Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Ich bin George Dimopoulos, und jetzt zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie Sie die Aidas GTI-Mücke mit dem Dengue-Virus infizieren können. Und das erste, was wir tun müssen, ist, das Virus in einer Aidas Aus-Zelllinie zu vermehren. Mein Name ist Jose Luis Ramirez und ich bin Doktorand in diesem Labor.

Für dieses Verfahren benötigen wir eine BSL two Facility mit einer Gewebekulturhaube, einen CO2-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Wir benötigen 50 ml konische Kunststoffröhrchen. Wir brauchen menschliches Serum, wir brauchen ein Wasserbad, eine 37 Grad Celsius, eine Zentrifuge.

Wir benötigen 96-Well-Platten und andere Standard-Molekularbiologie und Biochemie, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Dies ist also eine normale Gewebekulturhaube in einer BSL-Zwei-Anlage, und der erste Schritt besteht darin, die Zellen, die zu einer 80%igen Co-Flüssigkeit herangewachsen sind, in einem 75-Quadratzentimeter-Kolben zu entnehmen. Hierbei handelt es sich um ein MEM-Medium mit 10% Hitze, Hitze und aktiviertem fötalem Rinderserum, ergänzt mit 1%L-Glutamin und nicht-essentiellen Aminosäuren.

Okay, jetzt fügen wir den Zellen das Dengue-Virus hinzu. Wir haben den Virusvorrat aus dem minus 80 Grad Gefrierschrank genommen und auf einem 37 Grad heißen Inkubator auftauen lassen. Wir fügen den Zellen etwa 0,5 Milliliter Stammvirus hinzu, um eine Konzentration von etwa 1,5 Viruspartikeln pro Zelle zu erreichen.

Die Zellen werden dann für etwa 15 Minuten mit einer langsamen Schüttelgeschwindigkeit auf einen Schüttler gelegt. Anschließend werden die Zellen für etwa 45 Minuten in einen CO2-Inkubator gelegt. Bei 37 Grad Celsius beträgt die CO2-Konzentration 5%Nach der 45-minütigen Inkubation nehmen wir die Zellen heraus und fügen 30 ml Medium hinzu, und dann legen wir die Zellen in den Inkubator Wieder und inkubieren weitere fünf Tage.

Jetzt bereiten wir die Viruspartikel auf die Infektion vor. Zuerst müssen wir die Zellen mit einem Schaber aus dem Kolben lösen und dann zusammen mit einem Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Jetzt haben wir Zentrifugenzellen mit 12.000 U/min für 10 Minuten, um sie zu pelletieren.

Am Boden dieser Flasche können Sie das Pellet sehen. Als nächstes entfernen wir den Überstand und lassen nur einen ml bei den Zellen, um das Virus aus den Zellen freizusetzen. Wir werden sie einfrieren.

Dadurch werden die Zellen aufbrechen, und dann tauen wir sie auf und frieren sie dann wieder ein, und wir wiederholen diesen Vorgang drei- bis viermal, und das Einfrieren erfolgt auf Trockeneis. Nach dem Einfrieren werden die Zellpellets auf ein 37 Grad heißes Wasserbad gelegt, um sie aufzutauen, und dann werden sie zwischen jedem Gefrierschritt wieder auf den trockenen Augen eingefroren, WEP suspendiert die Zellen durch Vortexen. Nun sammeln wir den virushaltigen Überstand und fügen ihn dem Überstand aus der vorherigen Zentrifugation hinzu, der ebenfalls Viruspartikel enthält.

Dieses Viruspräparat kann nun mit einer gleichen Menge menschlichem Vollblut und Serum kombiniert werden. Hier haben wir das Viruspräparat mit menschlichem Vollblut kombiniert, das mit 15% menschlichem Serum ergänzt wurde. Diese Blutviruslösung wird jetzt verwendet, um die Mücken zu füttern und sie zu infizieren.

Wir werden dieses Blut in einen Membran-Feeder geben und dieser Membran-Feeder wird auf einen Becher mit den Mücken gestellt, und wir lassen die Mücken etwa 25 Minuten lang von diesem Blut fressen. Wir haben einen Clip an der Membranzuführung angebracht, um ihn zu stabilisieren. Er beschwert es quasi auf dem Netz, und wir geben nun das Blut in den Futternapf.

In einigen Fällen kann dieses Experiment besser funktionieren, wenn es im Dunkeln durchgeführt wird, da Mücken von Natur aus häufig im Dunkeln fressen. Das hängt natürlich davon ab, wie die Mückenkolonie konditioniert wurde. Die Mücken haben sich jetzt etwa 25 bis 30 Minuten lang gefressen, und wir können den Membranzubringer entfernen und zur Dekontamination in einen sicheren Behälter legen.

Nach der Blutanpassung müssen die untauglichen Mücken von den Fed-Mücken entfernt werden. Um dies zu tun, schlugen wir die Mücken nieder, indem wir die kleinen Becher mit den blutgefütterten Mücken für fünf bis 10 Minuten in einen Kühlraum stellten. Wie wir sehen können, sind die Mücken bereits unten in der Kälte.

Wir öffnen den Deckel und geben die Mücken in eine kleine Benzindose, die auf einem Eiskübel aufbewahrt wird, damit die Mücken die ganze Zeit über kalt bleiben und nicht entkommen können. Denken Sie daran, dass es sich um infizierte Mücken handelt, daher muss darauf geachtet werden, dass sie nicht frei gelassen werden. Sobald die Mücken unten im Kühlraum sind, bringen sie die Mücken in den normalen Insektory, der bei Raumtemperatur gehalten wird, aber wir setzen die Mücken immer in die Petroschale, die im Eiskübel aufbewahrt wird, damit sie dort sind, damit sie immer unten sind.

Sie können sehen, wie die Fed-Mücken von den UNFI-Mücken entfernt werden können. Bei den Fed-Staaten ist das Blut in sich. Sie sind vollständig vollgestopft.

Einige von ihnen haben sich teilweise von Blut ernährt, so dass sie nicht vollständig angeschwollen sind. Sie haben ein kleines Blut im Bauch, aber andere haben viel Blut im Bauch. Die UNFI-Attentäter haben kein Blut im Bauch, und so kann man leicht zwischen den Fed-Tieren und den Untauglichen unterscheiden.

Also werden wir diese Mücken aus der Benzinschale in die Wachslinie Pappbecher übertragen. Der nächste Schritt besteht darin, die Dengue-Virusinfektion in der Mücke zu testen. Wenn wir die Virusinfektion im Mitteldarm der Mücke untersuchen wollen, sollten wir die Mücken etwa am siebten Tag nach der Einnahme der Blutmahlzeit sezieren.

Und wenn Sie die Virusinfektion in der Sali-Drüse testen möchten, sollten wir die Mücken etwa 14 Tage nach der Blutfütterung sezieren, Jose zeigt Ihnen nun, wie man den Darm von der Mücke trennt. Die Mücken sind nun auf Eis betäubt worden, und wir werden sie durch eine Inkubation in 70%igem Ethanol für etwa eine Minute töten. Als nächstes setzen wir die Mücken in zwei aufeinanderfolgende Wasserbäder um.

Jeweils eine Minute. Damit soll das Ethanol von den Mücken weggespült werden. Jetzt werden wir die Mücken in PBS auf Objektträgern sezieren.

Der beste Weg, den Mitteldarm einer Gyp-Time-Mücke zu sezieren, besteht darin, die Mücke kopfüber auf ihre Flügel zu legen und mit einer Pinzette den Bauchteil und mit einer anderen Pinzette den Brustkorb zu greifen und dann an der Mücke zu ziehen. Jetzt zieht Jose die Mücke auseinander und der Darm kommt zwischen dem Bauch und dem thorakalen Teil der Mücke zum Vorschein. Nun ist der Darm das halbtransparente Gewebe, das auf dem oberen Teil der Mücke erschienen ist.

Nun werden wir den präparierten Darm in ein Zelllinienmedium überführen und in die Gewebekulturhaube bringen, um die Viruspartikel aus dem Darm zu isolieren. Wir bringen die präparierten Mitteldärme in den Gewebekulturraum und homogenisieren sie mit einem Stößel, um die Viruspartikel freizusetzen. Nach der Mitteldarmhomogenisierung fügen wir dem Homogenat Medium hinzu, um eine Verdünnung der Viruspartikel von eins bis 100 zu erreichen.

Dann verdünnen wir dies weiter auf eins bis 10, eins auf 101 bis 1000. In der 96-Well-Platte haben wir die Alba-Pikto-Zelllinie auf 80 % Co-Flüssigkeit in einer 24-Well-Platte vorbereitet. Dann entfernen wir den Supnatant aus den Hiatus alba picto-Zellen und fügen diesen Zellen die verdünnten Viruspartikel hinzu, um die Konzentration der Viruspartikel in jeder Verdünnung zu bestimmen.

Auf diese Weise können wir das Infektionsniveau des Virus bestimmen. Im Mitteldarm der Mücke werden die Zellen dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur langsam geschüttelt. Dann legen wir die Zellen für 45 Minuten in den 37 Grad heißen CO2-Inkubator.

Als nächstes fügen wir jeder Vertiefung ein ml 1%ige Methylcellulose-Auflage hinzu, und die Platte wird dann erneut fünf Tage lang bei 37 Grad CO2-Inkubator inkubiert. Nach der fünftägigen Inkubation geben wir jeweils einen ml eines Aceton-Methanol-Fixiermittels in jede Vertiefung. Dann inkubieren wir die Platte bei vier Grad Celsius im Kühlschrank für eine Stunde.

Als nächstes entfernen wir das Fixiermittel und waschen sie jeweils einmal gut mit PBS. Als nächstes führen wir eine Verdünnung des Anti-Dengue-Primärantikörpers von eins zu 1000 in einer 5%igen Blutlösung durch. Als nächstes fügen wir 200 Mikroliter dieser Antikörperlösung hinzu.

Zu jedem, bewege deinen Kopf. Danke. Als nächstes inkubieren wir die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes entfernen wir die Hyperimmunflüssigkeit und waschen jede Mulde gut mit einem XPBS.

Als nächstes wiederholen wir den Vorgang auf genau die gleiche Weise mit einem Sekundärantikörper. Wir bereiten 20 ml des Substrats gemäß dem Protokoll vor und geben es in einen Behälter. Dann geben wir 200 Mikroliter des Substrats in jede Vertiefung

Als nächstes stoppen wir die Reaktion, indem wir das Substrat entfernen und jeder Vertiefung einen ml destilliertes Wasser hinzufügen. Dann entsorgen wir das Wasser von der Platte und lassen die Platte trocknen. Jeder Farbpunkt repräsentiert eine Plaque von Viren, und durch das Zählen dieser Plaques können wir die Anzahl der Viruspartikel schätzen, die sich im ursprünglichen Mitteldarm der Mücke befanden, die wir homogenisiert haben.

Wir haben Ihnen gerade das Verfahren gezeigt, wie Sie eine Dengue-Virus-Infektion bei aegypti-Mücke durchführen. Dieses Protokoll beinhaltet die Produktion von Viren in der Mückenzelllinie. Die Viruspartikel werden dann aus der Zelllinie gereinigt und isoliert, mit menschlichem Vollblut vermischt und an die Mücken verfüttert.

Das Virus infiziert die Mücken und sobald die Infektion festgestellt wurde, haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie das Mitteldarmgewebe der Mücke isolieren und wie Sie den Infektionsgrad dieses Mitteldarms bestimmen können. Wir homogenisieren im Grunde den Mitteldarm und nutzen das Verfahren, um die Viruspartikel aus diesem Mitteldarm freizusetzen. Dann verwenden wir diese Viruspartikel, um die Mückenzelllinie erneut zu infizieren, um das Infektionsniveau des Mitteldarms zu bestimmen, also die Anzahl der Viruspartikel, die den Mückendarm infiziert haben.