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, das die fixierten Protozoen enthält, zweimal mit einem Milliliter Trager-U-Medien. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Traeger-Medien. Inkubieren Sie die fixierten Mikroorganismen ein bis zwei Stunden lang mit 100 Mikrolitern einer Lösung eines synthetisierten Liganden, der an den fluoreszierenden Farbstoff E-D-A-N-S gekoppelt ist, unter Verwendung einer Endkonzentration von 50 Mikromolar Ligand, gelöst in Wasser. Untersuchen Sie die mit Liganden behandelten Mikroorganismen sowie unbehandelte Kontrollen unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung mit einer Absorptionsmaximum bei 341 Nanometern und einer Emission im blauen Bereich bei 471 Nanometern.Um die Wirkung des ligandengekoppelten lytischen Peptids zu bewerten, pipettieren Sie sechs Aliquots à 198 Mikroliter Protozoenkultur, die wie in Abschnitt drei beschrieben hergestellt wurde, in 0,5-Milliliter-Einwegröhrchen. Geben Sie zwei Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung eines ligandenhaltigen lytischen Peptids zu der einen Hälfte der Aliquots der Termitendarm-Protozoenkultur. Als Kontrolle geben Sie zwei Mikroliter sterilem Wasser zu der anderen Hälfte der Aliquots, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erreichen.Nach einer Stunde 10 Mikroliter jeder Protozoen-Kultur auf einen Objektträger überführen. Vergleichen Sie die Überlebensfähigkeit der mit Ligand konjugierten lytischen Peptid behandelten Protozoen mit der der Kontrollen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Ziehen Sie Nadeln mit einem NGI PC 10-Mikropipettenzieher mit zweistufiger Heizstufe. Um eine Spitzengröße von 20 bis 30 Mikrometern zu erhalten, überprüfen Sie die Spitzengröße, indem Sie sie unter dem Mikroskop messen.Mit einem Mikrometer füllen Sie eine Nadel mit etwa 30 Mikrolitern eines 50 Mikromolar fluoreszenzmarkierten Liganden, der in Wasser suspendiert ist. Füllen Sie mit einer Anschluss-Spritze eine weitere Nadel mit Wasser als Kontrolle. Befestigen Sie eine Mikropipette an einem Halter und einem Mikromanipulator. Befestigen Sie eine Nadel am Halter des Injektionssystems in einem zweiten Mikromanipulator.Stellen Sie die anfänglichen Injektionsparameter auf eine Impulsdauer von etwa einer Sekunde und eine Injektion von 10 bis 12 PSI ein. Bewegen Sie dann die Nadel langsam in die Mikropipette hinein und injizieren Sie die Lösung mithilfe eines Fußpedals nach der Injektion. Entfernen Sie die Mikropipette und notieren Sie die Länge der injizierten Lösung.Unter Verwendung eines Messschiebers berechnen Sie das injizierte Volumen anhand der bekannten Parameter der Mikropipette und stellen Sie den Druck und die Impulsdauer so ein, dass 0,3 Mikroliter der Lösung ausgestoßen werden. Bereiten Sie anschließend 20 Termiten pro Behandlungsgruppe für die Injektion vor. Drücken Sie dazu zunächst vorsichtig mit einer weichen Pinzette das Ende des Abdomens zusammen, um eventuelle Ausscheidungen aus dem Rektum zu entfernen.Dann immobilisieren Sie die Termitenarbeiter, indem Sie sie fünf Minuten lang auf Eis kühlen, während die Termiten sich immobilisieren. Stellen Sie Empfänger zum Halten der Termitenarbeiter her, indem Sie die Spitzen von 100-Mikroliter-Pipettenspitzen abschneiden. Schneiden Sie die Spitze mit einer Rasierklinge auf eine Länge von 10 bis 12 Millimetern zu, je nach Größe der Termiten, und platzieren Sie sie in ein Gefäß.Befestigen Sie mit einem Schraubverschluss den Empfänger am Mikromanipulator. Legen Sie eine Arbeiterin in einer Petrischale auf die dorsale Seite und saugen Sie die Arbeiterin kopfvoran mithilfe einer Stickstoff-Saugpumpe in den Empfänger ein, sodass das Ende der Arbeiterin aus dem Empfänger herausragt. Halten Sie die Termiten im Empfänger vorsichtig und führen Sie die gefüllte Nadel mit Hilfe des Mikromanipulators so weit vor, dass sie in den Anus der Arbeiterin eingeführt wird. Injizieren Sie 0,3 Mikroliter des fluoreszenzmarkierten Liganden oder der Wasser-Kontrolle.Stellen Sie die Arbeiterinnen, die mit Ligand oder Wasser injiziert wurden, in separate Petrischalen mit feuchtem Filterpapier und bewahren Sie sie über Nacht bei 26 Grad Celsius und 78 % relativer Luftfeuchtigkeit auf. Nach 24 Stunden entnehmen Sie die Därme der injizierten Termiten und sammeln die Protozoen, wie zuvor gezeigt. Beobachten Sie die Ligandenbindung in Protozoen aus den injizierten Termiten mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie, um die lytischen Eigenschaften ligandengekoppelter lytischer Peptide in lebenden Termiten zu bewerten.Bereiten Sie Injektionsmaterialien, Geräte und Termiten wie zuvor für Injektionen beschrieben vor und injizieren Sie 0,3 Mikroliter einer 500 Mikromolar-Ligand-Lytisches-Peptid-Lösung oder als Kontrolle Wasser in den Hinterdarm von 20 Arbeitertermiten. Nach 24 Stunden entnehmen Sie zusätzlich die Därme mehrerer Arbeiter und untersuchen den Darminhalt unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung, sobald der Tod aller Protozoen im behandelten Termitendarm bestätigt ist. Bewahren Sie die verbleibenden behandelten Termiten und Kontrolltiere in Petrischalen mit feuchtem Filterpapier auf und beobachten Sie die Mortalität täglich. Wir bestätigen, dass der mit einer fluoreszierenden Sonde gekoppelte Ligand an alle drei Protozoenarten, P. grassi, H. harpago und S. leidyi, bindet.Bei unbestimmbaren Dichten im Hinterdarm von vier mossonischen unterirdischen Termiten erfolgt die Ligandenbindung auf der gesamten Zelloberfläche und konzentriert sich im vorderen Bereich der Protozoen entlang der Achse, wo sich noch ein Mikrotubuli-Blatt und der Kern MP-Gras-Auge befinden. Wir detektierten außerdem Fluoreszenz in allen getesteten frei lebenden aeroben Protozoenarten, was darauf hindeutet, dass der Ligand an Strukturen bindet, die generisch für Protozoen sind. Während keine Ligandenbindung für E. coli beobachtet wurde, tötete ein Mikromolar des lytischen Ligandenpeptids alle drei Protozoenarten aus dem Darm von Omo- und unterirdischen Termitenarbeitern sowie auch die frei lebende T. piriformis in vitro in weniger als 10 Minuten ab, während die Kontrollen am Leben blieben.Dieses Bild zeigt den fortschreitenden Verlust der Membranintegrität der Darmprotozoen der Termiten nach Behandlung mit ligandengebundenem lytischem Peptid. Bei den Behandlungen mit ligandenhaltigem lytischem Peptid und Wasser wurde kein Unterschied in der Anzahl der E. coli-Kolonien beobachtet; jedoch verringerte lytisches Peptid ohne Ligand die Anzahl der E. coli-Kolonien erheblich. Dies legt nahe, dass die Anheftung eines Liganden an das lytische Peptid in gewissem Maße nicht-zielgerichtete Mikroorganismen vor der Lyse schützt. Die Injektion von 0,3 µL einer 500 µM-Lösung ligandenhaltigen lytischen Peptids tötete innerhalb von 24 Stunden alle drei Arten von Protozoen im Darm von Holzschädlingen und Untergrundtermiten ab, und die Termiten starben nach 10 Tagen, wenn ligandengekoppeltes lytisches Peptid injiziert wurde.Protozoen und Termiten starben dreimal so schnell wie bei Injektion von nicht ligandkonjugierten lytischen Peptiden, wie in Husen und Colia 2009 gezeigt, was darauf hindeutet, dass das Ligand die zydale Effizienz der lytischen Peptide gegenüber Protozoen unter optimalen Kulturbedingungen erhöht. Alle drei Protozoen-Arten, die aus dem Darm von Omo subterranen Termiten gewonnen wurden, sollten mindestens drei Tage lang am Leben und gesund bleiben.Wenn jedoch Sauerstoffrückstände im Medium verbleiben, stoppt die Bewegung der Protozoen unmittelbar. Wenn ein ungeeignetes Medium verwendet wird und der osmotische Druck in den Zellen zu hoch wird, wölben sich die Membranen der Protozoen aus und die Protozoen platzen. Wenn der osmotische Druck in den Zellen zu niedrig ist oder die Membranen geschädigt sind, schrumpfen die Protozoen und ziehen sich zusammen. Die Fixierung von Protozoen erleichtert den Nachweis der Bindung eines fluoreszentmarkierten Liganden an die Protozoen.Es ist schwierig, Fluoreszenz zu detektieren und von der Autofluoreszenz der Holzpartikel zu unterscheiden, wenn sich die Protozoen frei bewegen. Sobald diese Technik beherrscht ist, können mit Hilfe eines Assistenten etwa 30 Termiten pro Stunde injiziert werden. Obwohl das Ligand-Colitic-Peptid zur Abtötung von Protosomen-Symbionten im Darm von Untergrundtermiten und somit zur Bekämpfung von Termiten entwickelt wurde, könnte es auch nützlich sein, um Wirkstoffe gegen Protosomen-Parasiten wie Slash-Mania, Ponoma, Te und Odium zu entwickeln, die viele Krankheiten beim Menschen verursachen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Protozoen, die aus dem Termitendarm gewonnen wurden, in Kultur erhält und pflegt, wie man die spezifische Bindung eines Liganden an Protozoen mittels Fluoreszenzmikroskopie nachweist, wie man die proto-toxische Wirkung eines Liganden-Colytischen Peptids in vitro demonstriert. Und nicht zuletzt, wie man Peptide in den Tumorzell-Darm für die in-vivo-Bestätigung injiziert.

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Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm) (Video) | JoVE Journal

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

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