Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

Dieses Verfahren beurteilt in einem halbfesten Medium die Fähigkeit von hämatopoetischen Vorläuferzellen, sich zu vermehren und entlang verschiedener hämatopoetischer Linien zu differenzieren, um mit der Kultur zu beginnen. Frisch aufgetaute CD 34-positive Zellen in Gegenwart von Zytokinen, um die Aktivierung nach zwei Tagen zu fördern. Führen Sie eine retrovirale Transduktion eines GFP-exprimierenden Testkonstrukts durch, indem Sie die aktivierten CD 34-positiven Zellen auf eine mit dem Virus vorgeladene Platte geben.

48 Stunden später isolieren Sie die GFP-positiven Zellen per Fax, plattieren Sie diese Zellen dann mit halbfestem Methylcellulosemedium, das mit Wachstumsfaktoren versetzt ist, und inkubieren Sie etwa zwei Wochen lang, bis Kolonien an der Oberfläche erscheinen. Zum Schluss werden die Kolonien geerntet, die Zellen mit Cytosin auf Objektträgern immobilisiert und mit dem rechten Giza gefärbt, um die hämatopoetische Abstammung und das Reifestadium mikroskopisch zu bestimmen. Diese Methode kann mechanistische Einblicke in Studien zur Leukämogenese liefern, insbesondere zu den Auswirkungen von Onkogenen auf die hämatopoetische Differenzierung.

Um eine Kultur zu sehen, tauen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen CD 34-positiven Zellen schnell bei 37 Grad Celsius auf, indem Sie es leicht schütteln, bis ein letzter kleiner Eiskristall übrig bleibt, und geben Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die restlichen Zellen vorsichtig mit einem Milliliter Raumtemperatur und 2 % F-B-S-I-M-D-M-M Medium aus dem Fläschchen ab und geben Sie es tropfenweise in das 50-Milliliter-Röhrchen, während Sie es vorsichtig schwenken. Warten Sie nun drei Minuten.

Fahren Sie fort, indem Sie langsam zwei Milliliter Medium hinzufügen, während Sie vorsichtig mischen, und erneut drei Minuten lang äquilibrieren. Wiederholen Sie dieses Verfahren, indem Sie der verdünnten Zellsuspension in Abständen von drei Minuten Medien gleichen Volumens hinzufügen, zwischen den Zugaben vorsichtig schwenken, bis das endgültige Volumen 32 Milliliter erreicht, um die Zellen zu sammeln, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 250 g zentrifugieren und das Supernat entfernen, wobei etwa 0,5 Milliliter des Mediums über dem Pellet zurückbleiben. Fahren Sie mit dem einmaligen Waschen der Zellen fort, indem Sie das Pellet in 20 Millilitern Medium suspendieren und acht Minuten lang bei 200 g zentrifugieren. Bei Raumtemperatur entfernen Sie das Serum und suspendieren Sie die Zellen in vollständigem IMDM-Medium bei etwa einer halben Million Zellen pro Milliliter.

Um schließlich die Zellkonzentration zu bestimmen, nehmen Sie 10 Mikroliter der Suspension in ein Mikroröhrchen, das mit dem gleichen Volumen von 0,4 % Trianblaulösung gemischt wird, und zählen Sie. Unter Verwendung eines Hämozytometers verdünnen Sie die Zellen auf 10 bis fünf Zellen pro Milliliter durch Zugabe von vollständigem IMDM-Medium, das mit der Mischung aus aktivierenden Zytokinkulturen ergänzt wurde, die Zellen in einem befeuchteten 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für zwei Tage am Tag der Transduktion, zählen Sie die Zellen, bevor Sie mit dem Vorladen des Virus beginnen, um die Anzahl der Vertiefungen zu bestimmen, die vorbereitet werden müssen, um eine unbehandelte 24-Well-Gewebekulturplatte vorzubereiten. Geben Sie 400 Mikroliter à 25 Mikrogramm pro Milliliter Retro-Aktin-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Biosicherheitshaube.

Entfernen Sie die Retro-Aktin-Lösung und kodieren Sie jede Vertiefung mit 2%BSA, indem Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit die Virus-Stammlösungen auftauen und auf Eis lagern. Aspirieren Sie dann das BSA-Lösungsladungsvirus, indem Sie 0,5 Milliliter Viruspräparat in jede Vertiefung geben und 15 Minuten lang bei 2.200 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Nehmen Sie die Viruslösung aus den Vertiefungen und wiederholen Sie das Laden des Virus noch dreimal. Zum Schluss spülen Sie jede gut mit kaltem IMDM-Medium aus. Sammeln Sie nun die voraktivierten CD 34-positiven Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in frischem vollständigem IMDM-Medium, das mit Zytokinen aliquotiert ist, in jede der viruskodierten Vertiefungen, Vertiefungen und inkubieren Sie in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für zwei Tage, um die transduzierten Zellen schonend, aber gründlich zu ernten.

Suspendieren Sie die Zellen von den Virus-Floating-Platten und filtrieren Sie die Suspension durch einen 50-Mikron-Zellfilter in ein konisches Röhrchen. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikroröhrchen. Mischen Sie mit einem gleichen Volumen Trianblau-Lösung und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Spülen Sie jede Vertiefung mit 0,8 Milliliter kaltem HBSS mit 0,02 % EDTA und geben Sie es durch einen 50-Mikron-CEL-Trix-Zellenfilter in dasselbe Sammelröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie einmal mit kaltem HBSS. Suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in HBSS mit 1 % BA und halten Sie die Zellen im Dunkeln auf Eis für die anschließende Zellsortierung, die in der Regel auf einer Hochgeschwindigkeits-Zellsortieranlage auf der Grundlage eines experimentellen Designs durchgeführt wird.

Tauen Sie die erforderliche Anzahl von Aliquots des FCKW-Testmediums kräftig auf, wirbeln Sie es zum Mischen ein und lassen Sie das Röhrchen mindestens fünf Minuten lang stehen, damit die Blasen an die Oberfläche steigen können, bevor Sie Zellen hinzufügen. Nehmen Sie nun 3000 virustransduzierte sortierte Zellen in ein steriles Mikroröhrchen, das kalte 2%F-B-S-I-M-D-M-M-M-Medien enthält, und stellen Sie das endgültige Suspensionsvolumen auf 0,3 Milliliter ein. Suspendieren Sie die Zellen und überführen Sie die gesamte Zellsuspension in ein drei Milliliter Aliquot Methylkult-Wachstumsmedium.

Erzeugen Sie eine homogene Zellsuspension, indem Sie kräftig vortexen. Lassen Sie die Tube drei Minuten lang still stehen. Um die Zellen zu plattieren, befestigen Sie eine 16-Gauge-Nadel mit stumpfem Ende an einer Drei-Milliliter-Spritze und ziehen Sie 2,2 Milliliter.

Achten Sie darauf, dass keine großen Blasen aufgenommen werden, drücken Sie jeweils 1,1 Milliliter in zwei unbehandelte 30-Millimeter-Gewebekulturschalen und verteilen Sie die Mischung gleichmäßig, indem Sie doppelte Platten zusammen mit einer Wasserschale in eine 100-Millimeter-Platte legen. Fortgesetzt werden drei Liter sterile Wasserkultur für zwei Wochen. Charakterisieren und bewerten Sie die Völker nach ihrer Morphologie mit einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung in einer Kulturschale, die mit einem Bewertungsgitter markiert ist.

Um die Kulturergebnisse zu dokumentieren, scannen Sie die gesamte FCKW-Assay-Platte mit einem normalen Scanner bei 600 DPI und machen Sie mit einem inversen Mikroskop, das mit einer Farbkamera ausgestattet ist, mit einem inversen Mikroskop für die weitere Analyse der Differenzierung und Proliferation mikroskopische Aufnahmen von repräsentativen Kolonien mit geringer Vergrößerung. Zellen werden aus der gesamten FCKW-Assay-Platte gewonnen, indem in mehreren Volumina bei Raumtemperatur 2 %F-B-S-I-M-D-M gewaschen und für morphologische Analysen gezählt werden. Übertragen Sie 30.000 Zellen, die von FCKW-Assayplatten gewonnen wurden, auf einen Objektträger. Trocknen Sie die Objektträger mit einer STO-Schleuderzentrifuge über Nacht an der Luft, um die Objektträger effizient zu färben.

Richten Sie eine Montagelinie mit neun Färbegefäßen ein, die Lösungen in der folgenden Reihenfolge enthalten. Absolutes Methanol rechts Gemsa Stammlösung rechts Gemsa Puffer, 50% Methanol und Wasser, zwei Gefäße Wasser Phosphat Puffer pH sechs und schließlich zwei Gefäße Wasser. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerträger und tauchen Sie sie zwei Minuten lang in absolutes Methanol und überschüssiges Methanol in Blut.

Tauchen Sie sofort den Objektträgerträger ein und schreiben Sie die gemsa-Lagerlösung fünf Minuten lang. Den Träger in den richtigen Gemsa-Puffer mit einem pH-Wert von 6,4 überführen und 10 Minuten inkubieren. Tauchen Sie den Träger zweimal in 50%Methanol, 10 Mal in Wasser und weitere 10 Mal in das nächste Wassergefäß und dann fünfmal in Phosphatpuffer.

pH-Wert 6,0. Den Träger in Wasser geben und zwei Minuten inkubieren. Wiederholen Sie den Waschgang im letzten Wassergefäß.

Lassen Sie die Dias nun in der Trage vollständig an der Luft trocknen. Entfernen Sie jeden Objektträger und wischen Sie die Rückseite des Objektträgers mit methanolgetränkten Kim-Tüchern ab, um Flecken zu entfernen. Geben Sie einen Tropfen Cyto Seal 60 und ein Deckglas zum Versiegeln.

Führen Sie eine Differenzialzählung von 500 Zellen für jeden GM-Objektträger mit einem Mikroskop durch. Für die Zwecke dieses Experiments werden Zellen in fünf Kategorien eingeteilt: primitive Zellen, intermediäre myeloische Zellen, reife myeloische Zellen, intermediäre erythroide Zellen und reife erythroide Zellen. Im Vergleich zur Kontrollexpression der neuen 98 Falken erhöhte beispielsweise ein neun Onkogen die Bildung von roten erythroiden Kolonien.

Dieser Markteinfluss des Onkogens wird deutlich, wenn Kolonien unter geringer Vergrößerung beobachtet werden. Eine weitere morphologische Untersuchung durch GEM sustaining gibt Aufschluss über die Abstammung und den Reifegrad der Zellpopulation. In diesem Beispiel führte die Einführung neuer 98 Hawks, a neun zu einem Gesamtanstieg der Anzahl von Zellen mit erythroider Hyperplasie und hemmte die Hemmung sowohl der erythroiden als auch der myeloischen Reifung.

Diese SA bietet einen Einblick in die hämatopoetische Zelldifferenzierung, indem sie die Fähigkeit einer Eingangszellpräparation misst, sich in einem halbfesten Medium zu vermehren, zu differenzieren und Kolonien zu bilden.