Name: Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T01:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Lernen Sie die Laboraufzucht von Anopheles gambiae mit kontrollierten Bedingungen bei 27°C und 80% Luftfeuchtigkeit. Diese Methode ermöglicht Malaria-Vektorforschung durch alle Lebensstadien.

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Mosquito Essen: <ol><li> Lebensmittel A: geerdet Fischfutter (Aquaricare). Eine kleine Prise hinzugefügt werden muss. </li><li> Lebensmittel B: geerdet Katzenfutter (Purina). Eine kleine Prise hinzugefügt werden muss. </li><li> Lebensmittel C: Katzenfutter (Purina). Zwei Tabletten hinzugefügt werden muss. </li></ol> Blood: Tierischem oder menschlichem Blut kann nach hinten Moskitos eingesetzt werden. Frisches Blut mit einer Spritze gesammelt und in ein steriles 15 ml Falcon-Röhrchen mit 1 ml der CPD (Antikoagulans) für jeweils 10 ml Blut, dann vorsichtig gemischt und zentrifugiert bei Raumtemperatur bei 2000 rpm für 5 min. Der Überstand wird verworfen, kümmert sich um die Buffy-Coat, die anderen Blutzellen (zB WBC) umfasst entfernen. Die RBC Pellet wird dann in ein gleiches Volumen RPMI-Medium mit einer Pipette suspendiert und weitere in diesem Medium dreimal gewaschen. Nach dem letzten Waschen, die pelletierten Erythrozyten sind in dem gleichen Volumen RPMI resuspendiert und bei 4 ° C (für 8-10 Tage aufbewahrt werden). Gerade vor dem Füttern wird der RBC (in RPMI) zentrifugiert (2000 rpm für 5 min) zu Pellets automatisch in die Zellen und die gepackte RBC ist in Serum (O + Humanserum) resuspendiert, um eine 40% Hämatokrit zu erhalten. Das Blut muss bei 37 ° C immer für die Fütterung gehalten werden. TAG 1: <ol><li> Die 3-5 Tage alten adulten weiblichen Mücken sind auf Blut, Eier zu legen zugeführt. </li><li> Für Blut füttern, ist eine künstliche Membran (Parafilm) Fütterung Methode wie folgt verwendet: <ol><li> Rote Blutkörperchen (siehe oben für Blut Vorbereitung) sind mit hitzeinaktiviertes Serum gemischt, um eine ~ 40% Hämatokrit (verpackt RBC 40% und Serum 60%) erhalten. Dies ist auf die Glasfeeder aufgenommen. </li><li> Der Anleger ist es, eine Warmwasser-Jacke (37 ° C) verbunden ist, und auf den Käfig, um die Moskitos Zugriff auf die Membranoberfläche zu ermöglichen. </li><li> Die Mücken sind erlaubt, für ~ 30 Minuten zu ernähren. </li></ol></li></ol> TAG 3: <ol><li> Die Weibchen legt Eier 2 Tage, nachdem sie ernähren sich von Blut. Ein kleines Filterpapier in eine konische Form gewickelt ist in einem kleinen Becherglas mit destilliertem Wasser gelegt, um sicherzustellen, dass Filterpapier feucht wird. Der Becher wird in den Käfig über Nacht für die Moskitos, Eier zu legen gehalten. </li></ol> TAG 4: <ol><li> Das Filterpapier mit dem Moskito-Eier ist in einer Plastikschale mit ~ 300 ml destilliertes Wasser gegeben. Eine Prise von Lebensmitteln A ist, um das Fach aufgenommen und Eier dürfen die Larven in den nächsten Tagen schlüpfen. </li></ol> DAYS 5 bis 8: <ol><li> Wachsenden Larven gefüttert werden jeden Tag mit zwei Tabletten von Lebensmitteln C und überwacht für die Dichte und der Bevölkerung. Am achten Tag (5 Tage alte Larven), ist die Larven Bevölkerung von 1-Fach nach ~ 10 Tabletts verdünnt, mit einer Prise von Lebensmitteln A und zwei Tabletten von Lebensmitteln C in den einzelnen Fächern. (~ 30 Min.) </li></ol> DAYS 9 bis 12: <ol><li> Die Larven gefüttert werden jeden Tag mit der Nahrung C. Am 12. Tag (9 Tage alte Larven), wird das Wasser mit frischem Wasser verändert, und das Essen wird hinzugefügt (eine Prise von Lebensmitteln B und zwei Tabletten von Lebensmitteln C). Die Puppen beginnt mit der Entwicklung in diesem Stadium. Die Schalen sind mit Netzen abgedeckt, um zu entkommen der Erwachsenen zu vermeiden. (~ 8-10 Minuten) </li></ol> TAG 13 bis 15: Die Puppen dürfen bei Erwachsenen für die nächsten 2 emerge - 3 Tage. Das Essen ist jeden Tag, um die Larven / Puppen gegeben durch vorsichtiges Entfernen der net zu vermeiden Flucht von Erwachsenen. TAG 16: <ol><li> Die Erwachsenen werden in einem Käfig durch einen Aspirator verbunden Vakuum gesammelt. Der Käfig besteht aus einem kleinen 100 ml Flasche mit einem Baumwollfaden, der mit 10% Saccharose (autoklaviert) und einem Papiertuch Futter auf dem Boden, um mögliche Zucker verschüttet, die während Käfig Handhabung auftreten können, genießen getränkt ist. (~ 30-40 Minuten) </li></ol> TAG 17 bis 21: <ol><li> Die Erwachsenen (Männer und Frauen) werden dann in der Insektarium Zimmer für 4-5 Tage gehalten, gefüttert 10% Saccharose, bevor sie wieder Blut zugeführt werden, um den nächsten Zyklus zu beginnen. Das gleiche Mücken können verwendet werden, um Eier mehr als einmal zu verlegen. </li><li> Die Mücken, die nicht für Experimente oder die Aufzucht benötigt werden kann, indem man den Käfig in ein Gefrierfach getötet werden. Die verwendeten Schalen und Käfige müssen gereinigt und getrocknet werden, bevor sie wieder verwendet werden können. </li></ol> HINWEIS: Es kann einige Variationen in der Mücke Aufzucht-Methode und verschiedene Labore können verschiedene Techniken.

<ol><li>Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+Anopheles+maculatus+from+Central+Java%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia.</a> J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).</li>
<li>Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+rearing+techniques+and+adult+life+table+parameters+for+Anopheles+sergentii+from+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt.</a> J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Care+and+maintenance+of+anopheline+mosquitoes%2C+The+molecular+biology+of+disease+vectors%3A+A+methods+manual%22">Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual</a>. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).</li>
<li>Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+Anopheles+quadrimaculatus+Say+and+Aedes+aegypti+%28L.%29+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq+News%22%5BJournal%5D)">Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory.</a> Mosq News. 9, 112-117 (1949).</li>
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<li>Nasirian, H., Ladonni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+bloodfeeding+of+Anopheles+stephensi+on+a+membrane+apparatus+with+human+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood.</a> J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).</li>
<li>Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+larval+crowding+on+mating+competitiveness+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Malar J. 30 (4), 49(2005).</li>
<li>Stobart, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+control+of+body+volume+in+the+larvae+of+the+mosquitoes+Aedes+aegypti+and+Aedes+detritus%5BTitle%5D)+AND+%22Edw.+J.+Exp.+Boil%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus.</a> Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Lebensmittel A</td><td></td><td>Aquaricare</td><td></td><td>Fein gemahlenes Fischfutter. Eine kleine Prise muss hinzugefügt werden.</td></tr><tr><td>Lebensmittel B</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Fein gemahlenes Katzenfutter. Eine kleine Prise muss hinzugefügt werden.</td></tr><tr><td>Lebensmittel C</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Katzenfutter. Zwei Tabletten müssen hinzugefügt werden.</td></tr><tr><td>RBC</td><td></td><td></td><td></td><td>hergestellte rote Blutkörperchen: 40 % Hämatokrit in humanem Serum</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td></td><td></td><td></td><td>Antikoagulans</td></tr><tr><td>Serum</td><td></td><td></td><td></td><td>O+ humanes Serum</td></tr><tr><td>Mückenfütterungsapparatur</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anopheles gambiae</td><td></td><td></td><td></td><td>Mücken</td></tr><tr><td>10 % Saccharose</td><td></td><td></td><td></td><td>Mückenfutter</td></tr><tr><td>Insektarium</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll für mosquito aufzucht (a. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Dieses Protokoll beschreibt Mücke Aufzucht im Insektarium. Das Insektarium Zimmer sind bei 28 ° C und ca. 80% Luftfeuchtigkeit, mit einem 12-Std. Tag / Nacht-Zyklus. Für dieses Verfahren benötigen Sie Moskito-Käfige, 10% sterile Saccharose-Lösung, Papierhandtücher, Becher, Whatman-Filterpapier, Glas Speiser, menschlichem Blut und Serum, Wasserbad, Parafilm, destilliertes Wasser, saubere Kunststoff-Trays, Moskito Essen (beschrieben unten), Moskitonetz, um die Fächer, Vakuum, und eine Sammlung Kammerdeckel zu Erwachsenen zu sammeln.

Dieses Video zeigt den allgemeinen Techniken verwendet, um hinten Anopheles gambiae im Labor. Die Methoden für die Pflege Labor Mücken sind in allen Phasen des Organismus Lebenszyklus von Larven zu Blut-Fütterung Erwachsene Puppen gezeigt.

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

Dieses Protokoll beschreibt die Mückenaufzucht im Insektarium. Die Räume des Insektariums werden bei 28 °C und ~80 % Luftfeuchtigkeit mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Rhythmus ...

Mein Name ist Shish und ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. George OU an der John Hopkins School of Public Health, Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie. Ich werde zeigen, wie man die Mücke *Anopheles gambiae* im Labor hält. Wir pflegen sie im Insektarium, das üblicherweise bei 27 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von 80 % gehalten wird.Der Insektenzuchtraum wird ebenfalls in einem 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus gehalten, um die natürlichen Bedingungen nachzuahmen. Dies ist der Insektenzuchtraum, den wir hier als zentrale Einrichtung betreiben, um diese Insekten zu pflegen. Wie Sie sehen können, enthalten alle verschiedenen Schalen Mücken in allen Entwicklungsstadien – Eiern, den verschiedenen Larvenstadien und den Puppen.Diese Tabletts enthalten Larven, die etwa 11 oder 12 Tage alt sind, und dies ist ein Käfig, in dem wir die erwachsenen Mücken sammeln und in einer 10%igen Saccharoslösung halten. Um die Mückenhaltung zu beginnen, müssen wir die Mücken mit Blut füttern, da die Mücken das Protein des Blutes benötigen, um Eier abzulegen. Der erste Tag ist also der Tag nachdem die erwachsenen Mücken in einem Käfig gesammelt und in 10%iger Saccharose gehalten wurden.Am ersten Tag müssen die Mücken mit Blut gefüttert werden, weshalb die künstliche Membran-Blutmahlzeit zum Einsatz kommt. Dieser Glaskolben dient als Fütterungsbehälter für die Membranfütterung der Mücken. Das Blut wird durch die kleine Öffnung, die Sie sehen, eingefüllt und darin aufbewahrt.An der Unterseite an der Seite befinden sich zwei Düsen, die mit einem Wassergebärfass verbunden sind, das bei 37 Grad gehalten wird. Um das Blut warm bei 37 Grad zu halten und den Futterbehälter für die Fütterung vorzubereiten, nehmen wir ein kleines Stück Parafilm. Wir dehnen es von beiden Enden aus auf allen vier Seiten und legen es dann auf die offene Seite des Glasfutters, um eine dünne Membranschicht zu erzeugen, die gerade die Haut nachahmt.Das wird als Membranfütterung bezeichnet. Dabei handelt es sich um ein zirkulierendes Wasserbad, das das Wasser bei 37 °C hält und gleichzeitig das Wasser durch den Glasfütterer zirkulieren lässt, sodass das Blut konstant warm bei 37 °C gehalten wird. Wir verbinden also den Glasfütterer über die kleinen Kapillaren mit dem zirkulierenden Wasserbad und schalten das Wasserbad ein, damit das Wasser zirkuliert. Das Wasser und das Blut vermischen sich dabei nicht, da sie sich in zwei getrennten Kammern befinden.Dies ist ein Käfig mit adulten Mücken der Art Phis Gambi. Dies ist der Glasfütterer, der mit dem Zirkulationsbad verbunden ist. Wir befestigen eine Klammer an der Oberseite des Käfigs und geben 200 µL Blut hinzu. Der Käfig enthält sowohl männliche als auch weibliche Mücken.Nur das Weibchen kommt, um sich mit Blut zu ernähren. Die Blutmahlzeit dauert etwa 30 Minuten an. Zwei Tage nach der Blutmahlzeit stellen wir Eierbecher in den Käfig der Mücken, damit sie ihre Eier ablegen können.So wird es gemacht. Wir nehmen ein kleines Becherglas und füllen es teilweise mit destilliertem Wasser. Dann nehmen wir ein Filterpapier, befeuchten es und formen es zu einer kegelförmigen Hülle, die wir in das Becherglas mit dem destillierten Wasser stellen, wobei sichergestellt werden muss, dass der Inda-Pfeffer angefeuchtet wird. Nun öffnen wir langsam den Mückenkäfig, achten darauf, dass keine Mücken entweichen, und stellen die Eierbecher hinein.Am nächsten Tag nachdem die Becher in den Käfig gestellt wurden, also am vierten Tag, werden sie langsam aus dem Käfig genommen. Dies sind die Eier, die schwarzen, die außerdem einige tote Mücken enthalten. Sobald die Eier bereitliegen, legen Sie sie auf ein Plastiktablett.Die Vergangenheit, das Plastiktablett wird mit destilliertem Wasser gefüllt. Nehmen Sie den Filter mit den Eiern und legen Sie ihn hinein. Wir geben außerdem eine Prise Nahrung A hinzu, das ist gemahlenes Fischfutter, und stellen das Tablett in das Gestell.Wir sollten das Tablett am Tag nivellieren, an dem wir mit der Befüllung des Tabletts beginnen, und auch notieren, um welche Arten es sich hier handelt. Dies ist einen Tag danach, also am nächsten Tag nach dem Einbringen des Eies in das Tablett. Das bedeutet, diese sind einen Tag alt, aber das eigentliche Protokoll bezieht sich auf den fünften Tag des Moskito-Lebenszyklus.Das sind die schwarzen Eier, die gerade zu Larven schlüpfen werden. Und das ist das Mückenfutter. Für die Mückenzucht verwenden wir normalerweise drei verschiedene Arten von Futter.Essen A ist eigentlich gemahlenes Fischfutter, und dies fügen wir hinzu, wenn wir die Mückenkultur beginnen, in dem Stadium X, und ab dann geben wir täglich zwei Tabletten Futter C hinzu, welches Katzenfutter von Purina ist. Nach acht oder neun Tagen wechseln wir das Wasser in der Schale und geben frisches Wasser hinzu. Zu diesem Zeitpunkt geben wir statt Futter A eine Prise Futter B hinzu, was nichts anderes als gemahlenes Futter C ist, also gemahlenes Katzenfutter, sowie zwei Tabletten Futter C; die Eier schlüpfen zu Larven. Es gibt drei verschiedene Entwicklungsstadien der Larven. Erste Instar, zweite Instar und dritte Instar. Dies sind Schalen, die Larven enthalten, die fünf oder sechs Tage alt sind.Diese Ravi befinden sich in einem viel fortgeschritteneren Stadium, etwa neun bis zehn Tage alt. Dazwischen wurde das Wasser gewechselt, frisches Wasser und frisches Futter hinzugefügt. Dieses Tablett enthält sowohl die erwachsenen Exemplare als auch die ppe.Dies sind die erwachsenen Tiere, wie Sie sehen können, die unter den Moskitonetzen fliegen. Und am Rand sehen Sie alle dunkelfarbigen Puppen, die zu den erwachsenen Tieren heranreifen. Sobald Sie die erwachsenen Tiere haben, können sie in einem Käfig gesammelt werden, der folgendermaßen aussieht.Im Inneren befindet sich eine Papiertuch-Auskleidung und eine kleine Flasche mit 10 %iger Superlösung sowie eine Dose mit Watte, die als Nahrungsquelle für die Mücken dient. Wir haben also den Deckel verschlossen, und dies ist das Gerät, der Aspirator, der an das Vakuum angeschlossen ist, über das wir die erwachsenen Tiere aus diesen Schalen sammeln werden. Dieser Teil des Aspirators ist hier verbunden und am anderen Ende ebenfalls. Mit dem Vakuum verbunden. Wir stellen den Käfig hinein, in den wir die erwachsenen Tiere in diese kleine Box sammeln werden. Dies ist ein weiterer Teil des Aspirators, der über ein langes Rohr verfügt, das wir in das Mückenfach einsetzen werden.Die andere Seite wird mit dem Käfig verbunden. Sie müssen sicherstellen, dass alles fest sitzt, damit das Vakuum gut funktioniert. Wir schließen den Deckel und vergewissern uns, dass alles dicht ist.Starten Sie langsam die Backend-Einheit. Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, bringen Sie dieses lange Rohr langsam in das Mückenbehältnis ein und stellen Sie sicher, dass Sie das Netz schließen und verhindern, dass die Mücken entweichen. Wie Sie sehen können, sammeln sich die Mücken nun im kleinen Käfig.Bewegen Sie das Rohr langsam überall hin, um alle erwachsenen Tiere einzusammeln. Jetzt bin ich fast fertig. Alle erwachsenen Tiere wurden eingesammelt und befinden sich nun in diesem Käfig, wie Sie sehen können.Dann lassen wir langsam das Vakuum ab und bauen die Sammelvorrichtung ab. Dies sind adulte Ana-Gambi-Mücken, die für einige Tage in diesem Käfig aufbewahrt werden. Sie erhalten 10%igen Saccharose und werden nur dann mit Blut gefüttert, wenn wir Eier ablegen lassen müssen.Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man die Mücken anlegt. Bei der Zucht von Mücken unter Laborbedingungen sind die entscheidenden Schritte zunächst die Blutmahlzeit. Danach folgt das Einsetzen der Eierbecher, die Beobachtung der Eier und anschließend durchlaufen sie verschiedene Entwicklungsstadien wie Larven, Puppen und erwachsene Tiere.Und schließlich sammeln wir die erwachsenen Tiere. Die Bedeutung dieser Technik liegt darin, dass wir die Bedingungen im Freien unter natürlichen Verhältnissen nachahmen müssen, um gesunde Mücken zu erhalten. Anschließend infizieren wir sie mit dem Plasmodium und führen verschiedene Studien zur Malaria durch, deren Hauptziel es ist, die Krankheit weltweit auszurotten.

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