Name: Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Lernen Sie ein Protokoll zur Dengue-Infektion von Aedes aegypti-Mücken zur Untersuchung viraler Infektionsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Viruslasten in Mitteldarm und Speicheldrüsen.

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A. Propagate das Virus in den C6/36 Zelllinie. <ol><li> Zellen wachsen zu 80% Konfluenz in 75 cm 2-Kolben; </li><li> Entfernen Sie die Medien mit 3-4 ml im Kolben verbliebene; </li><li> Nehmen Sie 0,5 ml Lager Virus und fügen in die obige Zelle mit der Multiplizität der Infektion von 1,5 Viruspartikeln pro Zelle. Schütteln der Flasche für 15 Minuten langsam auf Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren für 45 Minuten bei 5% CO 2 und 37 ° C </li><li> 30 ml Medien und Inkubation für 5 Tage. </li></ol> B. Vorbereiten der Mischung von Virus und Blut <ol><li> Lösen Sie die Zelle mit dem Schaber und übertragen Sie die Zelle und Medien, um die 50 ml konische Röhrchen; </li><li> Zentrifugat bei 800g für 10 Minuten; den Überstand, aber lassen Sie 1 ml Überstand mit dem Zellpellet; </li><li> Frieren Sie den oben Zellpellet in trockenen CO 2 und dann Tauwetter in den 37 ° C Wasserbad, wiederholen zwei vor drei Mal; </li><li> Zentrifugat bei 800g für 10 Minuten, nehmen Sie den Überstand und verbinden sich mit dem Überstand aus Schritt 3 gesammelt; </li><li> Sammeln menschlichem Vollblut mit dem gleichen Verfahren (Schritt 3) für die Herstellung von gametocyte Kultur Anopheles-Mücke mit Plasmodium falciparum infiziert; </li><li> Kombinieren Sie die gleiche Menge der oben menschlichem Vollblut mit dem Virus Überstand aus Schritt 4, und fügen menschlichem Serum (10% des gesamten Volumens). </li><li> Inkubieren Sie die obige Mischung von menschlichem Blut und Dengue-Virus für 30 Minuten bei 37 ° C Wasserbad </li></ol> C. Fütterung Moskitos Dieses Verfahren ist nahezu identisch zu dem, was in dem Abschnitt für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken beschrieben worden. Wir Assay Mitteldarm Infektion an Tag 7, und der Speichel-Infektion an Tag 14 nach Blut-Fütterung. Alle Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kam zunächst mit 75% Ethanol und dann mit 10% Bleichmittel behandelt. D. Assay der Virustiter in Mücke Gewebe <ol><li> Zwei oder drei Tage vor dem Sezieren von Moskito Gewebe wachsen C6/36 Zellen in einer 24-Well-Platte, so dass die Zelle 80% Konfluenz am Tag, wenn der Test durchgeführt wird erreicht; </li><li> Moskitos sind bei 4 ° C betäubt, getötet und tauchte sterile durch Einweichen in 75% Ethanol für 1 Minute. Dann Mücken wurden mit sterilem Wasser zweimal, bevor Dissektion der Mitteldarm oder Speicheldrüse unter dem Binokular gewaschen. Von diesem Schritt muss alle Schritte aus, um in einer sterilen Umgebung wie eine biologische Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Diese Gewebe werden in ein Röhrchen mit 150 ul Medium übertragen und homogenisiert mit einem Kontes Pellet Pistill Motor für 90 Sekunden; </li><li> Machen Sie eine 1:100 Verdünnung durch Zugabe von 10 ul des Homogenat in 990 ul Medien; </li><li> Machen Sie weiter 1: 10, 1:100 und 1:1000 Verdünnung mit dem Medium in der 96-Well-Platte; </li><li> Entfernen Sie die Medien in den 24-Well-Platte und 100 ul von jedem der vier oben genannten Verdünnungen auf die jeweils gut; </li><li> Schütteln Sie die Platte langsam für 15 Minuten bei Raumtemperatur, dann 45 Minuten bei 5% CO 2 inkubiert und 37 ° C; </li><li> 1ml von methycellulose Overlay (1%) in jede Vertiefung; </li><li> Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 5 Tage; </li><li> Die Schritte von hier aus benötigen keine sterile Umgebung, sondern wie bei jedem anderen Erreger Pflege muss jederzeit berücksichtigt werden. Discard methycellulose Overlay von jeder Platte und Blot, um überschüssige Medien entfernen </li><li> Add 1 ml Methanol / Aceton Fixativ (1:1) in jede Vertiefung. Halten Sie bei 4 ° C für 1 Stunde; </li><li> Abgießen Fixativ, und waschen Sie einmal mit 1X PBS; </li><li> Machen 1:1000 Verdünnung an den primären Antikörper gegen das Virus mit 5% blotto; </li><li> Add 200 ul verdünnt hyperimmune Flüssigkeit in jede Vertiefung, bei 37 ° C inkubieren für 1 Stunde; </li><li> Entfernen hyperimmune Flüssigkeit und waschen Teller mit 1 X PBS </li><li> Bereiten Sie eine 1:1000 Verdünnung von Ziegen-anti-Maus-Konjugat (KPL Cat # 074-1806) in 5% blotto (5g Magermilchpulver in 100 ml 1 X PBS), und fügen Sie dann 200 ul in jede Vertiefung und inkubieren 37 ° C für 1 Stunde; </li><li> Bereiten Substrat wie folgt: Fügen Sie 1 Tablette 3&#39;-Diaminobenzidin terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) in 20 ml 1 X PBS nach aufgelöst, und fügen Sie dann 8 ul von 30% Wasserstoffperoxidase </li><li> Geben Sie 200 ul der oben genannten Substrat in jede Vertiefung. Stehen lassen bei Raumtemperatur für 10 Minuten </li><li> Entfernen Substrat und Stop-Reaktion durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser in jede Vertiefung </li><li> Abgießen und Blot-Platten zum Trocknen </li><li> Zählen Sie die Viruspartikel </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Brutschrank</td><td></td><td></td><td></td><td>mit 5 % CO2, 37 °C</td></tr><tr><td>50-ml-Konischgefäße</td><td></td><td></td><td></td><td>Kunststoff</td></tr><tr><td>Pipettenspitze</td><td></td><td></td><td></td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Pipettman</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td></td><td></td><td></td><td>Glas, steril</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td><td>37 °C</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkulationswasserbad</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glassmembranfütterungsapparate</td><td></td><td></td><td></td><td>mit Gummischlauch zur Befestigung der Fütterungsapparate</td></tr><tr><td>Mückenbecher</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 % Ethanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % Bleichmittel</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td></td><td></td><td></td><td>6-Well-, 24-Well- und 96-Well-Platten</td></tr><tr><td>Petri-Schale</td><td></td><td></td><td></td><td>Glas</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feinspitzzange</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1×, steril</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36-Zellen</td><td>Zellen</td><td></td><td></td><td>Zur Virusvermehrung</td></tr><tr><td>C6/36-Medium</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 1 % L-Glutamin und nicht essentiellen Aminosäuren sowie 1 % (V/V) Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 Tablette in 20 ml 1× PBS auflösen und dann 8 &amp;#x03BC;l 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung hinzufügen</td></tr><tr><td>30 %ige Wasserstoffperoxidlösung</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Mücke</td></tr></tbody></table>

protokoll für dengue-infektionen in mücken (aedes aegypti) und infektionsbiologie phänotyp bestimmung

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Der Zweck dieses Verfahrens ist es, die Aedes Mücke mit Dengue-Virus zu infizieren in einem Labor untersuchen Zustand und die Infektion Niveau und Dynamik des Virus in der Mücke Gewebe. Dieses Protokoll wird routinemäßig zur Untersuchung von Moskito-Virus-Interaktionen, insbesondere für die Identifizierung neuer Host Faktoren, die in der Lage, Vektor-Kompetenz bestimmen werden. Der gesamte Versuch ist nach einem BSL2 Labor durchgeführt werden. Ähnlich wie bei Plasmodium falciparum-Infektionen, müssen angemessene Kleidung einschließlich der Handschuhe und Kittel jederzeit getragen werden. Nach dem Experiment, müssen alle Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kam mit 75% Ethanol und gebleicht, bevor Sie mit normalem Waschen behandelt werden. Alle anderen Materialien müssen vor der Entsorgung zu autoklavieren.

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, die Aedes-Mücke unter Laborbedingungen mit dem Dengue-Virus zu infizieren und die Infektionsrate sowie die Dynamik von ... zu untersuchen.

Ich bin George Dimopoulos, und jetzt zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man die Aidas GTI-Mücke mit dem Dengue-Virus infizieren kann. Als Erstes müssen wir das Virus in einer Aidas Aus-Zelllinie vermehren. Mein Name ist Jose Luis Ramirez, und ich bin Doktorand im Ous-Labor.Für dieses Verfahren benötigen wir eine BSL-2-Anlage mit einem Zellkulturwerkbank, einem auf 37 Grad Celsius eingestellten CO2-Inkubator. Wir benötigen 50-ml-Kunststoffkonischgefäße. Wir benötigen menschliches Serum, ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und einen Zentrifugenapparat.Wir benötigen 96-Well-Platten sowie andere Standardreagenzien und Verbrauchsmaterialien der Molekularbiologie und Biochemie. Dies ist eine reguläre Zellkulturhaube in einer BSL-Stufe-2-Einrichtung, und der erste Schritt besteht darin, die Zellen aus einem 75 cm²-Fläschchen abzunehmen, die eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Es handelt sich um MEM-Medien mit 10 % hitzebehandltem und aktiviertem fetalem Kälberserum, ergänzt mit 1 % L-Glutamin und nicht-essentiellen Aminosäuren.Okay, jetzt werden wir das Dengue-Virus zu den Zellen hinzufügen. Wir haben die Virusstammlösung aus dem minus 80-Tiefkühler entnommen und sie in einem 37-Grad-Inkubator aufgetaut. Wir geben etwa 0,5 Milliliter der Virusstammlösung zu den Zellen, um eine Konzentration von etwa 1,5 Viruspartikeln pro Zelle zu erreichen.Die Zellen werden anschließend etwa 15 Minuten lang bei langsamer Schüttelgeschwindigkeit auf einen Schüttler gestellt. Danach werden die Zellen etwa 45 Minuten lang in einen CO2-Inkubator gegeben. Bei 37 Grad Celsius beträgt die CO2-Konzentration 5 %. Nach der 45-minütigen Inkubation nehmen wir die Zellen heraus, geben 30 ml Medium hinzu und stellen die Zellen erneut in den Inkubator, wo sie weitere fünf Tage inkubiert werden.Jetzt bereiten wir die Viruspartikel für die Infektion vor. Zunächst müssen wir die Zellen mit einem Abstreifer vom Kolben lösen und sie zusammen mit dem Medium in einen 50-ml-Kegelrohr überführen. Anschließend zentrifugieren wir die Zellen bei 12.000 U/min 10 Minuten lang, um sie zu pelletieren.Am Boden dieser Flasche sehen Sie das Pellet. Als Nächstes werden wir den Überstand entfernen und nur ein ml mit den Zellen belassen, um das Virus aus den Zellen freizusetzen. Danach werden wir sie einfrieren.Dadurch werden die Zellen lysiert, anschließend tauen wir sie auf und frieren sie erneut ein. Dieses Verfahren wiederholen wir drei bis vier Mal, wobei das Einfrieren auf Trockeneis erfolgt. Nach dem Einfrieren wird das Zellpellet in einem 37-Grad-Wasserbad zum Auftauen gebracht und danach erneut auf Trockeneis eingefroren. Zwischen jedem Einfrierschritt suspendieren wir die Zellen durch Vortexen. Nun sammeln wir das virushaltige Überstandsmaterial und geben es zum Überstand der vorherigen Zentrifugation hinzu, der ebenfalls Viruspartikel enthält.Diese Viruspräparation ist nun bereit, mit einer gleichen Menge vollständigem menschlichem Blut und Serum kombiniert zu werden. Hier haben wir die Viruspräparation mit vollständigem menschlichem Blut versetzt, das mit 15 % menschlichem Serum ergänzt wurde. Diese Blut-Virus-Lösung wird nun verwendet, um die Mücken zu füttern und sie zu infizieren.Wir werden dieses Blut in einen Membranfütterer geben, und dieser Membranfütterer wird auf einen Becher mit den Mücken gestellt. Die Mücken können dann etwa 25 Minuten lang von diesem Blut fressen. Am Membranfütterer wurde eine Klammer angebracht, um ihn zu stabilisieren. Im Wesentlichen beschwert sie den Fütterer auf dem Netz. Nun fügen wir das Blut in den Fütterer hinzu.In einigen Fällen kann dieses Experiment besser verlaufen, wenn es im Dunkeln durchgeführt wird, da Mücken natürlicherweise häufig im Dunkeln fressen. Dies hängt natürlich davon ab, wie die Mückenkolonie konditioniert wurde. Die Mücken haben nun etwa 25 bis 30 Minuten lang gefüttert, und wir können den Membranfütterer entfernen und in einen sicheren Behälter zur Dekontamination bringen.Nach der Blutmahlzeit müssen die ungeeigneten Mücken von den gesättigten entfernt werden. Dazu betäubten wir die Mücken, indem wir die kleinen Becher mit den blutgefütterten Mücken für fünf bis zehn Minuten in einen Kühlschrank stellten. Wie wir sehen können, sind die Mücken bereits durch die Kälte betäubt.Wir öffnen den Deckel und überführen die Mücken in eine kleine Petrischale, die auf einem Eisbehälter steht, damit die Mücken während des gesamten Vorgangs kühl gehalten werden und nicht entkommen können. Beachten Sie, dass es sich um infizierte Mücken handelt, weshalb äußerste Vorsicht geboten ist, um sicherzustellen, dass sie nicht freikommen. Sobald sich die Mücken im Kühllabor befinden, überführen wir sie in das normale Insektarium, das bei Raumtemperatur gehalten wird. Allerdings stellen wir die Mücken stets in die Petrischale, die auf dem Eisbehälter steht, damit sie sich kontinuierlich in gekühltem Zustand befinden.Sie können sehen, wie die gesättigten Mücken von den ungefütterten UNFI-Mücken getrennt werden können. Die gesättigten Mücken enthalten das Blut. Sie sind vollständig aufgefüllt.Einige von ihnen haben teilweise Blut aufgenommen, sodass sie nicht vollständig aufgequollen sind. Sie haben eine kleine Menge Blut in ihrem Abdomen, während andere viel Blut im Abdomen enthalten. Die UNFI-Exemplare weisen kein Blut in ihrem Abdomen auf, weshalb man leicht zwischen den gefütterten und den ungefütterten Tieren unterscheiden kann.Wir überführen diese Mücken von der Petrischale in die Wachslinien-Pappbecher. Der nächste Schritt besteht darin, die Dengue-Virusinfektion in der Mücke zu bestimmen. Wenn wir die Virusinfektion im Mückenmitteldarm untersuchen möchten, sollten wir die Mücken etwa sieben Tage nach der Blutmahlzeit dissezieren.Und wenn Sie die Virusinfektion in der Speicheldrüse untersuchen möchten, sollten wir die Mücken etwa 14 Tage nach der Blutmahlzeit dissezieren. Jose wird Ihnen nun zeigen, wie man den Darm aus der Mücke herauspräpariert. Die Mücken wurden nun auf Eis anästhesiert und werden durch eine Inkubation in 70 % Ethanol für etwa eine Minute getötet. Anschließend überführen wir die Mücken in zwei aufeinanderfolgende Wasserbäder.Jeweils eine Minute. Dies dient dazu, das Ethanol von den Mücken zu entfernen. Nun werden wir die Mücken in PBS auf Objektträgern dissezieren.Die beste Methode, den Mitteldarm aus einer Gyp-Zeit-Mücke zu präparieren, besteht darin, die Mücke rücklings auf den Flügeln liegend abzulegen und mit einer Pinzette den Bauchteil und mit einer weiteren Pinzette das Thorax zu fassen und dann die Mücke auseinanderzuziehen. Nun zieht Jose die Mücke auseinander, und der Darm erscheint zwischen Abdomen und dem thorakalen Teil der Mücke. Der Darm ist das halbtransparente Gewebe, das im oberen Bereich der Mücke sichtbar geworden ist.Jetzt überführen wir den dissezierten Darm in ein Zellkulturmedium und bringen ihn in die Gewebekulturhaube, um die Viruspartikel aus dem Darm zu isolieren. Wir bringen die dissezierten Mitteldärme in den Gewebekultursaal und homogenisieren sie mit einem Stößel, um die Viruspartikel freizusetzen. Nach der Homogenisierung des Mitteldarms fügen wir Medium zum Homogenat hinzu, um eine Verdünnung der Viruspartikel von 1 zu 100 zu erreichen.Dann verdünnen wir dies weiter im Verhältnis 1 zu 10, 1 zu 100 und 1 zu 1000. In der 96-Well-Platte haben wir die Alba-picto-Zelllinie in einer 24-Well-Platte bis zu 80 % Konfluenz kultiviert. Anschließend entfernen wir das Überstandmedium von den Hiatus-alba-picto-Zellen und geben den verdünnten Viruspartikeln zu diesen Zellen hinzu, um die Konzentration der Viruspartikel in jeder Verdünnung zu bestimmen.Dies ermöglicht es uns, den Infektionsgrad des Virus zu bestimmen. Im Mückenmitteldarm werden die Zellen anschließend 15 Minuten lang langsam bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach geben wir die Zellen für 45 Minuten in den 37 Grad CO2-Inkubator.Anschließend geben wir je ein ml einer 1 %igen Methylcellulose-Überlagerung in jede Vertiefung, und die Platte wird erneut fünf Tage lang im CO2-Inkubator bei 37 Grad inkubiert. Nach der fünf tägigen Inkubation fügen wir je ein ml eines Aceton-Methanol-Fixans in jede Vertiefung hinzu. Danach inkubieren wir die Platte eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Kühlschrank.Danach entfernen wir das Fixativ und waschen jede Vertiefung einmal mit PBS. Anschließend stellen wir eine 1:1000-Verdünnung des primären Anti-Dengue-Antikörpers in einer 5 %-Blutlösung her. Danach geben wir 200 Mikroliter dieser Antikörperlösung hinzu.Zu jedem Gut bewegen Sie Ihren Kopf. Danke. Als Nächstes inkubieren wir die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Danach entfernen wir die hyperimmune Flüssigkeit und waschen jedes Gut mit einem XPBS. Anschließend wiederholen wir den Vorgang auf exakt dieselbe Weise mit einem sekundären Antikörper. Wir bereiten 20 ml des Substrats gemäß der Anleitung vor und geben es in einen Behälter. Danach fügen wir 200 µL des Substrats zu jedem Well hinzu.Danach stoppen wir die Reaktion, indem wir das Substrat entfernen, und geben je ein ml destilliertes Wasser in jede Vertiefung. Anschließend entsorgen wir das Wasser von der Platte und lassen die Platte trocknen. Jeder farbige Punkt stellt eine Plaque von Viren dar, und durch das Zählen dieser Plaques können wir die Anzahl der Viruspartikel schätzen, die im ursprünglichen Mitteldarm der Mücke enthalten waren, die wir homogenisiert haben.Wir haben Ihnen soeben die Vorgehensweise zur Durchführung einer Dengue-Virus-Infektion in Aedes aegypti-Mücken gezeigt. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung des Virus in einer Mückenzelllinie. Die Viruspartikel werden anschließend aus der Zellkultur gereinigt und isoliert, mit menschlichem Vollblut vermischt und den Mücken verabreicht.Das Virus wird die Mücken infizieren, und sobald die Infektion etabliert ist, haben wir Ihnen gezeigt, wie man das Mitteldarmgewebe der Mücke isoliert und wie man den Infektionsgrad dieses Mitteldarms bestimmt. Im Wesentlichen homogenisieren wir den Mitteldarm und wenden das Verfahren an, um die Viruspartikel aus diesem Mitteldarm freizusetzen. Anschließend verwenden wir diese Viruspartikel, um erneut eine Mückenzelllinie zu infizieren, um so den Infektionsgrad des Mitteldarms und die Anzahl der Viruspartikel zu bestimmen, die den Mückenmitteldarm infiziert haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll zeigt eine Methode, mit der James-Labor verwendet werden, um dsRNA in weibliche A. aegypti Moskitos, die Dengue-Virus Hafen zu injizieren. Die Technik für die Kalibrierung von Injektionsnadeln, die Manipulation der Injektion Setup, und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

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Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Ein Protokoll zur Kultur des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis. Der Parasit wird von einer Generation von Aedes aegypti-Mücken zur nächsten durch horizontale Übertragung im Larvenstadium geleitet, gefolgt von vertikaler Übertragung im Erwachsenenstadium. Lebende Sporoplasmen überleben langfristig in infizierten Eiern.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Lernen Sie ein Protokoll zur Dengue-Infektion von Aedes aegypti-Mücken zur Untersuchung viraler Infektionsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Viruslasten in Mitteldarm und Speicheldrüsen.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

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