Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nachzuweisen, dass ein synthetisierter Ligand spezifisch an die celluloseverdauenden Protozoen im Darm von Reticulitermes flavipes unterirdischen Termiten bindet und dass der mit einem lytischen Peptid gekoppelte Ligand diese Protozoen in vitro in anaerober Protozoenkultur sowie in vivo durch Injektion in den Hinterdarm der Termiten abtötet. Dies wird erreicht, indem zunächst unter anaeroben Bedingungen die Protozoen aus dem Darm arbeitsteiliger Termiten extrahiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bindung eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Liganden an die Darmprotozoen der Termiten in vitro zu bestätigen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, zu zeigen, dass ein Ligand-gekoppeltes lytisches Peptid Termitendarm-Protozoen in vitro abtötet. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Injektion eines fluoreszenzmarkierten Liganden und eines Ligand-gekoppelten lytischen Peptids in den Hinterdarm der Termite, um die Bindung an und die Zerstörung der Darmprotozoen in vivo zu bestätigen. Mithilfe von Protozoen-Kulturinjektionen in den Hinterdarm der Termite und der Fluoreszenzmikroskopie zeigen wir, dass ein an ein lytisches Peptid gekoppelter Ligand an die Protozoen bindet und diese effizient in vitro und in vivo abtötet.

Die Bindung des Liganden an das lytische Peptid erhöhte die Toxizität gegenüber Protozoen im Vergleich zum alleinigen lytischen Peptid. Obwohl die Toxizität gegenüber Nicht-Zielorganismen wie E. coli verringert wurde, wahrscheinlich weil der Ligand nicht an die bakterielle Zellmembran bindet, führt der Verlust der Protozoen zum Absterben der Termiten innerhalb von weniger als zwei Wochen. Die vorgestellte Technik, LIG-colitische Peptide zur Abtötung der symbiotischen Protozoen im Darm von Untergrundtermiten einzusetzen, ist Teil der Bemühungen, alternative Methoden zur Bekämpfung von Termiten zu entwickeln.

Da Termiten ohne die Symbionten in ihrem Darm weniger von Chemikalien abhängig sind, sterben sie ab. Wir isolieren Protozoen aus dem Termitendarm, um zu zeigen, dass das Ligand an die Protozoen bindet und dass das lytische Ligand-Peptid die Protozoen abtötet. Holzpartikel innerhalb der Protozoen weisen Autofluoreszenz auf. Daher ist es wichtig, die Ergebnisse von Protozoen, die mit fluoreszierendem Liganden behandelt wurden, mit unbehandelten Protozoen zu vergleichen.

Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, injizieren wir Peptide direkt in den Hinterdarm, da die Peptide bei oraler Gabe an Termiten durch Proteasen im Mitteldarm und im Vorderdarm abgebaut würden. Mithilfe von Farge-Display-Bibliotheken von New England Bio Labs identifizierten wir 19 Hep-Peptidsequenzen, die an Protozoen binden. Wir wählten einen der Liganden aus, dessen Peptidsequenz Ähnlichkeiten mit putativen Glykoproteinen aufwies, die von der Troma-brucei-Membran bekannt sind.

Nach der Peptidsynthese koppelten wir das synthetisierte Peptid über eine Festphasen-Peptidsynthese an eine C-terminale fluoreszierende Sondierungsmarke unter Verwendung des E-D-A-N-S Novatech Harzes, um die lytischen Eigenschaften der Peptidkonjugate zu untersuchen. In diesem Verfahren verwenden wir ein Konjugat aus dem synthetisierten Liganden und dem lytischen Peptid ate, das zuvor einen Tag vor der Experimentierung in der Proteinanlage der LSU synthetisiert wurde. Verwenden Sie Sigma Coat, um alle verwendeten Materialien zu passivieren und die Absorption von Protozoen oder Peptiden an Oberflächen zu verhindern.

Tragen Sie eine gleichmäßige Schicht auf und lassen Sie sie über Nacht trocknen, bevor Sie sie am folgenden Tag verwenden. Bereiten Sie in einer Handschuhbox einen Lüfterkasten vor, um die Luft bei Raumtemperatur kontinuierlich durch Trockenmittel- und Katalysator-Stapel vom Typ D zu zirkulieren, um die Feuchtigkeits- und Sauerstoffkonzentration über eine Stunde lang zu senken. Füllen Sie die Handschuhbox 20 bis 30 Minuten lang mit einem kontinuierlichen Strom von Stickstoff und verwenden Sie bei Bedarf zusätzlichen Stickstoff, um die anaeroben Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Als Nächstes bereiten Sie das Traeger-U-Medium vor und stellen den pH-Wert auf sieben ein. Sterilisieren Sie das Medium durch Filtration und geben Sie es in der Handschuhbox über eine 200-Mikroliter-Spitze, die an ein Rohr angeschlossen ist, mit einer Mischung aus 2,5 % Wasserstoff, 5 % Kohlendioxid und 92,5 % Stickstoff für eine Stunde vor, um Sauerstoffrückstände in der Handschuhbox zu entfernen. Sobald die Materialien bereit sind, entnehmen Sie mit einer Pinzette einen Termitenarbeiter aus einer Petrischale und tauchen den gesamten Körper vorsichtig in einen Becher, der mit 70 % Ethanol gefüllt ist, wobei Sie die Termite mit der Pinzette etwa 10 Sekunden lang halten. Um Oberflächenkontaminationen zu entfernen, nehmen Sie den Arbeiter aus dem Ethanol und lassen ihn etwa 20 Sekunden lang auf einem sauberen Kim-Tuch trocknen.

In der Handschuhbox bereiten Sie einen silanisierten Objektträger mit 100 Mikroliter Trager-U-Medien zur Sammlung des Termitendarms und ein Gefäß mit 900 Mikroliter Trager-U-Medien zur Sammlung der Protozoen vor. Verwenden Sie dann ein Stereomikroskop und ein Paar sterile feine Pinzetten, um den Hinterleib der Arbeitertermiten festzuhalten, und greifen Sie mit einem weiteren Paar Pinzetten die Spitze des Hinterleibs, um den Darm vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad nach oben oder unten herauszuziehen. Versuchen Sie, Mittel- und Hinterdarm als ein Stück zu gewinnen, und sammeln Sie insgesamt vier Därme. Legen Sie die entnommenen Därme in einen Tropfen von 100 Mikroliter Trager-U-Medien auf einen Objektträger.

Verschieben Sie als Nächstes die Hinterdärme mit einem Paar steriler feiner Präparationsbestecke, um die Protozoen freizusetzen, und übertragen Sie vorsichtig den Darminhalt mit einer 200-Mikroliter-Pipette in ein eintausend-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 900 Mikroliter Traeger-Medium enthält. Lassen Sie fünf Sekunden für die Sedimentation von Darmwandfragmenten und übertragen Sie 900 Mikroliter des Überstandes in ein frisches Röhrchen. Übertragen Sie zehn Mikroliter der Protozoenkultur auf ein sigma-beschichtetes Mikroskop.

Verschieben und überprüfen Sie den Zustand der Protozoen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Bereiten Sie Kontrollkulturen aerob lebender Protozoen, Tetra piriformis, Amöben, Ug, Gleaner und Paramecien sowie eine Übernachtkultur von E. coli im Kulturmedium gemäß den Empfehlungen des Herstellers unmittelbar nach dem Erhalt der Protozoen vor, fixieren Sie die Protozoen aus dem Darm von Termiten sowie andere Protozoenkontrollen und E. coli mit 10 % Formaldehyd bei vier Grad Celsius für 12 Stunden. Zentrifugieren Sie danach die Protozoenlösung bei 30×g für 10 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, das die fixierten Protozoen enthält, zweimal mit je einem Milliliter Trager-U-Medium. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Traeger-Medium und inkubieren Sie die fixierten Mikroorganismen für ein bis zwei Stunden mit 100 Mikrolitern einer Lösung eines synthetisierten Liganden, der an den fluoreszierenden Farbstoff E-D-A-N-S gekoppelt ist, wobei eine Endkonzentration von 50 Mikromolar Ligand in Wasser verwendet wird. Untersuchen Sie die mit Liganden behandelten Mikroorganismen sowie unbehandelte Kontrollen unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung mit einer Absorptionsmaximum bei 341 Nanometern und einer Emission im blauen Bereich bei 471 Nanometern.

Um die ligandengekoppelten lytischen Peptid-Eigenschaften zu bewerten, pipettieren Sie sechs Aliquots von jeweils 198 Mikrolitern Protozoen-Kultur, die wie in Abschnitt drei beschrieben hergestellt wurde, in 0,5-Milliliter-Einwegröhrchen. Geben Sie zwei Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung eines ligandenbindenden lytischen Peptids zu der einen Hälfte der Aliquots der Termitendarm-Protozoen-Kultur hinzu. Als Kontrolle geben Sie zwei Mikroliter sterilem Wasser zu der anderen Hälfte der Aliquots, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erreichen.

Nach einer Stunde 10 Mikroliter jeder Protozoen-Kultur auf einen Objektträger überführen. Vergleichen Sie unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung die Überlebensfähigkeit der mit Ligand konjugierten lytischen Peptid behandelten Protozoen mit der der Kontrollen. Ziehen Sie Nadeln mit einem NGI PC 10 Mikropipettenzieher mit zweistufiger Heizstufe. Um eine Spitzengröße von 20 bis 30 Mikrometern zu erhalten, überprüfen Sie die Spitzengröße, indem Sie diese unter dem Mikroskop vermessen.

Mit einem Mikrometer füllen Sie eine Nadel mit etwa 30 Mikrolitern eines 50 Mikromolar fluoreszenzmarkierten Liganden, der in Wasser suspendiert ist. Füllen Sie mit einer Anhängespritze eine weitere Nadel mit Wasser als Kontrolle. Befestigen Sie eine Mikropipette an einem Halter und einem Mikromanipulator. Befestigen Sie eine Nadel am Halter des Injektionssystems in einem zweiten Mikromanipulator.

Stellen Sie die anfänglichen Injektionsparameter auf etwa eine Sekunde Impulsdauer und eine Injektion von 10 bis 12 PSI ein. Bewegen Sie dann die Nadel langsam in die Mikropipette hinein und injizieren Sie die Lösung mithilfe eines Fußpedals. Entfernen Sie die Mikropipette und notieren Sie die Länge der injizierten Lösung.

Unter Verwendung eines Messschiebers berechnen Sie das injizierte Volumen anhand der bekannten Parameter der Mikropipette und stellen Sie den Druck und die Impulsdauer so ein, dass 0,3 Mikroliter der Lösung ausgestoßen werden. Bereiten Sie anschließend 20 Termiten pro Behandlungsgruppe für die Injektion vor. Drücken Sie hierzu zunächst vorsichtig mit einer weichen Pinzette das Ende des Abdomens zusammen, um eventuelle Ausscheidungen aus dem Rektum zu entfernen.

Dann immobilisieren Sie die Arbeitertermiten, indem Sie sie fünf Minuten lang auf Eis kühlen, während die Termiten sich immobilisieren. Stellen Sie Empfänger zum Halten der Arbeitertermiten her, indem Sie die Spitzen von 100-Mikroliter-Pipettenspitzen abschneiden. Schneiden Sie die Spitze mit einer Rasierklinge auf eine Länge von 10 bis 12 Millimetern zu, passend zur Größe der Termiten, und legen Sie sie in ein Gefäß.

Bringen Sie mit einem Schraubverschluss den Empfänger am Mikromanipulator an. Legen Sie eine Arbeiterin in einer Petrischale auf die dorsale Seite und saugen Sie die Arbeiterin kopfvoran mithilfe einer Stickstoff-Saugpumpe in den Empfänger ein, sodass das Ende der Arbeiterin aus dem Empfänger herausragt. Halten Sie die Termiten im Empfänger vorsichtig und führen Sie die gefüllte Nadel mit Hilfe des Mikromanipulators so weit vor, dass sie in den Anus der Arbeiterin eingeführt wird. Injizieren Sie 0,3 Mikroliter des fluoreszenzmarkierten Liganden oder der Wasser-Kontrolle.

Stellen Sie die Arbeiterinnen, die mit Ligand oder Wasser injiziert wurden, in separate Petrischalen mit feuchtem Filterpapier und lagern Sie sie über Nacht bei 26 Grad Celsius und 78 % relativer Luftfeuchtigkeit. Nach 24 Stunden entnehmen Sie die Därme der injizierten Termiten und sammeln die Protozoen, wie zuvor gezeigt. Beobachten Sie die Ligandenbindung in Protozoen aus den injizierten Termiten mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie, um die lytischen Eigenschaften ligandenkonjugierter lytischer Peptide in lebenden Termiten zu bewerten.

Bereiten Sie Injektionsmaterialien, Geräte und Termiten wie zuvor für Injektionen beschrieben vor und injizieren Sie 0,3 Mikroliter einer 500 Mikromolar-Ligand-lytischen Peptidlösung oder als Kontrolle Wasser in den Hinterdarm von 20 Termitenarbeitern. Nach 24 Stunden entnehmen Sie zusätzlich die Därme mehrerer Arbeiter und untersuchen Sie den Darminhalt unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung, sobald der Tod aller Protozoen im behandelten Termitendarm bestätigt ist. Bewahren Sie die verbleibenden behandelten Termiten und Kontrolltiere in Petrischalen mit feuchtem Filterpapier auf und beobachten Sie die Mortalität täglich. Wir bestätigen, dass der mit einer fluoreszierenden Sonde gekoppelte Ligand an alle drei Protozoenarten, P. grassi, H. hartmanni und S. leidyi, bindet.

An der Hinterdarmwand von vier Mosson-Termiten unterirdischer Baue wurde bei nicht nachweisbaren Dichten eine Ligandenbindung auf der gesamten Zelloberfläche beobachtet, die entlang der Achse im vorderen Bereich der Protozoen konzentriert war, in der Nähe eines Mikrotubuli-Strangs und des Kerns MP Gras-Auge. Wir konnten außerdem Fluoreszenz bei allen getesteten frei lebenden aeroben Protozoenarten nachweisen, was darauf hindeutet, dass der Ligand an Strukturen bindet, die generisch für Protozoen sind. Während keine Ligandenbindung für E. coli beobachtet wurde, tötete ein Mikromolar des lytischen Ligandenpeptids alle drei Protozoenarten aus dem Darm von Omo- und unterirdischen Termitenarbeitern sowie auch die frei lebende T. piriformis in vitro innerhalb von weniger als 10 Minuten ab, während die Kontrollen am Leben blieben.

Dieses Bild zeigt den fortschreitenden Verlust der Membranintegrität der Protozoen im Darm der Termiten nach Behandlung mit ligandengebundenem lytischem Peptid. Bei den Behandlungen mit ligandengebundenem lytischem Peptid und Wasser wurde kein Unterschied in der Anzahl der E. coli-Kolonien beobachtet; jedoch verringerte das lytische Peptid ohne Ligand die Anzahl der E. coli-Kolonien erheblich. Dies legt nahe, dass die Anheftung eines Liganden an das lytische Peptid in gewissem Maße Nicht-Zielmikroorganismen vor der Lyse schützt. Die Injektion von 0,3 µL einer 500 µM Lösung ligandengebundenen lytischen Peptids tötete innerhalb von 24 Stunden alle drei Arten von Protozoen im Darm von Holzschwärmer- und Untergrundtermiten ab, und die Termiten starben nach 10 Tagen, nachdem ein ligandenverknüpftes lytisches Peptid injiziert worden war.

Protozoen und Termiten starben dreimal schneller als bei Injektion von nicht ligandengekoppelten lytischen Peptiden, wie in Husen und Colia 2009 gezeigt, was darauf hindeutet, dass das Ligand die zydale Effizienz der lytischen Peptide gegenüber Protozoen unter optimalen Kulturbedingungen erhöht. Alle drei Protozoen-Arten, die aus dem Darm von Omo subterranen Termiten isoliert wurden, sollten mindestens drei Tage lang am Leben und gesund bleiben.

Wenn jedoch Sauerstoffrückstände im Medium verbleiben, stoppt die Bewegung der Protozoen unmittelbar. Wenn ein ungeeignetes Medium verwendet wird und der osmotische Druck in den Zellen zu hoch wird, wölben sich die Membranen der Protozoen aus und die Protozoen platzen. Wenn der osmotische Druck in den Zellen zu niedrig ist oder die Membranen geschädigt sind, schrumpfen die Protozoen und ziehen sich zusammen. Die Fixierung von Protozoen erleichtert den Nachweis der Bindung eines fluoreszentmarkierten Liganden an die Protozoen.

Es ist schwierig, Fluoreszenz zu detektieren und von der Autofluoreszenz der Holzpartikel zu unterscheiden, wenn sich die Protozoen frei bewegen. Sobald diese Technik beherrscht ist, können mit Hilfe eines Assistenten etwa 30 Termiten pro Stunde injiziert werden. Obwohl das Ligand-Colitic-Peptid zur Abtötung von Protosomen-Symbionten im Darm von Untergrundtermiten und somit zur Bekämpfung von Termiten entwickelt wurde, könnte es auch nützlich sein, um Wirkstoffe gegen Protosomen-Parasiten wie Slash-Mania, Ponoma, Te und Odium zu entwickeln, die zahlreiche Krankheiten beim Menschen verursachen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus dem Darm von Termiten gewonnene Protozoen in Kultur erhält und pflegt, wie man mittels Fluoreszenzmikroskopie die spezifische Bindung eines Liganden an Protozoen nachweist, wie man die proto-suizidale Wirkung eines Liganden-Colitischen Peptids in vitro demonstriert und schließlich, wie man Peptide in den Darm von Tumortieren injiziert, um die Wirkung in vivo zu bestätigen.