Name: Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung primärer Zellkulturen aus Drosophila-Gastrulaembryonen für RNAi- und Bildgebungsanalysen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genstudien in Zell- und Entwicklungsbiologie.

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JB wurde von der Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716 bis 1702 unterstützt. JZ wurde durch die NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02 unterstützt. NP ist ein Ermittler des Howard Hughes Medical Institute.

1. Vorbereitung fliegen Käfige <ol><li> Wachsen Drosophila (Wildtyp-Stämme wie Oregon-R oder Genotyp) in bequemen Behälter, wie 32-oz Insekten Tassen. </li><li> Transfer neu eclosed fliegt zu großen Embryo-Sammlung Käfigen oder fliegen Bevölkerung Käfigen. </li><li> Bewegen Sie den Käfigen in einen Raum mit einer Temperatur von ~ 25 ° C und Luftfeuchtigkeit bis 65% in einer leichten 12-h und einem dunklen 12-h-Zyklus, um die Sammlung von Synchron-Embryonen zu erleichtern. </li><li> Pflegen Sie die Fliegen in den Käfigen, indem man sie getötet Hefepaste auf Melasse-Platten ausgestrichen. Ändern Sie die Melasse-Platten (mit abgetöteten Hefe paste) einmal täglich für 2-3 d. </li></ol> 2. Sammlung von Synchron-Embryonen <ol><li> Am Tag der Primär-Zelle Vorbereitung, füttern die Fliegen wth frische Platten mit abgetöteten Hefe beschichtet für eine 1-2 h vor-lay Zeitraum einfügen. </li><li> Kurz vor dem 12-h Dunkel-Zyklus, ersetzen Sie die pre legen Platten mit frischen Melasse-Platten mit einer minimalen Menge von Hefe Paste ausgestrichen. Entsorgen Sie die pre lag Sammlung, die asynchrone älteren Embryonen enthält. </li><li> Sammeln Embryonen für einen Zeitraum von 1-2 h </li><li> Entfernen Sie die Platten mit den relativ synchron Bevölkerung von Embryonen und speichern bei 25 ° C für 5-6 h. Embryonen werden in den modernen Gastrulastadium zu diesem Zeitpunkt. </li></ol> 3. Sammlung und Reinigung von Embryonen <ol><li> Lösen Sie die Embryonen von den Platten mit einem nassen Pinsel, und anschließend gründlich mit lauwarmem Leitungswasser durch eine gestapelte Satz Siebe, so dass die Embryonen in die feinsten Sieb sammeln sich am Boden. Spülen Sie für ein paar Minuten, um so viel Hefe und fliegen Trümmer wie möglich zu entfernen. </li><li> Tipp der Siebe, so dass die Embryonen auf einer Seite sammeln und vorsichtig waschen Sie sie aus dem Sieb in eine dechorionation Korb. </li><li> Umzug in die Gewebekultur Haube Bereich, ohne dass die Embryonen austrocknen. </li></ol> 4. Homogenisierung von Embryonen und Beschichtung von Zellen <ol><li> Sterilisieren und dechorionate die Embryonen durch Eintauchen in 50% (vol / vol) Bleichmittel für 5-10 min. Spülen Sie den Embryonen von der Wand des Korbes mit 70% (vol / vol) Ethanol. Alternativ, waschen Sie die Bleiche aus Embryonen mit destilliertem Wasser, bevor Ethanol-Behandlung. Von diesem Zeitpunkt an Embryonen unter sterilen Bedingungen und in der Gewebekultur Haube behandelt werden. </li><li> Spülen Sie den Embryonen gründlich, um das Bleichmittel und / oder Ethanol mit autoklaviertem destilliertem Wasser zu entfernen. </li><li> Während der dechorionation Schritt füllen Dounce Homogenisator mit dem entsprechenden Volumen von Raumtemperatur M3 mittelfristig auf den Betrag von Embryonen basieren. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des Embryos und der Medien sollten nicht mehr als 0,5-ml Embryonen werden: 40-ml-Medien (oder ~ 100-200 Embryonen / ml). </li><li> Legen Sie die gespülten Embryonen in einem sterilisierten Becher mit der Menge des M3 Medien genug, um tauchen Embryonen. Lassen Sie die Embryonen für 2-5 min einweichen. </li><li> Demontieren Sie die dechorionation Korb und blot die Nitex Mesh trocken sterilisiert Papierhandtücher. </li><li> Transfer der Embryonen in den Homogenisator mit einer sterilisierten Pinsel. </li><li> Homogenisieren vorsichtig mit kurzen Strichen mit einem losen Pistill ohne Erreichen der Boden des Röhrchens, bis alle Embryonen ausgesetzt sind. Dann vorsichtig aber fest, mit acht volle Takte zu homogenisieren. Nicht verdrehen Stößel, wie es oben und unten bewegt. </li><li> Übertragen Sie die Homogenat in eine sterile 50-ml konische Zentrifugenröhrchen entweder durch Gießen oder Pipettieren, und die Kappe der Röhre. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 40 g, Raumtemperatur Pellet die Gewebestücke, große Zellklumpen und vitelline Membranen. Übertragen Sie den Überstand mit den Zellen und Eigelb in ein sauberes Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt für 5 min. </li><li> Vorsichtig den Überstand durch Gießen oder Pipettieren in ein sauberes Röhrchen und drehen für 10 min bei 360g, Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen. Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (serum-freiem Medium für RNAi-Experimente). </li><li> Graf lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer die Zelldichte zu schätzen. In der Zwischenzeit, wiederholen Sie Schritt 4,10 bis Pellet den Zellen. </li><li> Resuspendieren der Zellen auf eine gewünschte Konzentration. Um zu beginnen, versuchen Sie einen Bereich von 1 ~ 5 x10 6 Zellen / ml und die Platte bei 1,7 bis 2,5 x10 5 Zellen / cm 2. </li></ol> 5. Primär-Zelle RNAi für Zellen, die auf eine 384-Well-Platte gewachsen <ol><li> Dispense 5 ul dsRNAs in jedes Well in einer Endkonzentration von ~ 250 ng pro Vertiefung einer 384-Well-Platte. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, verzichten 10 ml (1 ~ 4x106 Zellen / ml) von primären Zellen pro Vertiefung in einem serumfreien M3-Medium in einem 384-Well-Platte mit einem anderen dsRNA in jede Vertiefung. Alternativ können die Zellen auf 8-Well-Glas Kammer-Objektträgern für die konfokale Bildgebung kultiviert werden. </li><li> Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur. Kultur der Zellen in serum-freiem Medium bei 25 ° C für 22 h oder bei 18 ° C für 1-2 d. </li><li> 30 ml Serum-haltigem Kulturmedium in jede Vertiefung. </li> Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur. <li> Legen Sie die Platten in einer feuchten Kammer und Kultur die primären Zellen für weitere 5 ~ 7 d bei 25 ° C. </li><li> Bild der Zellen entweder live oder nach Immunfluoreszenzfärbung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Bei optimalen Bedingungen werden die Zellen in der Kultur sehen mit einem runden Morphologie gesund. Die Kultur wird wenig Zelltrümmer, und 50 ~ 80% konfluente nach anfänglichen Beschichtung. Diese Zellen werden morphologische Veränderungen, nachdem sie über einen längeren Zeitraum hinweg kultiviert unterziehen. Normalerweise dauert es etwa 5-8 Tage für Zellen in der Kultur vollständig bei 25 ° C unterschieden werden Gute Qualität primären Kulturen sind in der Regel, wie gut die Zellen-of-Interest sind in der Kultur differenziert beurteilt. Zum Beispiel, primäre Muskelzellen haben oft eine Niederlassung Morphologie und werden vielkernigen Myotuben mit Streifen wie Myofibrillen, bestehend aus einer Reihe von Sarkomere. Voll differenzierte Myotuben wird in der Regel spontan in die Kultur zu bewegen. Im Gegensatz dazu bilden differenzierte primären Neuronen Cluster mit ihrem Zellkörper, und verbinden sich mit anderen Clustern mit ihrem Axon-Kabel. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Primäre Zellen durchlaufen morphologische Veränderungen, nachdem sie in der Kultur verchromt (A) A Hellfeldbild von primären Zellen nach rechts, nachdem er in eine Vertiefung einer 384-Well-Platte ausplattiert. Die Mehrzahl der Zellen sind rund und intakt und gut voneinander getrennt. (B) A Hellfeldbild der primären Zellkultur 20 Stunden nach dem Ausplattieren. Primäre Zellen bereits Cluster bilden (große Pfeilspitze) und die Muskeln mit einer Niederlassung Morphologie (langer Pfeil) kann in diesem Stadium erkannt werden. (C) Ein Phasenkontrast-Bild der primären Kultur 5 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kultur sieht viel weiter fortgeschritten ist, mit neuronalen Erweiterungen (kleine Pfeile), neuronale Cluster (große Pfeile) und Muskeln (mittlere Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiele für primäre Zellen mit dsRNAs behandelt in einer 384-Well-Platte kultiviert Primäre Zellen wurden aus der Embryonen mit Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP-Transgene, in denen Dmef2-Gal4 und D42-Gal4-Laufwerk Ausdruck mito-GFP in den Muskeln und motorischen Neuronen bzw. isoliert. Die Zellen wurden mit dsRNAs gezielt entweder lacZ (AC) oder aufgeblasen (wenn) (DF) behandelt. Sowohl primäre Muskeln und Neuronen kann durch GFP (A, C, D, F) zu sehen. Die weißen Pfeile zeigen auf die neuronale Erweiterungen. Phalloidin-Färbung von Aktin (Pfeilspitzen) zeigt eine astähnlichen Muskulatur in der Kultur mit lacZ dsRNAs (B und C) behandelt, sondern Round-up Muskel-Morphologie in die Kultur mit, wenn behandelt dsRNAs (E und F). In der fusionierten Bilder (C, F), sind die Muskeln gelb gefärbt, aber rot negativen zeigt Neuronen und deren Erweiterungen (weiße Pfeile). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Konfokale Aufnahmen von primären Muskeln auf die menschliche Vitronektin-beschichteten Deckglas gleitet kultivierten Primäre Muskeln waren immunofluorescently mit anti-Titin Drosophila (KZ) (rot in der merge) und mit Phalloidin für Aktin (grün in der Zusammenführung) gefärbt. Die Top-Panels sind die Wildtyp-Kontrolle Muskel-und Unterseite diejenigen sind die schläge (CG31374) RNAi Muskel mit verkürzten Sarkomere.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

Die Entwicklungsmuster der primären Kulturen von Drosophila-Zellen können sehr unterschiedlich sein, was möglicherweise auf die verschiedenen Variablen während der primären Zelle Herstellungsverfahren. Zunächst fliegt zur Eiablage verwendet werden soll jungen (innerhalb einer Woche alt) und gesund (frei von viralen oder bakteriellen Infektion). Unbefruchtete oder infizierten Embryonen müssen vermieden werden, da sie nutzlos und werden die Zellen aus den Embryonen nicht unterscheiden kann und wird nur für 1-2 Ta...

<table><tbody><tr><td>Schields- und Sang-M3-Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Insulin aus Rinderpankreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Große Embryosammelkäfige</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 US-Norm-Sieb</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 US-Norm-Sieb</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 US-Norm-Sieb</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Dounce-Gewebehomogenisator, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Dounce-Gewebehomogenisator, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Dounce-Gewebehomogenisator, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 384-Well-Platte</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Kammerobjektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

primären zellkulturen aus drosophila gastrula embryonen

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung und Kultivierung primärer Zellen losgelöst von Drosophila Gastrula Embryonen. In kurzen, inszeniert eine große Menge von Embryonen von jungen und gesunden Fliegen gesammelt, sterilisiert und dann physisch trennen in einer einzigen Zellsuspension mit einem Glas-Homogenisator. Nachdem er auf Kulturplatten oder Kammer-Objektträgern in angemessener Dichte an Kultur-Medium, können diese Zellen weiter in mehrere morphologisch-verschiedene Zelltypen, die durch ihre spezifischen Zell-Marker identifiziert werden können differenzieren. Darüber hinaus präsentieren wir die Bedingungen für die Behandlung dieser Zellen mit doppelsträngiger (ds) RNA Gen-Knockdown zu entlocken. Effiziente RNAi in Drosophila primären Zellen erfolgt durch einfaches Baden die Zellen in dsRNA-haltigen Kulturmedium erreicht. Die Fähigkeit zur Durchführung von effektiven RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen, Cell Imaging-Analysen erlauben eine Vielzahl von Fragen, die in Drosophila primären Zellen, insbesondere in Bezug auf differenzierte Muskel-und Nervenzellen beantwortet werden.

Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst von<em&gt; Drosophil</em&gt; A Embryonen. Die Fähigkeit zur Durchführung der effektive RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen und bildgebenden Verfahren Zelle ermöglicht eine Vielzahl von Fragen, die in adressiert werden<em&gt; Drosophila</em&gt; Primärzellen.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation und Kultivierung primärer Zellen, die aus Drosophila-Gastrulationsembryonen dissoziiert wurden. Kurz gefasst wird eine große Menge an stadienbestimmten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung primärer Zellen aus dissoziierten Drosophila-Embryonen für die RNAi- und Zellbildanalyse zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Fliegenkäfige vorbereitet werden. Anschließend werden synchronisierte Embryonen gesammelt, gewaschen und homogenisiert, um die Zellen zu dissoziieren.Die primären Zellen werden anschließend ausplattiert und mit RNAi-Konstrukten transfiziert. Letztendlich können Ergebnisse mittels Immunfluoreszenzmikroskopie erzielt werden, die die Wirkung des RNAi in differenzierten primären Zellen zeigen. Mein Name ist Namo.Ich bin Professor an der Abteilung für Genetik der Harvard Medical School und Forscher am Overuse Medical Institute. Heute werden ich, Jonathan, ein Mitarbeiter im Labor sowie ehemaliger Postdoktorand des Labors, Ihnen die Technik zur Gewinnung primärer Zellen aus Oph-Gas oder Embryonen vorstellen. Diese Technik ist wichtig und hat eine Vielzahl von Anwendungen in der Zell- und Entwicklungsbiologie. Insbesondere, wie Janu vor einigen Jahren gezeigt hat, kann die Methodik für genomweite KI-Screens in primären Muskelzellen verwendet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Analyse etablierter immortalisierter Zelllinien liegt darin, dass die Primärzellkultur die Biologie des Organismus genauer widerspiegelt. Im Allgemeinen werden Personen, die diese Methode anwenden, Schwierigkeiten haben, da mehrere Schritte nicht einfach durch das Lesen der Anweisungen erlernt werden können. Um abgetötete Hefe-Paste herzustellen, mahlen Sie zunächst Granulat aus lebender Hefe mit einer Kaffeemühle zu einem feinen Pulver, geben es anschließend in ein Becherglas und autoklavieren es mit einem 20-minütigen Trockenzyklus. Unmittelbar nach dem Autoklavieren.Geben Sie sterilisiertes heißes Wasser in ausreichender Menge zum Hefe hinzu, um eine Paste mit der Konsistenz von Zahnpasta zu erhalten. Um primäre Zellen, die aus Fliegenembryonen dissoziiert wurden, vorzubereiten, ziehen Sie einen Wildtyp-Stamm von Drosophila, wie beispielsweise Oregon R, in frischen Fläschchen heran und überführen Sie neu gelegte Eier tragende Fliegen (ELOs) in große Embryosammelkäfige oder Fliegenpopulationskäfige. Danach bringen Sie die Käfige in einen Raum mit etwa 25 Grad Celsius und 65 % Luftfeuchtigkeit bei einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel, um die Sammlung synchronisierter Embryonen zu erleichtern, und füttern Sie die Fliegen mit abgetöteten Hefen.Hefe-Paste auf Melassescheiben aufgestrichen. Ersetzen Sie die Nährböden einmal täglich für zwei bis drei Tage. Am Tag der primären Zellpräparation füttern Sie die Fliegen mit frischen Böden für eine Vorlegephase von ein bis zwei Stunden.Kurz vor dem 12-stündigen Dunkelzyklus ersetzen Sie die Prä-Lay-Platten durch frische Melasseplatten, die mit einer minimalen Menge Hefe-Paste bestrichen wurden. Entsorgen Sie die Prä-Lay-Sammlung, die asynchrone ältere Embryonen enthält.Sammeln Sie die Embryonen über einen Zeitraum von einer bis zwei Stunden. Entfernen Sie die Platten mit der relativ synchronen Population von Embryonen und lagern Sie sie bei 25 Grad Celsius für fünf bis sechs Stunden. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Embryonen im fortgeschrittenen Gastrulationsstadium, um sie zu sammeln.Nach der fünf- bis sechsstündigen Inkubation mit einem feuchten Pinsel vorsichtig von den Platten lösen. Anschließend in einen Satz gestapelter Siebe geben und gründlich abspülen, um so viel wie möglich Hefe und Fliegenreste zu entfernen, wobei die Embryonen im untersten Sieb gesammelt werden.Neigen Sie das Sieb, sodass sich die Embryonen auf einer Seite ansammeln, und spülen Sie sie vorsichtig vom Sieb in einen Dekorationskorb. Anschließend sterilisieren und beschichten Sie die Embryonen, indem Sie sie während der Inkubation fünf bis zehn Minuten lang in 50 % (Volumen pro Volumen) Bleiche eintauchen.Füllen Sie es mit Medium auf Raumtemperatur bis zum Homogenisator auf, sodass ein Volumen von nicht mehr als 0,5 Milliliter Embryonen pro 40 Milliliter Medium erreicht wird. Spülen Sie anschließend die Embryonen mit 70 %iger (Volumen pro Volumen) Ethanol von der Wand des Korbs ab.Spülen Sie die Embryonen gründlich mit destilliertem Wasser aus dem Autoklaven, um die Bleichmittel- oder Ethanolreste zu entfernen. Anschließend tauchen Sie die gespülten Embryonen in M-three-Medium ein. Lassen Sie die Embryonen in einem sterilisierten Becher zwei bis fünf Minuten lang einweichen, während die Embryonen inkubieren; bauen Sie dann den Dekorationskorb auseinander und tupfen Sie das NYX-Netz mit sterilisierten Papiertüchern trocken.Nachdem die Embryonen in M-drei-Medium eingeweicht wurden, überführen Sie sie mit einem sterilisierten Pinsel in den Homogenisator, homogenisieren Sie vorsichtig mit kurzen Stößen unter Verwendung eines losen Stößels und vermeiden Sie es, diesen bis zum Boden des Röhrchens zu drücken, wenn alle Embryonen suspendiert sind; homogenisieren Sie dann sanft, aber gründlich mit acht vollständigen Stößen. Drehen Sie den Stößel nicht, während er sich auf und ab bewegt. Überführen Sie das Homogenat entweder durch Ausgießen oder Pipettieren in ein steriles kegelförmiges 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verschließen Sie das Röhrchen; zentrifugieren Sie es 10 Minuten bei 40 g bei Raumtemperatur, um Gewebereste, große Zellklumpen und fetale Membranen zu pelletieren.Überführen Sie den Snat mit den Zellen und dem Eigelb in ein sauberes Gefäß und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt für fünf Minuten. Danach überführen Sie vorsichtig den Überstand durch Gießen oder Pipettieren in ein sauberes Gefäß und zentrifugieren 10 Minuten bei 360 Gs bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren; verwerfen Sie anschließend den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter kulturmediumfreiem, serumfreien Medium für RNAi-Experimente.Um die Zelldichte zu schätzen, zählen Sie die vitalen Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut mit 360 ×g. Resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem M3-Medium bei einer Konzentration von ein bis fünf mal 10⁶ Zellen pro Milliliter und geben Sie sie mit 1,7 bis 2,5 mal 10⁵ Zellen pro Quadratzentimeter in jedes Loch einer 384-Well-Platte.Geben Sie in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte fünf Mikroliter doppelsträngiger RNA mit einer Endkonzentration von etwa 250 Nanogramm pro Vertiefung. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter primärer Zellen mit einer Dichte von ein- bis viermal 106 Zellen pro Milliliter in serumfreiem M3-Medium in jede Vertiefung der 384-Well-Platte. Alternativ können die Zellen auch auf acht-Well-Glaskammerobjektträgern zur konfokalen Bildgebung kultiviert werden.Zentrifugieren Sie die Platten eine Minute lang bei Raumtemperatur mit 300 × g. Stellen Sie die Platten 22 Stunden lang bei 25 Grad Celsius oder ein bis zwei Tage bei 18 Grad Celsius. Geben Sie zusätzlich 30 Mikroliter Serum, das M3-Kulturmedium enthält, zu jedem hinzu.Zentrifugieren Sie die Platten gut für eine Minute bei 300 × g bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die primären Zellen zusätzlich fünf bis sieben Tage bei 25 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Bilden Sie die Zellen abschließend entweder lebend oder nach Immunfluoreszenz-Färbung ab.Unter optimalen Bedingungen sehen die Zellen und die Kultur gesund aus. Bei runder Morphologie weist die Kultur wenig Zelltrümmer auf und ist zu 50 bis 80 % konfluent. Nach der anfänglichen Aussaat durchlaufen die Zellen morphologische Veränderungen und sind nach etwa fünf bis acht Tagen bei 25 Grad Celsius vollständig differenziert. Diese Hellfeldaufnahme zeigt ein Beispiel für primäre Zellen unmittelbar nach der Aussaat.Die Mehrheit der Zellen ist 20 Stunden nach der Aussaat rund, intakt und gut separiert. Die primären Zellen bilden bereits Cluster, und Muskeln mit einer verzweigten Morphologie sind in diesem Stadium erkennbar. In dieser Phase wirken kontrastverstärkte Bilder von primären Zellen, die fünf Tage lang kultiviert wurden, deutlich weiter entwickelt mit neuronalen Fortsätzen, neuronalen Clustern und Muskeln.In diesen Beispielen wurden Primärzellen aus Embryonen isoliert, die die Transgene DMF zwei GAL vier D 42 G vier und UAS mito GFP tragen, wobei DMF zwei G vier und D 42 G vier die Expression von MIT GFP in Muskelzellen bzw. motorischen Neuronen steuern. Die Zellen wurden mit doppelsträngigen RNA-Molekülen behandelt, die entweder gegen LA C oder gegen inflated gerichtet waren. Diese Fluoreszenzbildaufnahme zeigt sowohl differenzierte primäre Muskelzellen als auch Neuronen, die im Kulturansatz, der mit kontrollierten doppelsträngigen RNA-Molekülen gegen LA C transfiziert wurde, GFP exprimieren. Der weiße Pfeil zeigt auf neuronale Fortsätze, während die Pfeilspitze auf eine verzweigte, muskelähnliche Struktur deutet. Werden die differenzierten Muskeln mit Phin gefärbt, weisen mehr als die Hälfte der Muskeln eine verzweigte Struktur auf, während der Rest eine abgerundete Morphologie zeigt.Im überlagerten Bild sind die Muskeln gelb und die neuronalen Strukturen grün angefärbt. Dieses Fluoreszenzbild zeigt sowohl differenzierte primäre Muskeln als auch Neuronen, die GFP exprimieren, in der Kultur mit doppelsträngigen RNA-Molekülen, die gegen inflated gerichtet sind, oder wenn der weiße Pfeil auf neuronale Fortsätze zeigt, während die Pfeilspitze auf den Muskel zeigt, wenn mit phin-Färbung visualisiert wird. Im Gegensatz zu den Wildtyp-Kontrollen, die verzweigte Muskelstrukturen aufweisen, sind hier alle Muskeln rundlich; in diesem überlagerten Bild sind die Muskeln gelb angefärbt, während die neuronalen Strukturen grün erscheinen.Beachten Sie, dass in dieser Kultur, die mit doppelsträngigen RNA behandelt wurde, lediglich eine aufgerundete Muskelmorphe sichtbar ist. Während die neuronalen Fortsätze denen in Wildtyp-Kontrollen ähneln, zeigen diese Bilder primäre Muskelzellen, die mit Anti-Drosophila-Titin in Rot und Phalloidin, das Aktin in Grün markiert, fluoreszenzgefärbt wurden. Diese Felder zeigen Wildtyp-Kontrollmuskeln, während jene Muskelzellen, die mit RNAi behandelt wurden, Muskeln darstellen, die sich mit verkürzten Sarkomeren entwickelt haben.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets genau dem Protokoll zu folgen, um vergleichbare Ergebnisse über alle Experimente hinweg zu erzielen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Anwendung innerhalb von zwei bis vier Stunden durchgeführt werden.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Eine Langzeitkonservierungsmethode für Drosophila-Stämme als Alternative zum häufigen Umtopfen von adulten Fliegen in frische Fläschchen ist sehr wünschenswert. Dieses Protokoll beschreibt die Kryokonservierung von Drosophila-Urkeimzellen und die Wiederbelebung von Stämmen durch ihre Transplantation in agametische Wirtsembryonen.

Kryokonservierung von Primordialen Keimzellen und Wiederbelebung von Drosophila-Stämmen

Erfahren Sie die Herstellung primärer Zellkulturen aus Drosophila-Gastrulaembryonen für RNAi- und Bildgebungsanalysen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Genstudien in Zell- und Entwicklungsbiologie.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

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