Name: Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Zellzählung mit dem Scepter Cell Counter für präzise Zellkultur-Experimente. Diese Methode verbessert Reproduzierbarkeit und Genauigkeit gegenüber manuellen Verfahren.

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1. Die Bedeutung der Zellzählung <ol><li> Zählen von Zellen ist eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur. </li><li> Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. </li><li> Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays. </li><li> Trotz der Notwendigkeit einer Geschwindigkeit und Genauigkeit in Zellzählung,, 71% von 400 befragten Forscher zählen Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt. </li><li> Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate. </li><li> Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte. Doch für die meisten Forscher, ist der Preis, mit diesen großen Tisch-Instrumenten verbundenen ein Hindernis für ihre Verwendung. </li><li> Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet. </li><li> Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung. </li><li> Der Einweg-Sensor ist mit einem mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt. </li><li> Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, das Zepter Zellzähler grafisch Zelle Bevölkerungsstatistik als Histogramm. </li></ol> 2. Erstellung eines Single-Zell-Suspension für Counting <ol><li> So verwenden Sie das Zepter Zellzahl, die durch Verdünnen einer Zellsuspension von Zellen beginnen, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Eine Konzentration von 10,000-500,000 Zellen pro ml ist optimal. </li><li> Transfer 100 ul der verdünnten Zellen zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Performing Zellzahlen mit dem Scepter <ol><li> Schalten Sie das Zepter Zellzahl durch Drücken und Halten der Kipphebel an der Rückseite des Gerätes und warten auf die Anweisungen auf dem Bildschirm zu erscheinen. </li><li> Wenn Sie aufgefordert werden, legen einen Sensor, um das Ende der Szepter Einheit mit der Elektrode sensing Panel zugewandten Vorderseite des Gerätes. </li><li> Scepter Sensoren bestehen aus einer präzisionsgepresste Messkammer, mit einem elektronischen Schutzfeld und integrierten Zell-Sensing-Elektroden. Die Sensoren machen es möglich, Zellgröße bei Submikrometerauflösung diskriminieren und Zellvolumen bei sub-Picoliter-Auflösung. </li><li> Konsequente Sensorik, sorgt dafür, dass gleich Probenvolumina gezählt werden und genaue Größe Messungen vorgenommen werden. </li><li> Sobald der Sensor angebracht ist, führen Sie jeden Schritt der Zählvorgang nach den Anweisungen auf dem Bildschirm wie folgt: </li><li> Wenn auf dem Bildschirm liest "Halten Sie den Kolben zu beginnen", drücken Sie den Kolben. Der Bildschirm wird dann zu lesen "tauchen den Sensor." Tauchen Sie den Sensor in die Zellsuspension Lösung und lassen Sie die Kolben, um die Zellsuspension in den Sensor absaugen. </li><li> Der Kolben dient als ein elektrisches Signal und wird die Probe plus Totvolumen in den Sensor zu ziehen. Die Geschwindigkeit und Genauigkeit zu stürzen spielt keine Rolle, wie es mit Pipettieren tut. Dieser Prozess wird einige Sekunden dauern. Wenn Sie fertig sind, wird das Instrument Signalton und "Sample geladen" wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Nachdem die Probe in den Sensor es durch das Schutzfeld gezogen wird, um Zellgröße und Zellvolumen zu beurteilen, dann durch die Mikrokanäle geladen. Nach 50 ul Probe zählte die Sensor teilt dem Instrument, um aufhören zu zählen. </li><li> Nach der Zählung abgeschlossen ist, wird das Instrument auf den Bildschirm zu lesen "Count Complete. Bitte entfernen Sie Sensor und zu verwerfen." Befolgen Sie die Eingabeaufforderung, und entfernen und entsorgen Sie den Sensor. </li><li> Das Gerät zeigt dann ein Histogramm der Zellgröße oder Durchmesser auf dem Bildschirm sowie die Zellkonzentration pro mL. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Nach der Zählung abgeschlossen ist und das Histogramm auf dem Instrument angezeigt, gelten Toren, indem Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion. Wählen Sie "auto Gating" oder "Verwendung letzten" entweder automatisch das Tor auf das Histogramm-Profil basiert, oder bis vor die Tore der letzten Zählung verwenden. </li><li> Unabhängig von der Auswahl, kann das Tor manuell auf die Feinabstimmung der Daten bewegt werden. Drücken Sie die Schaltfläche mit Umschaltfunktion wieder auf der linken Tor markieren und scrollen zuggle das Tor zu bewegen, wie gewünscht. </li><li> Dann drücken Sie die Schaltfläche erneut, um die richtige Tor zu aktivieren und blättern Sie auf die Schaltfläche auf der rechten Tor statt. Klicken Sie erneut auf, eine neue Zellkonzentration, durchschnittliche Zellvolumen und Durchmesser wird angezeigt. </li><li> Das Umschalten kann auch auf beiden Seiten bewegt werden, um die Anzeige zwischen Tag-Schalter, Zeit, mittlere Zellgröße und mittlere Zellvolumen. </li><li> Bis zu 72 Histogramme können auf dem Gerät selbst gespeichert werden. Zum Hochladen der Daten auf einen PC, schließen Sie das Gerät über das USB-Kabel-Anschluss auf dem Bildschirm. </li><li> Auf dem PC, doppelklicken Sie auf das Zepter Software-Anwendung, um die Software starten Sie dann auf "connect". Alle zählt automatisch in die Software-Port. </li><li> Das Zepter Application Software zeigt das Histogramm detailliert die Verteilung der Bevölkerung der Kultur in entweder Volumen oder Durchmesser. Heruntergeladene Dateien können dann in Microsoft Excel, wo die Rohdaten in Behältern von spezifizierten Zelldurchmesser oder Zellvolumina angezeigt werden exportiert werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Neunzehn verschiedene Zelllinien wurden für die Zählung vorbereitet und theoretische Ausgangspunkt Konzentrationen wurden mit einem Coulter Counter. Diese Zellsuspensionen wurden dann weiter verdünnt, um Zellsuspensionen auf theoretische Zelle Konzentrationen zu erhalten. </li><li> Das Zepter Zellzahl wurde dann zur Zelle Konzentrationen zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt die 5 Verdünnungen, die für 5 repräsentative Zelllinien zusammen mit den theoretischen Zellkonzentration gemessen wurden. </li><li> Die hohe Linearität durch die R2-Werte angegeben, zeigt, dass Scepter das Zählen ist eine zuverlässige Methode für die Zelllinien getestet, über einen weiten linearen Arbeitsbereich. </li><li> Die relative Genauigkeit der Scepter Zählen ist in Abbildung 2, in denen Daten aus Scepter Zählen erhalten mit Zählungen von Coulter Counting verglichen werden aufgezeigt. </li><li> Das Protokoll der Scepter Zellzahl ist gegen den log der Coulter zählt aufgetragen, und zeigt, dass in allen getesteten Zelllinien, match Scepter zählt Coulter zählt. </li><li> Grafen von 19 Zell-Linien wurden mit einem Coulter Counter Z2, das Zepter Zellzahl, eine automatisierte Vision-basierte Zähler wie Vi-Cell oder Unzählige System und eine hemocytemeter. </li><li> Counts wurden nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, unter Verwendung der gleichen Zelle Ausgangs-Suspension und identischen Verdünnungen. Die Ergebnisse in Abbildung 3 dargestellt zeigen, dass die Zellkonzentration von Scepter Zählen ehesten entsprechen theoretischen Zellkonzentrationen mit hoher Linearität gemessen. </li><li> Der prozentuale Variationskoeffizient oder CV, wurde für jede Verdünnung von jeder Zelllinie für jeden Zählsystem berechnet. Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche% CVs über 19 Zelllinien, die mit Bezug auf die Zellkonzentration und Zählweise. </li><li> Innerhalb der Reichweite, wird das Zepter Zellzähler genauer als Vision basiert Zählkammer gezählt, die kleinere Standardabweichungen und kleineren mittleren Variationskoeffizienten. </li><li> Scepter Zählen ist zehnmal schneller als hemocytometry und schneller als andere automatisierte Zähler zu. In Abbildung 5, SF9, MCF7 und HEK293-Zellen wurden gezählt unter Verwendung der Methoden in diesem Video beschrieben. </li><li> Die durchschnittliche Zeit für die Zellkonzentration zu messen, wurde aufgezeichnet. Beachten Sie, dass hemocytometry nur einmal wurde pro Probe durchgeführt. </li><li> Scepter macht Messungen an Zellgröße basiert. Dadurch entfallen jegliche Änderungen in der Zellmorphologie kann im Histogramm erfasst werden. Gesunde Kulturen zeigen eine schöne glockenförmige Gauss-Verteilung, während ungesunde Zellen zu lysieren und zu einer Verschiebung in das Histogramm auf der linken Seite (Abb. 6, links). </li><li> Ebenso, wenn eine Bevölkerung von 50% tote Zellen mit 50% lebenden Zellen wurden gemischt, wurden Histogramm Verschiebungen beobachtet (Abbildung 6, rechts). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="Abbildung 1"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="Abbildung 2"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="Abbildung 3"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="Abbildung 4"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="Abbildung 5"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="Abbildung 6"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="Abbildung 7">

<ol><li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarghshoon%2C+S+%22Cell+Counting+Survey%22">Cell Counting Survey</a>. , Millipore. (2009).</li>
<li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+hybridoma+cell+number%2C+viability%2C+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb+Technol%22%5BJournal%5D)">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li>
<li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHouwen%2C+B+%22Fifty+years+of+hematology+innovation%3A+the+Coulter+principle%22">Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle</a>. , Medical Laboratory Observer. (2003).</li>
</ol>

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sonia Gil, und Grace Johnston von Millipore, die die Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Vergleicht man die Leistung der Scepter Zellzähler den Ergebnissen aus anderen Zählverfahren, folgern wir, dass dieser neue Handheld, automatisierte Zellzähler präzise, ​​schnelle und zuverlässige Zellzahlen liefert über einen weiten Betriebsbereich. Die Funktionalität der Scepter Zählen ist ein Ergebnis der feinmechanischen Technik in die Spitze des Sensors und die ausgefeilte Instrumentierung zählen auf die Coulter-Prinzip verankert. Die Qualität der Leistung schlägt Scepter Zählen als Methode, um die Geschwindigkeit zu erhöhen und zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Zell-basierte Assays. Die Handheld-Format ermöglicht eine schnelle Langeweile freien Zählen direkt an der Zellkultur Kapuze.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Scepter 2,0 Handheld Automated Cell Counter mit 40 um Scepter Sensoren </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> Scepter 2,0 Handheld Automated Cell Counter bei 60 pm Scepter Sensoren </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td> Scepter Sensoren, 60 pm </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC60050 </td><td> Packung mit 50 Stück von Sensoren </td></tr><tr><td> Scepter Sensoren, 40 um </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC40050 </td><td> Packung mit 50 Stück von Sensoren </td></tr><tr><td> Universal Power Adapter </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td> Scepter O-Ring Kit </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCOCLIP </td><td> 2 O-Ringen und einem Filterdeckel </td></tr></tbody></table>

bestimmen zellzahl während der zellkultur mit dem scepter cell counter

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Zählen von Zellen ist häufig eine notwendige, aber lästige Schritt für In-vitro-Zellkultur. Konsequente Zellkonzentrationen sicherzustellen experimentelle Reproduzierbarkeit und Genauigkeit. Die Zellzahlen sind wichtig für die Überwachung der Zelle Gesundheits-und Proliferationsrate, die Beurteilung Immortalisierung oder Transformation, säen die Zellen für nachfolgende Experimente, die Transfektion oder Infektion, und die Vorbereitung für die Zell-basierte Assays. Es ist wichtig, dass Zellzahlen präzise, ​​konsistente und schnell sein, besonders für die quantitative Messung der zellulären Reaktionen. Trotz dieses Bedürfnis nach Schnelligkeit und Genauigkeit in Zellzählung, befragten 71% von 400 Forschern 1, die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer zählen. Während hemocytometry ist billig, es ist mühsam und unter user bias und Missbrauch, die zu ungenauen Ergebnissen zählt. Hemocytometers sind aus optischem Spezialglas, auf dem Zellsuspensionen in bestimmten Mengen verladen werden und gezählt unter dem Mikroskop gemacht. Fehlerquellen in hemocytometry gehören: unebene Zelle in der Probe, zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe, subjektive Entscheidungen, ob eine bestimmte Zelle innerhalb der definierten Zählen Bereich fällt, eine Kontamination der Zählkammer, User-to-User-Variante und Variation der Zählkammer Füllrate 2. Zur Linderung der Langeweile mit manuellen Zählung verbunden sind, zählen 29% der Forscher Zellen mit Hilfe von automatisierten Zellzählung Geräte, dazu gehören Vision-basierte Zähler, Systeme, die Zellen unter Verwendung des Coulter Prinzip erkennen oder Durchflusszytometrie 1. Für die meisten Forscher ist das Haupthindernis für über ein automatisiertes System den Preis mit diesen großen Tischgeräten 1 zugeordnet. Das Zepter cell counter ist ein automatisiertes Handheld-Gerät, dass die Automatisierung und die Genauigkeit der Coulter Zählung bei relativ geringen Kosten bietet. Das System nutzt die Coulter Prinzip der Impedanz-basierten Teilchennachweis 3 in einem miniaturisierten Format mit einer Kombination aus analogen und digitalen Hardware zur Erfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafische Darstellung. Die Einweg-Spitze wird mit einer mikrostrukturierten, Zell-sensing-Zone, dass die Diskriminierung von Zellgröße und Zellvolumen bei sub-Mikrometer-und Sub-Picoliter-Auflösung ermöglicht entwickelt. Angereichert mit Präzision Liquid-Handling-Kanäle und Elektronik, berichtet das Zepter Zellzähler Zellpopulation Statistiken grafisch als Histogramm angezeigt.

Das Zepter Cell Counter ist ein Handheld-Gerät, das automatisierte verwendet, um Zellen zu zählen, überwachen Zelldurchmesser und Volumen, und verwendet, um die Gesundheit und Lebensqualität von Zellpopulationen von einer Kultur zur nächsten Überprüfung werden können.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Das Zählen von Zellen ist oft ein notwendiger, aber mühsamer Schritt in der In-vitro-Zellkultur. Konsistente Zellkonzentrationen gewährleisten die experimentelle Reproduzierbarkeit und ...

Der Scepter-Zellzähler ist ein handgehaltenes, automatisiertes Gerät zur Zählung von Zellen, Überwachung des Zelldurchmessers und -volumens sowie Beurteilung der Gesundheit und Qualität zellulärer Populationen. Er bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen Zählmethoden, darunter verbesserte Genauigkeit, einfache Handhabung und geringe Kosten für die Zellzählung. Verwenden Sie den Scepter und folgen Sie den Anweisungen auf dem grafischen Display, um die Zellen in den Einweg-Sensor anzusaugen.Die Zellen werden dann gezählt, und das Gerät meldet Zellkonzentrationen und Statistiken, die auf einen Computer hochgeladen und analysiert werden können. Hallo, ich bin Sonya. Ich bin Wissenschaftlerin hier bei Millport, und heute zeige ich Ihnen, wie man den Scepter verwendet.Zellzähler Die Zählung von Zellen ist ein notwendiger, aber zeitraubender Schritt in der Zellkultur in vitro. Konsistente Zellkonzentrationen gewährleisten die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von Experimenten. Zellzählungen sind wichtig, um den Zellzustand und die Proliferationsrate zu überwachen, immortale oder transformierte Zellen für nachfolgende Experimente, Transfektionen oder Infektionen auszusäen und sich auf zellbasierte Assays vorzubereiten, trotz der Notwendigkeit von Schnelligkeit und Genauigkeit.Bei der Zellzählung zählen 71 % der befragten 400 Forscher Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Obwohl die Hämozytometrie kostengünstig ist, ist sie arbeitsaufwendig und anfällig für Benutzerfehler und Fehlanwendungen, was zu ungenauen Zählungen führt. Zu den Fehlerquellen bei der Hämozytometrie gehören eine ungleichmäßige Zellverteilung in der Probe sowie zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe.Subjektive Entscheidungen darüber, ob eine bestimmte Zelle innerhalb des definierten Zählbereichs liegt. Kontamination des Hämozytometers, Benutzervariabilität und Variation der Füllgeschwindigkeit des Hämozytometers, um die Langeweile, die mit der manuellen Zählung verbunden ist, zu verringern. 29 % der Forscher zählen Zellen mithilfe automatisierter Zellzählgeräte.Doch für die meisten Forscher stellt der Preis dieser großen Laborgeräte eine Hürde für ihre Nutzung dar. Der Scepter-Zellzähler ist ein automatisiertes, handgehaltenes Gerät, das die Automatisierung und Genauigkeit der Coulter-Zählung zu relativ geringen Kosten in einem benutzerfreundlichen, handlichen Format bietet. Das System verwendet das Coulter-Prinzip der impedanzbasierten Partikelerkennung in miniaturisierter Form und kombiniert analoge und digitale Hardware zur Signalerfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafischen Anzeige.Der Einweg-Sensor ist mit einer mikrofabrizierten Zellmesszone konstruiert, die eine Unterscheidung nach Zellgröße und Zellvolumen mit submikronaler und subpikoliter Auflösung ermöglicht und durch präzise Flüssigkeitskanäle sowie Elektronik verbessert wird. Der Scepter-Zellzähler zeigt die Statistiken der Zellpopulation grafisch als Histogramm zur Nutzung an. Der Scepter-Zellzähler beginnt damit, eine Einzelzell-Suspension von Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu verdünnen.Eine Konzentration von 10.000 bis 500.000 Zellen pro Milliliter ist optimal. Überführen Sie 100 Mikroliter verdünnte Zellen in ein 1,5-Milliliter-Microview-Röhrchen. Schalten Sie den Scepter-Zellzähler ein, indem Sie den Schalter auf der Rückseite des Geräts gedrückt halten, und warten Sie, bis die Anweisungen auf dem Bildschirm erscheinen.Wenn dazu aufgefordert, befestigen Sie einen Sensor am Ende der Scepter-Einheit, wobei die elektrodenbasierte Sensierfläche in Richtung der Vorderseite des Instruments zeigt. Scepter-Sensoren bestehen aus einer präzise geformten Probenkammer mit einer elektronischen Sensierzone und integrierten Zellsensorelektroden. Die Sensoren ermöglichen es, die Zellgröße mit submikronaler Auflösung und das Zellvolumen mit subpikoliter Auflösung zu unterscheiden.Eine konsistente Sensor-Technik stellt sicher, dass gleiche Probenvolumina gezählt und genaue Größenmessungen durchgeführt werden. Sobald der Sensor angebracht ist, führen Sie jeden Schritt des Zählprozesses gemäß der Bildschirmanweisungen wie folgt durch. Wenn auf dem Bildschirm angezeigt wird, halten Sie den Kolben gedrückt, um den Kolben zu betätigen. Anschließend zeigt der Bildschirm tauchen Sie den Sensor ein. Tauchen Sie den Sensor in die Zellsuspensionslösung ein und lassen Sie den Kolben los, um die Zellsuspension in den Sensor zu aspirieren.Der Kolben wirkt als elektrisches Signal und zieht die Probe zusammen mit dem Totvolumen in den Sensor ein. Die Geschwindigkeit oder Genauigkeit des Kolbenhubes ist nicht entscheidend, im Gegensatz zum Pipettieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Sekunden, sobald er bereit ist.Das Gerät gibt einen Ton von sich und die eingebrachte Probe wird auf dem Bildschirm angezeigt. Sobald die Probe in den Sensor eingebracht ist, wird sie durch die Messzone gezogen, um Zellgröße und Zellvolumen zu bestimmen. Anschließend gelangt sie durch die Mikrokanäle; wenn 50 Mikroliter der Probe gezählt wurden, signalisiert der Sensor dem Gerät, die Zählung zu stoppen.Nach Abschluss der Zählung zeigt der Gerätebildschirm „Zählung abgeschlossen“ an. Bitte entfernen und entsorgen Sie den Sensor. Befolgen Sie die Aufforderung und nehmen Sie den Sensor heraus und entsorgen Sie ihn.Das Gerät zeigt dann ein Histogramm der Zellgröße oder des Zell­durch­messers auf seinem Bild­schirm sowie die Zell­konzentration pro Milliliter an. Sobald die Zählung abgeschlossen ist und das Histogramm auf dem Gerät angezeigt wird, setzen Sie Tore, indem Sie die Umschalt­taste drücken, und wählen Sie automatische Torgestaltung („auto gating“) oder die letzte Einstellung („use last“), um entweder automatisch ein Tor basierend auf dem Histogrammprofil festzulegen oder die Tore der vorherigen Zählung zu übernehmen. Unabhängig von der Auswahl können die Tore manuell angepasst werden, um sie fein zu justieren.Stellen Sie die Daten ein, drücken Sie erneut die Umschalttaste, um das linke Tor auszuwählen, und scrollen Sie mit der Umschalttaste, um das Tor nach Belieben zu verschieben. Drücken Sie dann erneut die Umschalttaste, um das rechte Tor zu aktivieren, und scrollen Sie, um das rechte Tor zu positionieren. Klicken Sie erneut.Eine neue Zellkonzentration, durchschnittliches Zellvolumen und Durchmesser werden angezeigt. Der Schalter kann auch auf beiden Seiten betätigt werden, um zwischen Datum/Uhrzeit, mittlerer Zellgröße und mittlerem Zellvolumen umzuschalten. Bis zu 72 Histogramme können direkt am Gerät gespeichert werden. Um die Daten auf einen Personalcomputer hochzuladen, schließen Sie das Gerät über den USB-Anschluss an und verwenden Sie den Anzeigeschirm am PC.Doppelklicken Sie auf die Scepter-Softwareanwendung, um die Software zu starten. Klicken Sie anschließend auf „Verbinden“. Alle Zählwerte werden automatisch in die Software übertragen.Die Scepter-Anwendungssoftware zeigt das Histogramm an, das die Populationsverteilung der Kultur entweder nach Volumen oder Durchmesser detailliert darstellt. Heruntergeladene Dateien können anschließend in Microsoft Excel exportiert werden, wobei die Rohdaten in Klassen spezifischer Zelldurchmesser oder Zellvolumina angezeigt werden. 19 verschiedene Zelllinien wurden zur Zählung vorbereitet, und die theoretischen Startkonzentrationen wurden mithilfe eines Zellzählgeräts bestimmt.Diese Zellsuspensionen wurden anschließend weiter verdünnt, um Zellsuspensionen mit theoretischen Zellkonzentrationen zu erhalten. Anschließend wurde der Scepter-Zellzähler verwendet, um die Zellkonzentrationen zu bestimmen. Diese Abbildung zeigt fünf Verdünnungen, die für fünf repräsentative Zelllinien gemessen wurden, zusammen mit der theoretischen Zellkonzentration.Der hohe Grad der Linearität, angegeben durch die Bestimmtheitsmaße (r-Quadrat-Werte), zeigt, dass die Scepter-Zählung eine zuverlässige Methode für die getesteten Zelllinien über einen breiten linearen Arbeitsbereich hinweg darstellt. Die gesamte relative Genauigkeit der Scepter-Zählung wird hier gezeigt, wobei Daten aus der Scepter-Zählung mit Zählungen aus der Coter-Zählung verglichen werden. Der Logarithmus der Scepter-Zellzahlen wird gegen den Logarithmus der Coter-Zahlen aufgetragen und zeigt, dass die Scepter-Zahlen über alle getesteten Zelllinien hinweg mit den Coter-Zahlen übereinstimmen.Zählungen von 19 Zelllinien wurden mit einem Zwei-Kanal-Coulter-Zähler durchgeführt. Die Zählung mit dem Scepter-Zellzähler, einem automatisierten, bildbasierten Zähler wie dem V-Zell- oder Count-Test-System, sowie die Hemo-TER-Zählungen wurden gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung derselben anfänglichen Zellsuspension und identischer Verdünnungen durchgeführt. Die in dieser Abbildung gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die mittels Scepter-Zählung bestimmten Zellkonzentrationen eng mit den theoretischen Zellkonzentrationen übereinstimmen und eine hohe Linearität aufweisen.Der prozentuale Variationskoeffizient oder CV wurde für jede Verdünnung jeder Zelllinie berechnet. Für jedes hier gezeigte Zählverfahren sind die durchschnittlichen prozentualen CVs über 19 Zelllinien bezüglich Zellkonzentration und Zählmethode innerhalb des Arbeitsbereichs angegeben. Der Scepter-Zellzähler ist präziser als die Zählung mit dem Hämozytometer und weist geringere Standardabweichungen sowie kleinere durchschnittliche Variationskoeffizienten auf.Die Scepter-Zählung ist zehnmal schneller als die Hämocytometrie und ebenfalls schneller als andere automatisierte Zähler. Hier wurden SF-nine-, MCF-seven- und HC-2-93-Zellen mit den in diesem Video beschriebenen Methoden gezählt. Die durchschnittliche Zeit, die zur Messung der Zellkonzentration benötigt wurde, wurde aufgezeichnet.Beachten Sie, dass die Hämocytometrie nur einmal pro Probe durchgeführt wurde. Der Scepter führt Messungen basierend auf der Zellgröße durch. Daher können alle Veränderungen in der zellulären Morphologie im Histogramm erfasst werden.Gesunde Kulturen zeigen eine klare glockenförmige Gauß-Verteilung, während ungesunde Zellen sterben und eine Verschiebung des Histogramms nach links verursachen. Ebenso wurden Histogrammverschiebungen beobachtet, wenn eine Population aus 50 % toten Zellen mit 50 % lebenden Zellen gemischt wurde. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man den neuen Scepter-Zellzähler von Millipore verwendet, der die Art und Weise, wie Forscher ihre Zellen zählen, revolutioniert.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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