Name: Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Infektion von Anopheles-Mücken mit Plasmodium falciparum und zur Bestimmung des Infektionsphänotyps im Mitteldarm. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Malarienübertragung.

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A. Herstellung von gametocyte Kultur: <ol><li> Bringen Sie frischen menschlichen Blut und Serum auf 37 o C in einem Wasserbad. </li><li> In einem Abzug, unter sterilen Bedingungen, pipet 1 ml warmes Blut in ein Eppendorf-Röhrchen. Drehen Sie das Blut in eine Zentrifuge für 5 Minuten bei 2200 Umdrehungen pro Minute. Erythrozyten sollten pelletiert; entfernen und entsorgen das klare Serum. Wash Erythozyten mit dem gleichen Volumen der neuen Serum 3 mal das ganze Blut für die gametocytes erhalten. </li><li> Rufen Sie die gametocyte Kultur aus dem CO 2-Inkubator oder Windlicht. Diese Kultur sollte auf RPMI Medien und gefüttert, um die Mücken am Tag 16 der Kultur gepflegt werden. Zur Bestimmung der gametocytemia% (am Tag 16 der Kultur) eine dünne Schicht auf eine Glasplatte mit einem Tropfen Blut und führen Sie eine Geimsa Fleck. Bestimmen Sie die Anzahl der Gameten in einem Feld des Parasiten Kultur. Es ist in der Regel im Bereich von 2 bis 4%. Berechnen Sie das Volumen von Vollblut, die Sie benötigen, um die gewünschte endgültige% gametocytemia (0,3 -1%) zu erreichen. </li><li> Entfernen Sie die meisten Medien von Ihrem gametocyte Kultur mit einer Pipette, dabei nicht zu stören oder zu saugen die Parasiten (Schmarotzer erscheint als schwarz, während die Medien werden rosa / rot). Pipettieren der Rest der Medien und Parasiten in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Spin in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 2200 Umdrehungen pro Minute. Parasiten und Erythrozyten Pellet, entfernen und entsorgen Medien Überstand ohne störende Parasiten. </li><li> Kombinieren Parasiten mit dem Volumen der vorbereiteten Vollblut (aus Schritt A2), um Ihnen die gewünschte endgültige gametocytemia nach den bisherigen Berechnungen. Pipettieren gründlich mischen. (~ 1 Minute) </li></ol> Dies ist nun das Beispiel, das Sie zu Ihrem Mücken ernähren. Halten bei 37 o C in einem Wasserbad. B. Fütterung Moskitos: <ol><li> Legen Sie Ihre Anopheles-Mücken (~ 30-50) in Wachs ausgekleideten Karton Tassen mit Netzgewebe durch ein Gummiband oder Pappdeckel mit Becher geliefert gesichert abgedeckt. Wir verwenden eine batteriebetriebene Sauger für diesen Schritt. </li><li> Bereiten Sie die Durchblutung Wasserbad durch Einfügen Düsen auf beiden Seiten des Glases Zubringer zu Gummischlauch. Schließen Sie so viele Anleger, wie Sie in einer Reihe müssen, ein Ende der Serie sollte durch Schlauch mit dem Thermostat des Wasserbades (der Teil, Wasser drückt durch den Zubringer) angeschlossen werden, sollten Sie das andere Ende der Reihe von Gummischlauch bestehen untergetaucht in der Wanne, damit der Kreislauf Wasser leer zurück ins Bad. Schalten Sie das Bad, bis das Wasser etwa 37 o C und das Wasser wird durch den Anleger im Umlauf und zurück in die Badewanne. Dies ist notwendig, um das Blut warm zu halten und halten die Parasiten am Leben. </li><li> Bereiten Sie die Membran (wir kleine Quadrate gestreckt Parafilm) durch Strecken rund um die Glasmembran Anleger, mit Druck dicht zu verschließen, um die Zuführung Öffnung. Diese Membran wird imitieren die Haut. </li><li> Legen Sie einen Feeder-Membran-Seite nach unten auf die einzelnen Moskito-Cup und sichere Anleger mit Klammern oder Klebeband. Die Membran sitzen sollte mit dem Netz bündig so Mücken kann man aus dem Inneren der Tasse zugreifen. </li><li> Sorgfältig Pipette Parasiten Blutmahlzeit (aus Schritt A5) in den Hals des Anlegers, so dass das Blut geht den ganzen Weg durch den Hals in das Reservoir, Kontaktierung der Membran, so dass die Mücken das Blut zugreifen können. Wir verwenden etwa 200 ul Blut pro System, aber das kann variieren. </li><li> Lassen Mücken zu füttern. Wir können sie für ≈ 30 Minuten Feed (variabel, je nach theexperiment; für die meisten Experimente, gelegentlich kontrollieren, wie viele haben bereits eine Mahlzeit suchen Sie in das Blut-Gehalt in den Bauch getroffen.) </li><li> Nach der Fütterung, Abrüsten von der Mücke Tassen. Schalten Sie das Wasserbad und ziehen Anleger von Schläuchen. </li><li> Entfernen Sie die Membran und genießen Anleger in 10% Bleichmittel zu dekontaminieren und mit Wasser abspülen. Kontaminierte Materialien (Membranen, Papiertücher, Handschuhe, etc.) in einen kleinen Beutel für biologisches Risikomaterial und Einzahlung in einen großen Behälter biohazard. </li><li> Anesthetize Mücken, indem Tassen im Kühlschrank oder Kühlraum. Sobald Mücken sind voll narkotisiert, übertragen Sie sie auf eine Petrischale in einem Eiskübel eingebettet. Sortieren Moskitos, suchen Sie genau auf den Bauch auf Anzeichen einer Blutmahlzeit, und entsorgen Sie diejenigen, die nicht eingezogen hat. Einige Moskitos voll engorged werden, während andere ein schmales verzehrte Blut zeigen wird, alle sind akzeptabel, &quot;gefüttert&quot;. Legen Sie die gefüttert Moskitos wieder in den Pappbecher. </li><li> Geben Sie einen Zucker essen (ein Stück Baumwolle in 10% Saccharose eingeweicht), um Mücken, und inkubieren unter normalen Bedingungen Insektarium für 7 Tage. Jeden Tag sollten die Mücken für die Sterblichkeitsrate überwacht werden. Auch sollte die Baumwolle nass mit der Saccharose werden, so dass sie nicht die Nahrung entzogen. Es ist besser, noch ein Papiertuch in destilliertem Wasser getränkt hinzuzufügen, zu halten die Mücken feucht. Diese Mücken sind P. falcipraum infiziert, so dass alle darauf geachtet werden muss, damit keine Mücken können escape aus dem Becher. Am besten ist es die Tassen in einem kleinen cagefor doppelten Schutz zu stellen. </li></ol> C. Dissecting Mücke Mitteldärmen und Schätzung oocyst Lasten: <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in"> Absaugen Mücken (aus Schritt B) aus Pappbecher mit einer Batterie betrieben Aspirator. Anesthetize Mücken, die in dem herausnehmbaren Aspirator Reservoir sind, indem sie zu einem kalten Raum oder Vergraben des Reservoirs in Eis für mindestens 5 Minuten oder bis Mücken nicht mehr bewegt. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Transfer betäubt Mücken aus dem Reservoir zu einer Glas-Petrischale in Eis eingebettet. Verbreiten Sie die Mücken zu einer einzigen Schicht und Abdeckung mit einer Kunststoff-Petrischale Deckel. Mücken, die nicht auf den Teller untergebracht werden können bleibt im Behälter, die kalten Raum oder Eis zurückgekehrt ist. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Mit spitzen Pinzette, Übertragung einer Mücke aus der Schüssel zu 100 ul PBS auf einem Objektträger unter einem Dissektionsmikroskop montiert enthalten. Lassen Sie die anderen in der gekühlten Petrischale abgedeckt. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Mit spitzen Pinzette, halten Mücken an der Brust und der hintere Bauch. Ziehen Sie den Körper auseinander, bis die Mitteldarm ausgesetzt ist. Verwenden einer Pinzette, um überschüssiges Gewebe aus gut.The gut entfernen sieht aus wie eine weiße, sackartige Körper. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe aus der gut.Mount den Darm in eine Vertiefung einer 12-well Objektträger aus Glas und tauchen in 5-10 ul von 0,2% Mercurochrom. Squash die Karkasse und entsorgen auf feuchtem Papier towel.Continue für andere Mücken, bis der 12-Well-Rutsche ist voll. Bedecken Sie den Mut montiert mit einem Deckglas. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Untersuchen Sie Mut unter einem Lichtmikroskop auf der Suche nach runden Oozysten, die leuchtend rosa gegen den klaren / zartrosa Darmgewebe Fleck. Graf Oozysten, aufnehmen und weiter auf die nächste Probe. Weiter für alle die Moskitos aus allen experimentellen Behandlungen. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Wenn Sie fertig sind, wischen Sie gleiten sauber mit einem Papiertuch. Legen Sie das Papiertuch mit Mut und Papiertuch mit Kadavern, in kleine Beutel für biologisches Risikomaterial und entsorgen Sie in den Papierkorb. Handschuhe sind im gesamten Verfahren getragen. Es wird darauf geachtet, keine infizierten Mücken entweichen zu lassen. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
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<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

Es kann einige Variationen in der Plasmodium-Infektion und Infektion Phänotyp Bestimmung und verschiedenen Labors unterschiedliche Techniken zu folgen.

protokoll für plasmodium falciparum-infektionen in mücken und infektionsbiologie phänotyp bestimmung

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Sobald ein Gen als potenziell resistent gegen Malaria identifiziert wurde, muss es im Hinblick auf seine Rolle bei der Verhinderung von Plasmodium-Infektionen innerhalb der ... evaluiert werden.

Ich bin George Dimopoulos am Malaria-Forschungsinstitut der Johns Hopkins School of Public Health, und jetzt zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man Anopheles gambiae-Mücken mit Plasmodium falciparum-Parasiten infiziert und wie man das Infektionsphänotyp im Mückenmitteldarm bestimmt. Für dieses Verfahren werden grundsätzlich folgende Geräte benötigt: ein CO2-Inkubator für die Parasitenkultur. Alternativ, falls kein CO2-Inkubator verfügbar ist, kann ein Kerzengefäß verwendet werden.Wir benötigen natürlich auch ein Insektarium sowie Standardgeräte der Molekularbiologie und Zellbiologie wie Präparationsmikroskope und Lichtmikroskope. Wir benötigen Wasserbäder, ein Membranfütterungssystem für Mücken und Zentrifugen.Hallo, mein Name ist ISH und ich befinde mich im Labor von Dr. George Depos. Ich bin Postdoktorandin. Mein Name ist Lindsay Garver und ich bin Doktorandin.Der erste Schritt der Plasm-Infektion besteht darin, die Plasm-Kultur vorzubereiten. Falls Sie keinen Kohlendioxid-Inkubator haben, können Sie ein Kerzen-Gefäß verwenden, in das Sie die 6-Loch-Platte mit der Gato-Set-Kultur stellen, die Kerze anzünden und anschließend das Gefäß verschließen. Der erste Schritt ist es, frisches menschliches Blut und Serum bereitzustellen und diese zunächst bei 37 °C in einem Wasserbad zum Auftauen und Erwärmen zu bringen, da Sie wirklich warmes Blut und warmes Serum benötigen.Um das Blut vorzubereiten, müssen Sie ein Tier für frisches menschliches Blut in einem Eppendorf-Röhrchen bereitstellen. Ja, das frische Blut muss fünf Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert werden, um die Erythrozyten abzutrennen. Nach Beendigung der Zentrifugation muss die klare Überstände verworfen und das rote Pellet, das die roten Blutkörperchen (RBC) darstellt, dreimal in menschlichem Serum gewaschen werden.Wir geben ein gleiches Volumen menschliches Serum zum Pellet hinzu, mischen sie und zentrifugieren erneut bei 2000 U/min für fünf Minuten. Dieser Schritt wird dreimal wiederholt. Schließlich liegen Pellets aus roten Blutkörperchen bereit, um der Ganot-Kultur zugegeben zu werden.Okay, die Plasmodium-Kultur, die sich im CO2-Inkubator befindet, muss 16 Tage lang in RPMI-Medium gepflegt werden, und am Tag 16 sind sie bereit für die Infektion. Da wir mit der Plasmodium-Kultur arbeiten, ist bei jedem Schritt Vorsicht geboten. Der erste Schritt besteht darin, dass die Parasiten in einem Biosicherheitsstufe-2-Labor gezüchtet werden müssen und dies in einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden sollte.Alle Pipettenspitzen und alle Zubehörteile müssen in eine Biohazard-Box entsorgt werden, und alle anderen Lösungen müssen wie unser Pipettenreiniger behandelt werden. Sie müssen mit 10 % Bleichmittel gewaschen werden, und Sie müssen Handschuhe tragen. Laborkittel aus der Kultur vom Tag 16 müssen einen kleinen Blutstropfen auf einem Objektträger aufbringen, einen Ausstrich herstellen und eine Färbung durchführen sowie eine Untersuchung am Lichtmikroskop vornehmen.Wir können den GAMMAT-Prozentsatz aus der 16 Tage alten Gametozytenkultur bestimmen. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums, wobei darauf geachtet werden muss, die Parasiten am Boden des Wells nicht zu stören oder aufzusaugen; lassen Sie den Rest des Mediums und die Parasiten im Well. Verteilen Sie die Parasiten in den roten Blutkörperchen gleichmäßig, um die Parasiten zu lösen, die dann in eine Zentrifuge gegeben wird, um fünf Minuten bei 2000 U/min zu zentrifugieren.Nach der Zentrifugation pelletieren die Parasiten zusammen mit den roten Blutkörperchen. Die Überstände sind das RPMI-Medium, und am Boden befindet sich das Pellet mit den Parasiten. Zusammen mit den roten Blutkörperchen entfernen Sie die Flüssigkeit, also das RPMI.Bei der Handhabung des Kulturmediums sollte darauf geachtet werden, den Parasiten und die roten Blutkörperchen nicht zu stören. Der GATOT-Prozentsatz, der durch die GIMs 10 bestimmt wird, liegt gewöhnlich im Bereich von zwei bis 4 %. Sobald die roten Blutkörperchen und die Parasiten nach der Zentrifugation bereit sind, werden sie miteinander vermischt, und das hinzuzufügende Blutvolumen ergibt sich aus dem gewünschten Endwert des GATOT-Prozentsatzes. Dieser muss akut sein und liegt üblicherweise zwischen 0,3 und 1 %; dieser Wert wird für die Fütterung der Phys-Mücken verwendet.Für die Presidium S-Infektion handelt es sich um einen Glasfütterer, den wir für die Membranfütterung der Mücken verwenden. Wir geben das Blut durch das kleine Loch, das Sie sehen, hinein, und es wird darin aufgefangen. An der Unterseite befinden sich seitlich zwei Düsen, die mit unserem Wasserbad verbunden sind, das bei 37 Grad erwähnt wird.Um den Futterbehälter für die Fütterung vorzubereiten, nehmen wir ein kleines Stück Affil. Wir dehnen es von beiden Enden aus an allen vier Seiten und legen es dann auf die offene Seite des Glasfutterspenders, sodass eine dünne Membranschicht entsteht, die der Haut nachempfunden ist. Dies wird als Membranfütterung bezeichnet.Dies ist ein Zirkulationswasserbad, das das Wasser bei 37 hält und gleichzeitig das Wasser durch den Glaszuführer zirkulieren lässt, sodass das Blut warm bei 37 bleibt. Wir verbinden daher den Glaszuführer über die kleinen Kapillaren mit dem Zirkulationswasserbad und schalten das Wasserbad ein, damit das Wasser zirkuliert; das Wasser und das Blut vermischen sich dabei nie, da sie sich in zwei getrennten Kammern befinden. Dies ist ein kleiner Behälter mit den phis-Gambi-Mücken.Zunächst wird der Glasfütterer auf den Käfig gesetzt und ein Gewicht auf den Glasfütterer gelegt, sodass die Membran, also das Phim, bündig mit dem Maschennetz abschließt. Etwa 200 Mikroliter des Blutes, das die Parasiten enthält, zusammen mit dem erforderlichen Gambotto-Prozentsatz werden dem Fütterer hinzugefügt, wobei sichergestellt wird, dass das Blut vollständig nach unten fließt und die Mücken Zugang zum Blut haben.Die Fütterung wird etwa 30 Minuten lang fortgesetzt. Sobald die Fütterung abgeschlossen ist, wird der Glasfütterer gründlich mit 10 % Bleichmittel gespült, und alle übrigen Membranen und das Klebeband werden entfernt und in einer Biohazard-Box entsorgt. Nach der Blutfütterung müssen die ungefütterten Mücken von den gefütterten getrennt werden.Dazu haben wir die Mücken betäubt, indem wir die kleinen Becher mit den blutgefütterten Mücken für fünf bis zehn Minuten in einen Kühlschrank gestellt haben. Wie wir sehen können, sind die Mücken bereits durch die Kälte betäubt. Wir öffnen den Deckel und überführen die Mücken in eine kleine Petrischale, die auf einem Eisbehälter steht, damit die Mücken während des gesamten Vorgangs kalt gehalten werden und nicht entkommen können.Denken Sie daran, dies sind mit Plasmodien infizierte Mücken, daher ist äußerste Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass sie nicht entweichen. Sobald die Mücken im Kühllabor betäubt sind, überführen wir sie in das normale Insektarium, das bei Raumtemperatur gehalten wird. Allerdings stellen wir die Mücken stets in eine Petrischale, die in einem Eiskübel aufbewahrt wird, sodass sie stets betäubt bleiben. Sie können sehen, wie die gefütterten Mücken von den ungefütterten getrennt werden können.Die gesättigten Exemplare enthalten Blut. Sie sind vollständig aufgequollen. Einige von ihnen haben teilweise Blut aufgenommen, sodass sie nicht vollständig aufgequollen sind.Sie haben wenig Blut in ihrem Abdomen, während andere viel Blut im Abdomen haben. Die UNFI-Exemplare weisen kein Blut in ihrem Abdomen auf, sodass man leicht zwischen gefütterten und ungefütterten Tieren unterscheiden kann. Gezeigt sind hier adulte weibliche Mücken, die mit Blut gefüttert wurden. Wir werden daher diese Mücken von der Petrischale in mit Wachsfaden markierte Pappbecher überführen.Nachdem die blutgefütterten Mücken in die Becher gegeben wurden, legten wir ein kleines Stück Baumwolle, das in 10%iger Saccharose getränkt war, hinein, damit sie sich sieben Tage lang von der 10%igen Saccharose ernähren können, während der Inkubationszeit. Außerdem fügten wir ein kleines gefaltetes Papiertuch hinzu, um die Feuchtigkeit im Becher zu regulieren, und deckten den Becher mit einer Petrischale ab. Die mit Plasmodien infizierten Mücken werden in einen weiteren kleinen Käfig gestellt, der doppelten Schutz bieten muss; diesen Käfig stellen wir in ein Biosicherheitslabor der Stufe 3, das bei 27 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Sieben Tage nach der Blutmahlzeit werden die Mücken, die im Insektarium in einer doppelt gesicherten Käfigbox aufbewahrt wurden, aus dem Insektarium genommen und in den Kühlraum gebracht, um die Mücken zu betäuben.Nachdem die Mücken betäubt sind, werden sie in eine Petrischale überführt, die auf einem Eiskübel steht. Nun bereiten wir uns darauf vor, die Mücken zu dissezieren. Wir werden den Mitteldarm dissezieren und nach der Zyste suchen.Der erste Schritt besteht darin, hundert Mikroliter PBS auf einen Objektträger zu geben, der auf einem Stereomikroskop befestigt ist. Im nächsten Schritt verwenden wir eine Pinzette. Wir übertragen einen einzelnen Mücken aus der Petrischale in das PBS, das sich auf dem Objektträger befindet, der auf dem Stereomikroskop befestigt ist.Die anderen verbleiben noch auf der gekühlten Petrischale. Um die Mücken zu dissezieren, halte die Mücken mit einer der Pinzetten am Thorax und mit einer weiteren Pinzette am hinteren Abdomen. Ziehe dann langsam an dem Körperteil, bis der Mitteldarm freigelegt ist.Es sieht aus wie ein weißer Sack, entfernen Sie mit einer Pinzette das überschüssige Gewebe und die anderen Körperteile. Ja, dies ist der Mitteldarm, der einem weißen sackartigen Körper ähnelt und das Os besitzt. Wir überführen diesen Mitteldarm nun in eine 12-Loch-Glasplatte und tauchen ihn in fünf bis 10 Mikroliter einer 0,2-%-Lösung von Micropro, wodurch der Mitteldarm auf dem Objektträger fixiert wird.Mit dem Deckglas führen wir diesen Schritt für alle infizierten Mücken durch. Der Darm erscheint hellrosa, und wir übertragen diesen Objektträger unter ein Lichtmikroskop, um die OS-Belastung zu zählen. Wir betrachten nun den aus den infizierten Mücken präparierten Mitteldarm.Der Mitteldarm sieht aus wie ein schlanker Körper und hat mit der Rom-Färbung eine ganz leicht rosafarbene Färbung, und die O-SST sollte ein leuchtendes Rosa gegenüber dem schwachen rosafarbenen Gewebe des Darmes aufweisen. Diese Mitteldärme stammen zwar von infizierten Mücken, zeigen jedoch keine SST, weshalb sie möglicherweise nicht infiziert sind. Falls ein Mitteldarm jedoch infiziert wäre, hätte sich die SST als kleiner, hellrosa Kreis gezeigt, und es kann zwischen 22 und 500 gelegentlich innerhalb eines einzigen Mitteldarms zahlreiche Lag geben.Dieses Verfahren beinhaltete die Infektion menschlichen Blutes mit Plasmodium-Rum-Parasiten, die Fütterung dieser infizierten Blutprobe an ly-Gambianer-Mücken, die Dissektion des Mitteldarms dieser Mücken sowie die Bestimmung der OSIS-Zahlen in diesen infizierten Mitteldärmen. Diese Technik ist wichtig, da sie die der menschlichen Malariainfusion am nächsten kommende Annäherung darstellt, die im Labor reproduziert werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen...

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden.  Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Detaillierte Untersuchungen an Mückenstadien von Malariaparasiten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Blockierung der Übertragung zu entwickeln. Dieses Protokoll zeigt, wie man infektiöse Gametozyten effektiv kultiviert und diese Gametozyten dann an Moskitos verfüttert, um Mückenstadien von P. falciparumzu erzeugen.

Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Dieses Protokoll beschreibt einen Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Speicheldrüsen-Sporozoiten in Mücken. Unter Verwendung leicht verfügbarer monoklonaler Antikörper ermöglicht die Methode einen kostengünstigen Hochdurchsatznachweis von Mücken, die Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax tragen. Die Methode eignet sich für die Erforschung der Malariaübertragung, einschließlich Vektoruntersuchungen.

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Die sexuelle Entwicklung des Plasmodiums findet im Mitteldarm der Mücke statt. Die sexuellen Stadien des Parasiten ins Visier zu nehmen, ist eine vielversprechende Strategie, um die Übertragung zu blockieren. Wir haben Ookluc entwickelt, eine transgene P. berghei, die nach der Zygotenbildung Nanoluziferase exprimiert und ein Hochdurchsatz-Screening von transmissionsblockierenden Verbindungen ermöglicht. In diesem Artikel werden die Methoden für das Screening mit Ookluc beschrieben.

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

Erfahren Sie die Methode zur Infektion von Anopheles-Mücken mit Plasmodium falciparum und zur Bestimmung des Infektionsphänotyps im Mitteldarm. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Malarienübertragung.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

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