Corneal konfokale Mikroskopie: A Novel Non-invasive Technik zu Small Fibre Pathologie in peripheren Neuropathien Quantify

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Abbildung von Hornhaut-C-Fasern mithilfe der nichtinvasiven Technik der konfokalen Mikroskopie der Hornhaut oder CCM, die eine Quantifizierung von Nervenfaserläsionen ermöglicht. Zunächst wird die Fokusebene des Objektivs an der CCM eingestellt und viskozes Tränen-Gel auf das Objektiv aufgetragen, bevor die Einwegkappe angebracht wird. Anschließend werden anästhetische Tropfen und viskozes Tränen-Gel auf das Auge aufgetragen.

Anschließend wird die Kamera so justiert, dass zwischen dem Gel auf der Vorderseite der Linse und der Hornhaut des Patienten Kontakt hergestellt wird. Schließlich wird die Fokusebene in der Tiefe angepasst, und Bilder der hornhautnahen Nerven aus dem zentralen Bereich der Bowman-Schicht werden aufgenommen. Morphologische Veränderungen der hornhautnahen Nervenfasern können zur Quantifizierung der Neuropathie beobachtet werden.

Dies ist eine äußerst neuartige Technik, die ursprünglich im Bereich der Optometrie und Augenheilkunde eingesetzt wurde, in den letzten acht Jahren oder so jedoch sehr effektiv von uns zur Untersuchung und Beurteilung diabetischer Neuropathien und anderer peripherer Neuropathien genutzt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Quantifizierung von Schäden an kleinen Fasern bereits in einem sehr frühen Stadium ermöglicht und anschließend die Schwere der Neuropathie bei Patienten vollständig nichtinvasiv stratifiziert werden kann. Dies gelingt uns sehr schnell mittels eines zweiminütigen Scans, der dann hinsichtlich des Schweregrads der Neuropathie quantifiziert werden kann. Wir hoffen daher, dass diese Methode einige andere, deutlich invasivere Verfahren wie Haut- oder Nervenbiopsien ersetzen kann. Obwohl die Technik insgesamt einfach erscheint, erfordert sie tatsächlich bestimmte Schritte, um das Bild optimal aufzunehmen und anschließend zu quantifizieren.

Und tatsächlich möchten wir diesen gesamten Prozess für alle anderen Personen, die diese Technik anwenden möchten, klar und nachvollziehbar machen. Der erste Schritt bei der Untersuchung mit dem HRT-Kornea-Konfokalmikroskop ist die Vorbereitung der Objektivspitze am Objektivrohr der Laserscanningkamera. Stellen Sie die Refraktion auf plus 12 Dioptrien ein und justieren Sie anschließend die Kamera in die tiefste Position, bevor Sie das Objektiv durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn verriegeln.

Bringen Sie einen großen, homogenen, blasenfreien Tropfen viskoelastischer Flüssigkeit (P-Größe) auf die Linsenspitze auf. Entnehmen Sie eine Tomokappe aus ihrem sterilen Behältnis und setzen Sie sie so weit wie möglich über die Linsenspitze auf den Halter, sodass sich zwischen Objektivlinse und Kappe ein Meniskus des Gels bildet. Achten Sie darauf, während des Aufsetzens die vordere Oberfläche der Tomokappe nicht zu berühren.

Bewegen Sie nun die Laserscankamera so weit wie möglich rückwärts auf der Kamerahalterung, um die innere und äußere Oberfläche der Tomokappe zu erfassen. Beide erscheinen als helle Laserreflexion auf dem Bildschirmmonitor. Stellen Sie das Fokussierungsrad für die Fokusebene so lange ein, bis ein heller Reflex sichtbar ist, was darauf hinweist, dass die Linse auf die Vorderseite der Kappe fokussiert ist.

Der in der Fokuspositionsanzeige angezeigte Tiefenwert sollte nun zwischen minus 150 Mikrometern und plus 150 Mikrometern liegen. Setzen Sie die Tiefeneinstellung auf null zurück. Nun sehen wir uns an, wie der Patient vorbereitet wird.

Nach der Anästhesierung der Augen des Probanden mit einem Tropfen 0,4 %iger Lidocain-Hydrochlorid-Lösung befeuchten Sie die Augenvorderfläche mit Visco-Tränen. Plazieren Sie den Probanden bequem mit dem Kinn auf der Kinnstütze und stellen Sie sicher, dass seine Stirn fest an der Stirnstützstange anliegt. Die Untersuchung wird dadurch erleichtert, dass der Patient angewiesen wird, den äußeren Fixationspunkt anzustarren.

Da das nicht untersuchte Auge aufgrund der kompakten Größe des Mikroskopkopfs nicht verdeckt wird, können Fernziele verwendet werden. Positionieren Sie die CCD-Kamera so, dass ihr optischer Zugang senkrecht zum optischen Zugang der Laserscanning-Kamera verläuft.

Die Kamera sollte bei der Aufnahme des rechten Auges auf der rechten Seite des Patienten und umgekehrt auf der linken Seite sein. In dieser Position ist die vordere Oberfläche der Tomokappe in der Mitte der CCD-Kamera sichtbar. Live-Bild.

Bewegen Sie die Laserscankamera in Richtung des Patienten, bis die Hornhaut des Patienten einen Abstand von etwa fünf bis zehn Millimetern zur Tomokappe aufweist. Verwenden Sie dann die Höhen- und Seitenverstellknöpfe an der Kamerahalterung, um die Laserscankamera nach oben und unten sowie nach links und rechts zu bewegen, bis die Tomokappe mittig über der Hornhaut des Patienten positioniert ist. Bitten Sie nun den Patienten, die Augen so weit wie möglich zu öffnen.

Bewegen Sie die Laserscankamera langsam auf den Patienten zu, bis die Tomokappe die Hornhaut des Patienten berührt. Überprüfen Sie an dieser Stelle, ob das rote Laserlicht in der Mitte der Hornhaut liegt und ob die Reflexion des Laserstrahls von der Hornhaut exakt am vorderen Pol der Hornhaut auftritt. Bei optimaler Einstellung besteht ein minimaler Kontakt zwischen Linse und Hornhaut.

Eine dünne Gelbrücke zwischen der Tomokappe und der Hornhaut ist auf dem Live-Bild der CCD-Kamera sichtbar. Wenn der Druck zwischen der Tomokappe und der Hornhaut zu hoch ist, zeigt sich über die CCD-Kamera ein abgeflachtes Erscheinungsbild der Hornhaut. Live-Bild und Streuung erscheinen auf dem CCM-Bild.

Nach der Anpassung des Patienten schalten Sie die HR Drei-Laser-Kamera ein, woraufhin das Bildaufnahmefenster auf dem Bildschirm erscheint. Verwenden Sie das CCD-Bild, um die Tomokappe und das Laserlicht auf der Hornhaut des Patienten zu positionieren. Das CCM verfügt über drei Optionen zur Bildaufnahme.

Mit der Sequenzaufnahme können bis zu 100 Bilder mit einer einstellbaren Bildfrequenz aufgenommen werden. Es wird eine Bildfrequenz zwischen 30 und einem Bild pro Sekunde gewählt. Darauf basierend kann ein Film mit einer Dauer von drei bis 100 Sekunden aufgezeichnet werden.

Im Volumenscan-Modus erfasst die Kamera automatisch eine Serie von 40 Bildern an aufeinanderfolgenden Fokusebenen. Es kann eine Gesamttiefe von 85 Mikrometern abgetastet werden, wobei der Fokusabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern etwa 2,1 Mikrometer beträgt. Die letzte Option ist der Schnittmodus, der für dieses Experiment verwendet wird.

Dieser Modus ermöglicht eine optimale Bildgebung, bei der bei jedem Betätigen des Fußschalters klare Einzelbilder erfasst und gespeichert werden. Dieser Modus wird verwendet, um Bilder aus der gesamten Hornhautschicht einschließlich der Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut aufzunehmen. Nachdem eine ausreichende Anzahl an Bildern erfasst wurde, können andere Modi verwendet werden, darunter Sequenz- und Volumenaufnahmen.

Nach einigen Scans kann die Fokusebene der Linse verändert werden, um die Tiefe einer Hornhautzelllage relativ zur Hornhautoberfläche zu messen, indem die epitheliale Zellschicht scharfgestellt und anschließend die Reset-Taste geklickt wird, um den Tiefenwert auf null zu setzen. Nach Abschluss der Untersuchung schalten Sie die Kamera aus, indem Sie im Erfassungsfenster auf die Kamerastromtaste klicken. Weisen Sie den Patienten darauf hin, die Augen nicht zu reiben, bis die lokale Anästhesie abgeklungen ist.

Entfernen Sie die Tomokappe von der Kamera, entsorgen Sie sie und reinigen Sie anschließend die Objektivlinse des Mikroskops mit einem mit destilliertem Wasser angefeuchteten Wattestäbchen. Nun zeigen wir, wie man ein Bild analysiert und Parameter der Nervenfasern quantifiziert, um vorhandene Untersuchungen zu überprüfen und auszuwerten. Wählen Sie zunächst den entsprechenden Patientendatensatz im Datenbankfenster aus.

Das Bildbetrachtungsfenster bietet eine Übersicht über vorhandene Hornhautuntersuchungen für den ausgewählten Patienten. Untersuchungen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, werden in separaten Besuch-Tabs gespeichert. Die drei verschiedenen Scantypen werden durch drei verschiedene Symbole dargestellt. Im HRT-Drei-Hornhaut-Besuch-Tab des Bildbetrachtungsfensters des Heidelberg Eye Explorer.

Um das Hornhautbild zu überprüfen, doppelklicken Sie das entsprechende Bildsymbol und klicken Sie dann auf „anzeigen“, um die entsprechenden Bilder für eine weitere Analyse zu exportieren. Klicken Sie dazu auf „exportieren“ in der Symbolleiste und wählen Sie anschließend den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Da der Hauptfokus dieser Studie auf der Bowman-Schicht und den hornhautständigen Nerven liegt, werden ausschließlich die Bilder dieser Schicht analysiert. Für jeden Probanden werden fünf bis sechs Aufnahmen aus der Bowman-Schicht in unterschiedlichen Tiefen der Hornhaut ausgewählt.

Die Bildanalyse erfolgt mit einer speziellen Software, die von unserer Gruppe entwickelt wurde und als CCM Image Analysis Tools, Version 0.64, bezeichnet wird. Die wichtigsten Parameter für die Hornhautnerven werden mit der Software ermittelt: die Nervenfaserdichte, definiert als die Anzahl der Hauptnerven pro Bildausschnitt. Die Nervenastdichte ist die Gesamtanzahl der Hauptäste pro Bildausschnitt.

Die Nervenfasernlänge ist die Gesamtlänge der Hauptnerven und Hauptäste pro Bildausschnitt der Nervenfaser. Die Krümmung ist die Tortuosität der Hauptnerven pro Bildausschnitt. Um ein CCM-Bild zu öffnen, gehen Sie zu Datei und dann zu Öffnen.

Nachdem das Bild geladen ist, werden seine Größe und sein Typ im Bildinformationsfeld oben links auf der Bedienoberfläche angezeigt, die Standardskalierung erscheint in der Bearbeitungszeile der Bildinformationen. Falls die Skalierung abweicht, ändern Sie die Zahl in der Bearbeitungszeile. Um mit der Analyse des Bildes zu beginnen, wählen Sie den gewünschten Messparameter aus dem Metrikfeld oben rechts auf der Bedienoberfläche aus.

In dem Ergebnisfeld am unteren Seitenrand werden NFD und MBD als tatsächliche Zahl angegeben. NFL wird in Millimetern und die Tortuosität als Tortuositätskoeffizient dargestellt. Die Ergebnisse können in eine Excel-Tabelle exportiert werden.

Wenn Sie die Excel-Seite öffnen, werden die Ergebnisse in Anzahl pro Quadratmillimeter für NFD und MBD in Millimeter pro Quadratmillimeter für NFL sowie als Tortuositätskoeffizient für NFT dargestellt. Um diese Messungen durchzuführen, markieren Sie zunächst jeden Hauptnerv, danach jeden Hauptnervenzweig. Schließlich verfolgen Sie jeden Nerv innerhalb des Bildausschnitts nach.

Ein digitaler Stift kann zur Verbesserung der Genauigkeit verwendet werden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Minute durchgeführt werden, sofern das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Es ist wichtig, die detaillierten Anweisungen genau zu befolgen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man mit der konfokalen Mikroskopie der Hornhaut an der Bewegungsschicht der Hornhaut arbeitet, Bilder aus dieser Schicht aufnimmt und die Bilder bei Patienten mit peripherer Neuropathie, insbesondere diabetischer Neuropathie, quantifiziert und analysiert. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit CCM Fachkenntnisse erfordert und empfohlen wird, dass Fachkräfte, die in der Augenuntersuchung geschult sind, das Verfahren durchführen sollten.