Name: Corneal konfokale Mikroskopie: A Novel Non-invasive Technik zu Small Fibre Pathologie in peripheren Neuropathien Quantify (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Lernen Sie die korneale konfokale Mikroskopie zur nicht-invasiven Quantifizierung von Nervenfaserschäden bei peripheren Neuropathien. Diese Methode ermöglicht die Beurteilung morphologischer Veränderungen kornealer Nervenfasern.

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Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation International (gewähren 17-2008-1031) und die National Institutes of Health (Grant 1R01DK077903-01A1) unterstützt.

Einleitung: Die genaue Quantifizierung der peripheren Neuropathie ist wichtig, Risikopatienten zu definieren, zu antizipieren Verschlechterung und Bewertung neuer Therapien. Herkömmliche Methoden zur Bewertung neurologischer Defizite und Elektrophysiologie und quantitative sensorische Testung quantifiziert funktionellen Veränderungen auf Neuropathie erkennen. Allerdings scheint die früheste Schäden an den kleinen Fasern werden und doch sind diese Tests in erster Linie zu beurteilen großen Faser Dysfunktion und haben eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration und Reparatur zu demonstrieren. Das einzige Verfahren, die eine direkte Untersuchung von marklosen Nervenfasern Schädigung und-Reparatur ermöglichen, sind N. suralis mit Elektronenmikroskopie und Haut-Stanzbiopsie Biopsie. Allerdings sind sowohl invasive Verfahren und erfordern langwierige Laborverfahren und erheblichen Know-how. Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die in-vivo-Bildgebung von Hornhaut Nervenfasern bietet. HRT III-Rostock Kornea Modul (RCM) Handbuch der Betrieb 1. Vorbereitung der Kamera Der erste Schritt in der Untersuchung mit HRT ist die Vorbereitung des Objektivs Spitze. <ol><li> Zuerst an der objektiven Röhre des Laser-Scanning-Kamera, stellen Sie die Brechung bis +12 Dioptrien und stellen Sie dann die Kamera auf die unterste Position. </li><li> Tragen Sie eine große homogene, blasenfreie, erbsengroße, Tropfen von Carbomer auf der Linse Spitze. </li><li> Entfernen eines TomoCap aus der sterilen Behälter und befestigen Sie die Linse mit Spitze, so dass das Gel ein Meniskus zwischen dem Objektiv und der Kappe bildet. Schieben Sie ihn so weit wie möglich über den Inhaber. Achten Sie darauf, nicht auf die Vorderseite des TomoCap bei der Montage zu berühren. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorbereitung des Objektivs Spitze (oben) Anwendung viscotear Gel (unten) Die Anwendung der TomoCap. </li><li> Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera so weit nach hinten wie möglich an der Kamera befestigen. </li><li> Die inneren und äußeren Oberfläche der TomoCap sowohl als heller Laser Reflexion erscheinen. Die Brennebene Einstellrad sollte so eingestellt, bis eine helle Reflexion beobachtet, was darauf hinweist, dass die Linse innerhalb der Vorderseite der Kappe ist fokussiert werden. Die Tiefe Wert in der Fokus-Position angezeigt sollte nun zwischen -150 und +150 &amp;mgr; um betragen. </li><li> Setzen Sie die Tiefe Einstellung auf Null. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Anpassung der Brennebene. </li></ol> 2. Vorbereitung des Patienten Die Augen des Motivs werden anästhesiert mit einem Rückgang von 0,4% benoxinate Hydrochlorid und Carbomer ist auf der Vorderseite des Auges zur Schmierung verwendet. Das Thema ist bequem, mit dem Kinn auf die Kinnstütze sitzt und gebeten, ihre Stirn fest gegen die Stirn bar. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Vorbereitung des Patienten 3. Ausrichten der Kamera Es macht die Untersuchung einfacher, wenn Sie den Patienten auf der äußeren Fixierung Licht mit dem Auge nicht geprüft fix zu unterweisen. Die kompakte Größe des Mikroskops Kopf bedeutet, dass das Thema der kontralateralen Auge nicht verdeckt, so dass die Verwendung von Distanz-Ziele. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Objektiv der Hornhaut-Modul. <ol><li> Position der CCD-Kamera, so dass seine optische Achse senkrecht zur optischen Achse des Laser-Scanning-Kamera. Die Kamera sollte auf der rechten Patientenseite werden bei der Abbildung das rechte Auge und umgekehrt. An dieser Stelle sollten Sie die Vorderseite des TomoCap in der Mitte des CCD-Kamera Live-Bild. </li><li> Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera auf den Patienten, bis der Hornhaut des Patienten ist in einem Abstand von ca. 5 bis 10 mm aus dem TomoCap, dann bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera nach oben / unten und links / rechts mit dem schwarzen Knöpfe an der Kamera, bis die TomoCap positioniert ist, in der Mitte der Hornhaut des Patienten. In diesem Stadium können Sie überprüfen, dass das rote Laserlicht in der Mitte der Hornhaut und zur Feineinstellung, beachten Sie die Reflexion des Laserstrahls von der Hornhaut, die sichtbar in der CCD-Kamera Bild ist. Diese Reflexion muss genau treten an den vorderen Pol der Hornhaut. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Ausrichtung des Laserstrahls auf dem vorderen Pol der Hornhaut zu zentralen Hornhaut Bilder zu fassen. </li><li> Fragen Sie den Patienten, seine / ihre Augen so weit wie möglich zu öffnen. Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera langsam nach vorne in Richtung des Patienten, bis der TomoCap Kontakte der Hornhaut des Patienten. Wenn es erforderlich istzur Korrektur der Position des Laser-Scanning-Kamera, dann bewegen Sie die Kamera weg von den Patienten zunächst nicht der Korrektur, verschieben Sie es dann wieder nach vorne, um die Hornhaut zu kontaktieren. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Demonstration der dünnen Gel-Brücke zwischen den TomoCap und der Hornhaut. </li><li> Minimaler Kontakt zwischen der Kamera und die Hornhaut ist genug. In eine optimale Anpassung wird eine dünne Gel-Brücke zwischen den TomoCap und der Hornhaut sichtbar auf der CCD-Kamera Live-Bild. </li></ol> Wenn Sie die TomoCap drücken oder bewegen Sie die Hornhaut zu nah an die Kamera dann wird der Druck auf die Hornhaut mit einem abgeflachten Erscheinung in der Hornhaut mittels der CCD-Kamera Live-Bild zu sehen. Auch in den Bildern erhalten eine Linie zeigt den Druck, erscheint daher nicht zu viel Druck auf die Hornhaut. Sobald der Kontakt hergestellt wurde, bewegen sich nicht die Position des headrestto vermeiden Schiebe die Hornhaut auf der TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7 (links) Darstellung eines straie aufgrund der Anwendung von Überdruck auf der Hornhaut durch die TomoCap;. (Rechts) Ein Bild mit normalem Aussehen ohne Überdruck. 4. Untersuchung des Patienten Nach dem Sichtfeld gewählt worden ist, ist die HRT III Laser Kamera eingeschaltet und die Bildaufnahme erscheint auf dem Bildschirm. Verwenden Sie die CCD Bild, um die TomoCap und Laser-Licht auf der Hornhaut des Patienten positionieren. Die Untersuchung mit dem gewählten Modus kann dann begonnen werden. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Abbildung 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Viewing-Modus auf dem Monitor während der Aufnahme von Bildern. Die Art der Übernahme In dem Abschnitt Modus wird ein einziges Bild erworben und jedes Mal, wenn Sie den Fußschalter gespeichert. Wir verwenden diesen Modus für die Aufnahme von Bildern aus der ganzen Schicht der Hornhaut einschließlich Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut. Und dann nach der Aufnahme eine ausreichende Zahl von Bildern, kann man versuchen, den anderen Modi einschließlich Abfolge und Volumen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Abbildung 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. Wahlweise mit Display für verschiedene Bildaufnahme-Modi. Mit dem Sequence-Scan kann man eine Sequenz von bis zu 100 Bilder mit einer einstellbaren Frame-Rate zu erwerben. Sie können wählen, eine Frame-Rate zwischen 30 Bilder und 1 Bild pro Sekunde (fps) und basierend auf diesen Modus erlaubt es Ihnen, einen Film mit einer Dauer von 3 bis 100 Sekunden abrufen kann. In Volume-Scan-Modus stellt die Kamera automatisch erwirbt eine Serie von 40 Bildern in Folge Fokusebenen. Eine Tiefe von 85 um mit dem "FOV 400 um" Feldlinse und die Brennweite zwischen zwei aufeinander folgenden Bildern gescannt werden etwa 2,1 mu m liegen. Nach ein paar Scans der Fokusebene des Objektivs kann geändert werden, um die Tiefe einer Hornhaut-Zellschicht bezogen auf die Oberfläche der Hornhaut, indem die Epithelzellschicht in den Fokus und dann auf die Reset-Taste, um die Tiefe Wert auf 0 gesetzt zu messen. Für den Zweck unserer vorliegenden Studie, so erhalten wir Bilder von der zentralen Hornhaut in verschiedenen Tiefen. Deshalb haben wir nicht bewegen Scanning-Laser-Kamera um die Hornhaut horizontal oder vertikal, wir haben nur vorwärts und rückwärts bewegen und die Aufnahmen aus allen Tiefen der Bowman-Schicht an der gleichen Stelle der Hornhaut. Der Abstand zwischen jedem Bild ist etwa 1 um, daher, wenn die Tiefe von Bowman ist 10 pm, werden wir 10 Bilder haben. Doch für die endgültige Analyse wählen wir Bilder mit einem Abstand von ca. 2-3 um zwischen ihnen. Nach der Untersuchung abgeschlossen ist schalten Sie die Kamera ausschalten, indem Sie die Kamera-Taste in der Akquisition Fenster. Machen Sie dem Patienten bewusst, dass er oder sie sollte nicht reiben seine Augen, bis die örtliche Betäubung abgeklungen ist. Als Vorsichtsmaßnahme sollten Sie auf eine Spaltlampe Untersuchung der Hornhaut des Patienten nach der Untersuchung durchzuführen. Entfernen Sie die TomoCap von der Kamera und entsorgen Sie es und dann reinigen Sie die Mikroskop-Objektiv mit einem Wattestäbchen mit destilliertem Wasser befeuchtet. 5. Die Analyse einer Prüfungskommission a. Die Auswahl der Bilder Zur Überprüfung und Analyse vorhandener Untersuchungen, müssen die entsprechenden Patientenakte (s) in der Datenbank ausgewählt werden. Das Bild Sichtfenster bietet einen Überblick über vorhandene Hornhaut Untersuchungen für das ausgewählte Patienten. Untersuchungen an verschiedenen Tagen durchgeführt werden in separaten Tabs Besuch gespeichert. Die drei verschiedenen Scan-Typen werden durch drei verschiedene Symbole in der HRT III Hornhaut Besuch auf der Registerkarte Bild Sichtfenster der Hei vertretendelberg Eye Explorer. Zur Erfassung der Hornhaut Bild, doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild klicken und die "Show"-Funktion öffnet sich folgendes Fenster: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Abbildung 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 10"> Abbildung 10. Aller aufgenommenen Bilder nach Prüfung anzeigen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Abbildung 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 11"> Abbildung 11. Anzeige des ausgewählten Bildes vor dem Export mit CCD-Kamera Blick von Auge um eine korrekte Ausrichtung zu zeigen. So exportieren Sie die entsprechenden Bilder für die weitere Analyse, klicken Sie auf "Export" in der Symbolleiste und wählen Sie dann den gewünschten Ordner, um die Bilder zu speichern. Wir erhalten und die Aufnahmen aus allen Schichten der Hornhaut für jeden Patienten, sondern als der Schwerpunkt der Forschung ist auf Bowman-Schicht und der Hornhaut Nerven, werden nur die Bilder aus dieser Schicht analysiert werden. Wir wählen 5-6 Frames von Bowman-Schicht für jedes Fach in unterschiedlichen Tiefen der Hornhaut. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Abbildung 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 12"> Abbildung 12. Anzeige aller Schichten der Hornhaut von einem gesunden Probanden. Auf durchschnittlich 5-6 Frames von Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut in verschiedenen Tiefen werden nach dem Zufallsprinzip für quantitative Messungen und Analysen ausgewählt. b. Analyse von Bildern Für die Analyse der Bilder von Bowman-Schicht der zentralen Hornhaut mit HRT III erfasst, verwenden wir eine spezielle Software, die innerhalb unserer Gruppe namens "CCM Image Analysis Tools V 0.6" entwickelt wurde. Vier Haupt-Parameter für die Hornhaut Nerven sind mit dieser Software gemessen: <ul><li> Nervenfaser Dichte (NFD), die als die Zahl der Hauptnerven / Rahmen definiert ist. </li><li> Nervenast Dichte (NBD) Anzahl der Hauptäste / Rahmen. </li><li> Nerve Faserlänge (NFL), die die Gesamtlänge aller Nerven / Rahmen. </li><li> Nervenfaser Tortuosität (NFT) des Hauptnerven / Rahmen. </li></ul> Zum Öffnen CCM Bild, um die Datei zu gehen&gt; öffnen. <ul><li> Sobald das Bild geladen ist, ist seine Größe und Art der Bildinformationen Box auf der obersten linken Seite der Systemsteuerung angezeigt. </li><li> Der Standard-Maßstab ist in der Eingabezeile der Bildinformationen angezeigt. Wenn der Maßstab ist anders, ändern Sie die Nummer in der Eingabezeile. </li><li> Zu Beginn der Analyse das Bild, wählen Sie die gewünschten Parameter aus der Metric Box in der rechten oberen Seite des Control Panels messen. </li><li> Auf das Ergebnis am unteren Rand der Seite die Anzahl der NFD ist NBD in tatsächliche Zahl, NFL in mm und Schlängelung als Tortuosität Coefficient (TC) vorgestellt. </li><li> Doch nach dem Export der Ergebnisse in eine Excel-Tabelle werden die Ergebnisse in keiner / mm 2 für NFD und NBD-und mm / mm 2 für NFL vorgestellt werden. </li><li> Zu diesem Zweck nach Beendigung Messungen an Add-Messungen klicken, dann gehen Sie auf Datei&gt; Speichern unter und öffnen Sie dann die gespeicherten Ergebnisse mit Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Abbildung 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 13"> Abbildung 13. Anzeige der Hornhaut Nerven Bild mit Tracing in Analyse-Tool mit "CCM Image Analysis Tool". 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir haben eine progressive Steigerung in der Hornhaut Nervendegeneration mit zunehmender Schwere der diabetischen Neuropathie 1 und frühen Nervenschäden bei Diabetikern, die den Verlust von intraepidermalen Nervenfasern in Hautbiopsien vorausgeht 2 zusammen mit Schichtung der neuropathischen Schwere und Reparatur nach Pankreas-transplantation 3 in Diabetes-Patienten. Gezeigt Wir haben auch Nervenschäden bei idiopathischer kleine Faser Neuropathie 4 und Morbus Fabry 5 nachgewiesen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Abbildung 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 14"> Abbildung 14. Corneal konfokale Mikroskopie Bilder mit HRT III der Hornhaut-Bowman-Schicht (a) Steuerung unterliegt im Vergleich zu (b) Patient mit Neuropathie und schwere Nervenschäden.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Figuren 4 bis 6: Mit freundlicher Genehmigung von Heidelberg Engineering

Corneal konfokale Mikroskopie (CCM) ist eine nichtinvasive klinische Verfahren, mit dem frühen Nervenschäden zu erkennen und zu quantifizieren kleine Faser Pathologie in peripheren Neuropathien einschließlich Diabetes, Morbus Fabry und idiopathische kleine Faser Neuropathien (ISFN) werden kann. Die unmittelbare klinische Bedeutung dieser Technik stellt einen großen Sprung nach vorn in Bezug auf unsere Fähigkeit zu diagnostizieren, zu folgen Progression und bewerten therapeutische Reaktion bei Patienten mit diabetischer ...

<table><tbody><tr><td>HRT III CCM-Gerät – Das Rostock-Cornea-Modul</td><td></td><td></td><td>Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>CCM-Bildanalyse-Software v0.6</td><td></td><td></td><td>University of Manchester</td></tr></tbody></table>

corneal konfokale mikroskopie: a novel non-invasive technik zu small fibre pathologie in peripheren neuropathien quantify

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Die genaue Quantifizierung der peripheren Neuropathie ist wichtig, Risikopatienten zu definieren, zu antizipieren Verschlechterung und Bewertung neuer Therapien. Herkömmliche Methoden zur Bewertung neurologischer Defizite und Elektrophysiologie und quantitative sensorische Testung quantifiziert funktionellen Veränderungen auf Neuropathie erkennen. Allerdings scheint die früheste Schäden an den kleinen Fasern werden und doch sind diese Tests in erster Linie zu beurteilen großen Faser Dysfunktion und haben eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration und Reparatur zu demonstrieren. Das einzige Verfahren, die eine direkte Untersuchung von marklosen Nervenfasern Schädigung und-Reparatur ermöglichen, sind N. suralis mit Elektronenmikroskopie und Haut-Stanzbiopsie Biopsie. Allerdings sind sowohl invasive Verfahren und erfordern langwierige Laborverfahren und erheblichen Know-how. Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die in-vivo-Bildgebung von Hornhaut Nervenfasern bietet. Wir haben frühzeitig Nervenschäden, die den Verlust von intraepidermalen Nervenfasern geht in Hautbiopsien zusammen mit Schichtung der neuropathischen Schwere und Reparatur nach Pankreas-Transplantation bei Patienten mit Diabetes nachgewiesen. Wir haben auch Nervenschäden bei idiopathischer kleine Faser Neuropathie und Fabry-Krankheit nachgewiesen.

Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die zur C-Faser Schäden quantifizieren zu diagnostizieren und zu schichten Patienten mit zunehmender Schwere neuropathischen werden kann.

Corneal konfokale Mikroskopie: A Novel Non-invasive Technik zu Small Fibre Pathologie in peripheren Neuropathien Quantify

Die genaue Quantifizierung der peripheren Neuropathie ist wichtig, um Risikopatienten zu definieren, eine Verschlechterung vorherzusehen und neue Therapien zu bewerten. ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Abbildung von Hornhaut-C-Fasern mithilfe der nichtinvasiven Technik der konfokalen Mikroskopie der Hornhaut oder CCM, die eine Quantifizierung von Nervenfaserläsionen ermöglicht. Zunächst wird die Fokusebene des Objektivs an der CCM eingestellt und viskozes Tränen-Gel auf das Objektiv aufgetragen, bevor die Einwegkappe angebracht wird. Anschließend werden anästhetische Tropfen und viskozes Tränen-Gel auf das Auge aufgetragen.Anschließend wird die Kamera so justiert, dass zwischen dem Gel auf der Vorderseite der Linse und der Hornhaut des Patienten Kontakt hergestellt wird. Schließlich wird die Fokusebene in der Tiefe angepasst, und Bilder der hornhautnahen Nerven aus dem zentralen Bereich der Bowman-Schicht werden aufgenommen. Morphologische Veränderungen der hornhautnahen Nervenfasern können zur Quantifizierung der Neuropathie beobachtet werden.Dies ist eine äußerst neuartige Technik, die ursprünglich im Bereich der Optometrie und Augenheilkunde eingesetzt wurde, in den letzten acht Jahren oder so jedoch sehr effektiv von uns zur Untersuchung und Beurteilung diabetischer Neuropathien und anderer peripherer Neuropathien genutzt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Quantifizierung von Schäden an kleinen Fasern bereits in einem sehr frühen Stadium ermöglicht und anschließend die Schwere der Neuropathie bei Patienten vollständig nichtinvasiv stratifiziert werden kann. Dies gelingt uns sehr schnell mittels eines zweiminütigen Scans, der dann hinsichtlich des Schweregrads der Neuropathie quantifiziert werden kann. Wir hoffen daher, dass diese Methode einige andere, deutlich invasivere Verfahren wie Haut- oder Nervenbiopsien ersetzen kann. Obwohl die Technik insgesamt einfach erscheint, erfordert sie tatsächlich bestimmte Schritte, um das Bild optimal aufzunehmen und anschließend zu quantifizieren.Und tatsächlich möchten wir diesen gesamten Prozess für alle anderen Personen, die diese Technik anwenden möchten, klar und nachvollziehbar machen. Der erste Schritt bei der Untersuchung mit dem HRT-Kornea-Konfokalmikroskop ist die Vorbereitung der Objektivspitze am Objektivrohr der Laserscanningkamera. Stellen Sie die Refraktion auf plus 12 Dioptrien ein und justieren Sie anschließend die Kamera in die tiefste Position, bevor Sie das Objektiv durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn verriegeln.Bringen Sie einen großen, homogenen, blasenfreien Tropfen viskoelastischer Flüssigkeit (P-Größe) auf die Linsenspitze auf. Entnehmen Sie eine Tomokappe aus ihrem sterilen Behältnis und setzen Sie sie so weit wie möglich über die Linsenspitze auf den Halter, sodass sich zwischen Objektivlinse und Kappe ein Meniskus des Gels bildet. Achten Sie darauf, während des Aufsetzens die vordere Oberfläche der Tomokappe nicht zu berühren.Bewegen Sie nun die Laserscankamera so weit wie möglich rückwärts auf der Kamerahalterung, um die innere und äußere Oberfläche der Tomokappe zu erfassen. Beide erscheinen als helle Laserreflexion auf dem Bildschirmmonitor. Stellen Sie das Fokussierungsrad für die Fokusebene so lange ein, bis ein heller Reflex sichtbar ist, was darauf hinweist, dass die Linse auf die Vorderseite der Kappe fokussiert ist.Der in der Fokuspositionsanzeige angezeigte Tiefenwert sollte nun zwischen minus 150 Mikrometern und plus 150 Mikrometern liegen. Setzen Sie die Tiefeneinstellung auf null zurück. Nun sehen wir uns an, wie der Patient vorbereitet wird.Nach der Anästhesierung der Augen des Probanden mit einem Tropfen 0,4 %iger Lidocain-Hydrochlorid-Lösung befeuchten Sie die Augenvorderfläche mit Visco-Tränen. Plazieren Sie den Probanden bequem mit dem Kinn auf der Kinnstütze und stellen Sie sicher, dass seine Stirn fest an der Stirnstützstange anliegt. Die Untersuchung wird dadurch erleichtert, dass der Patient angewiesen wird, den äußeren Fixationspunkt anzustarren.Da das nicht untersuchte Auge aufgrund der kompakten Größe des Mikroskopkopfs nicht verdeckt wird, können Fernziele verwendet werden. Positionieren Sie die CCD-Kamera so, dass ihr optischer Zugang senkrecht zum optischen Zugang der Laserscanning-Kamera verläuft.Die Kamera sollte bei der Aufnahme des rechten Auges auf der rechten Seite des Patienten und umgekehrt auf der linken Seite sein. In dieser Position ist die vordere Oberfläche der Tomokappe in der Mitte der CCD-Kamera sichtbar. Live-Bild.Bewegen Sie die Laserscankamera in Richtung des Patienten, bis die Hornhaut des Patienten einen Abstand von etwa fünf bis zehn Millimetern zur Tomokappe aufweist. Verwenden Sie dann die Höhen- und Seitenverstellknöpfe an der Kamerahalterung, um die Laserscankamera nach oben und unten sowie nach links und rechts zu bewegen, bis die Tomokappe mittig über der Hornhaut des Patienten positioniert ist. Bitten Sie nun den Patienten, die Augen so weit wie möglich zu öffnen.Bewegen Sie die Laserscankamera langsam auf den Patienten zu, bis die Tomokappe die Hornhaut des Patienten berührt. Überprüfen Sie an dieser Stelle, ob das rote Laserlicht in der Mitte der Hornhaut liegt und ob die Reflexion des Laserstrahls von der Hornhaut exakt am vorderen Pol der Hornhaut auftritt. Bei optimaler Einstellung besteht ein minimaler Kontakt zwischen Linse und Hornhaut.Eine dünne Gelbrücke zwischen der Tomokappe und der Hornhaut ist auf dem Live-Bild der CCD-Kamera sichtbar. Wenn der Druck zwischen der Tomokappe und der Hornhaut zu hoch ist, zeigt sich über die CCD-Kamera ein abgeflachtes Erscheinungsbild der Hornhaut. Live-Bild und Streuung erscheinen auf dem CCM-Bild.Nach der Anpassung des Patienten schalten Sie die HR Drei-Laser-Kamera ein, woraufhin das Bildaufnahmefenster auf dem Bildschirm erscheint. Verwenden Sie das CCD-Bild, um die Tomokappe und das Laserlicht auf der Hornhaut des Patienten zu positionieren. Das CCM verfügt über drei Optionen zur Bildaufnahme.Mit der Sequenzaufnahme können bis zu 100 Bilder mit einer einstellbaren Bildfrequenz aufgenommen werden. Es wird eine Bildfrequenz zwischen 30 und einem Bild pro Sekunde gewählt. Darauf basierend kann ein Film mit einer Dauer von drei bis 100 Sekunden aufgezeichnet werden.Im Volumenscan-Modus erfasst die Kamera automatisch eine Serie von 40 Bildern an aufeinanderfolgenden Fokusebenen. Es kann eine Gesamttiefe von 85 Mikrometern abgetastet werden, wobei der Fokusabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern etwa 2,1 Mikrometer beträgt. Die letzte Option ist der Schnittmodus, der für dieses Experiment verwendet wird.Dieser Modus ermöglicht eine optimale Bildgebung, bei der bei jedem Betätigen des Fußschalters klare Einzelbilder erfasst und gespeichert werden. Dieser Modus wird verwendet, um Bilder aus der gesamten Hornhautschicht einschließlich der Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut aufzunehmen. Nachdem eine ausreichende Anzahl an Bildern erfasst wurde, können andere Modi verwendet werden, darunter Sequenz- und Volumenaufnahmen.Nach einigen Scans kann die Fokusebene der Linse verändert werden, um die Tiefe einer Hornhautzelllage relativ zur Hornhautoberfläche zu messen, indem die epitheliale Zellschicht scharfgestellt und anschließend die Reset-Taste geklickt wird, um den Tiefenwert auf null zu setzen. Nach Abschluss der Untersuchung schalten Sie die Kamera aus, indem Sie im Erfassungsfenster auf die Kamerastromtaste klicken. Weisen Sie den Patienten darauf hin, die Augen nicht zu reiben, bis die lokale Anästhesie abgeklungen ist.Entfernen Sie die Tomokappe von der Kamera, entsorgen Sie sie und reinigen Sie anschließend die Objektivlinse des Mikroskops mit einem mit destilliertem Wasser angefeuchteten Wattestäbchen. Nun zeigen wir, wie man ein Bild analysiert und Parameter der Nervenfasern quantifiziert, um vorhandene Untersuchungen zu überprüfen und auszuwerten. Wählen Sie zunächst den entsprechenden Patientendatensatz im Datenbankfenster aus.Das Bildbetrachtungsfenster bietet eine Übersicht über vorhandene Hornhautuntersuchungen für den ausgewählten Patienten. Untersuchungen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, werden in separaten Besuch-Tabs gespeichert. Die drei verschiedenen Scantypen werden durch drei verschiedene Symbole dargestellt. Im HRT-Drei-Hornhaut-Besuch-Tab des Bildbetrachtungsfensters des Heidelberg Eye Explorer.Um das Hornhautbild zu überprüfen, doppelklicken Sie das entsprechende Bildsymbol und klicken Sie dann auf „anzeigen“, um die entsprechenden Bilder für eine weitere Analyse zu exportieren. Klicken Sie dazu auf „exportieren“ in der Symbolleiste und wählen Sie anschließend den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Da der Hauptfokus dieser Studie auf der Bowman-Schicht und den hornhautständigen Nerven liegt, werden ausschließlich die Bilder dieser Schicht analysiert. Für jeden Probanden werden fünf bis sechs Aufnahmen aus der Bowman-Schicht in unterschiedlichen Tiefen der Hornhaut ausgewählt.Die Bildanalyse erfolgt mit einer speziellen Software, die von unserer Gruppe entwickelt wurde und als CCM Image Analysis Tools, Version 0.64, bezeichnet wird. Die wichtigsten Parameter für die Hornhautnerven werden mit der Software ermittelt: die Nervenfaserdichte, definiert als die Anzahl der Hauptnerven pro Bildausschnitt. Die Nervenastdichte ist die Gesamtanzahl der Hauptäste pro Bildausschnitt. Die Nervenfasernlänge ist die Gesamtlänge der Hauptnerven und Hauptäste pro Bildausschnitt der Nervenfaser. Die Krümmung ist die Tortuosität der Hauptnerven pro Bildausschnitt. Um ein CCM-Bild zu öffnen, gehen Sie zu Datei und dann zu Öffnen.Nachdem das Bild geladen ist, werden seine Größe und sein Typ im Bildinformationsfeld oben links auf der Bedienoberfläche angezeigt, die Standardskalierung erscheint in der Bearbeitungszeile der Bildinformationen. Falls die Skalierung abweicht, ändern Sie die Zahl in der Bearbeitungszeile. Um mit der Analyse des Bildes zu beginnen, wählen Sie den gewünschten Messparameter aus dem Metrikfeld oben rechts auf der Bedienoberfläche aus.In dem Ergebnisfeld am unteren Seitenrand werden NFD und MBD als tatsächliche Zahl angegeben. NFL wird in Millimetern und die Tortuosität als Tortuositätskoeffizient dargestellt. Die Ergebnisse können in eine Excel-Tabelle exportiert werden.Wenn Sie die Excel-Seite öffnen, werden die Ergebnisse in Anzahl pro Quadratmillimeter für NFD und MBD in Millimeter pro Quadratmillimeter für NFL sowie als Tortuositätskoeffizient für NFT dargestellt. Um diese Messungen durchzuführen, markieren Sie zunächst jeden Hauptnerv, danach jeden Hauptnervenzweig. Schließlich verfolgen Sie jeden Nerv innerhalb des Bildausschnitts nach.Ein digitaler Stift kann zur Verbesserung der Genauigkeit verwendet werden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Minute durchgeführt werden, sofern das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Es ist wichtig, die detaillierten Anweisungen genau zu befolgen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man mit der konfokalen Mikroskopie der Hornhaut an der Bewegungsschicht der Hornhaut arbeitet, Bilder aus dieser Schicht aufnimmt und die Bilder bei Patienten mit peripherer Neuropathie, insbesondere diabetischer Neuropathie, quantifiziert und analysiert. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit CCM Fachkenntnisse erfordert und empfohlen wird, dass Fachkräfte, die in der Augenuntersuchung geschult sind, das Verfahren durchführen sollten.

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Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Das Protokoll für die dynamische Längs Bildgebung und Selective Laser Läsion des Nervenenden in Reporter-transgenen Mäusen wird vorgestellt.

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist in einer Vielzahl von Zuständen verändert, die manchmal in einem synaptischen Versagen gipfeln können. In diesem Bericht werden fluoreszenzmikroskopische Methoden zur Quantifizierung solcher Strukturveränderungen beschrieben.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Wir beschreiben den Einsatz der optischen Vollfeld-Kohärenzmikroskopie als eine Methode zur qualitativ hochwertigen Beurteilung des Hornhautspenderstromas. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Merkmale zu identifizieren, die auf Gesundheit oder Krankheit hinweisen, und zielt darauf ab, das Screening und die Auswahl von Spendergewebe und damit die Ergebnisse der Keratoplastik zu verbessern.

Optische Vollfeld-Kohärenzmikroskopie zur histologischen Analyse von Stromamerkmalen in Hornhauttransplantaten

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur morphometrischen Analyse neuromuskulärer Verbindungen durch kombinierte konfokale und STED-Mikroskopie, die zur Quantifizierung pathologischer Veränderungen in Mausmodellen von SMA und ColQ-bezogenen CMS verwendet wird.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Hornhautempfindlichkeitstests geben Aufschluss über die Gesundheit der Hornhautnerven und helfen bei der Diagnose von Erkrankungen der Augenoberfläche. Wir stellen ein prägnantes Protokoll zur qualitativen Bewertung der Hornhautempfindlichkeit vor, das von Augenärzten in klinischen Umgebungen problemlos verwendet werden kann.

Verfahren zur Untersuchung der Hornhautempfindlichkeit bei ophthalmologischen und optometrischen Patienten

Die Kapillaroskopie ist ein zugängliches Werkzeug für die direkte, kostengünstige und nicht-invasive Visualisierung von Mikrogefäßen. Ziel dieses Protokolls ist es, Forscher in die Lage zu versetzen, die Kapillaroskopie zur Visualisierung der peripheren mikrovaskulären Morphologie in den Nagelbetten von Mäusen zu nutzen.

Nicht-invasive Visualisierung der mikrovaskulären Nagelbettmorphologie bei Mäusen mittels Kapillaroskopie

Dieser Artikel zeigt die Funktionsweise und Wirkung der in vivo konfokalen Mikroskopie bei der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges und untersucht die Anwendung und Ergebnisse der in vivo konfokalen Mikroskopie, um eine Grundlage für zukünftige Forschungen zu schaffen.

Im lebenden Organismus Konfokale Mikroskopie in der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges: Ein Fokus auf bildgebende Protokolle und Interpretation

Lernen Sie die korneale konfokale Mikroskopie zur nicht-invasiven Quantifizierung von Nervenfaserschäden bei peripheren Neuropathien. Diese Methode ermöglicht die Beurteilung morphologischer Veränderungen kornealer Nervenfasern.

Corneal konfokale Mikroskopie: A Novel Non-invasive Technik zu Small Fibre Pathologie in peripheren Neuropathien Quantify

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