Name: In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Leer hoe je Drosophila melanogaster larven anestheseert en beeldt met desflurane voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode biedt subcellulaire resolutie en 95% overleving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Andreas Schönle, Max-Planck-Instituut voor Biofysische Chemie, Duitsland en David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA voor technisch advies. Wij danken Frank Kotting, European Neuroscience Institute, Göttingen voor de bouw van de beeldvorming kamer en de verdoving apparaat. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Alzheimer Forschung Initiative TMRYZ werd ondersteund door een gemeenschap van de China Scholarship Council, SBH door een gemeenschap van de Graduate School for Cellular and Molecular Neuroscience, Universiteit van Tübingen.

A) Montage van de imaging-kamer <ol><li> Selecteer een larve van de gekozen fase (bijv. vroege 3e instar larven verlaten van een observatie-interval van ongeveer 24 uur bij 25 ° C tot zwervende stadium). </li><li> Spoel de larve met water te reinigen van het kweekmedium en dep het droog. </li><li> Smeer het midden van het onderste element van de kamer, de regio om de larve gezicht, met een dunne film van de halogene olie. </li><li> Zet de larve met de ventrale zijde naar de microscoop doel in de kamer (maakt neuromusculaire junctie (NMJ) 26 en 27 af te beelden) (Figuur 1 AE). </li><li> Plaats de plastic spacer op de olie-laag, met de lucht sleuven van het raster gezicht naar boven (Figuur 1 A). Controleert bij deze stap: De hoogte van de spacer is ongeveer de helft van de larven diameter, moet de breedte van de gleuf worden ongeveer twee keer de diameter van de larve. </li><li> Plaats de beeldvorming kamer op de microscoop </li></ol> B) verdoving van de larve <ol start="7"><li> Sluit de twee inhammen van de kamer met een geschikte verdoving apparaat / verdamper. Controleer up-front: De effectieve concentratie van desfluraan in de ruimte-lucht mag nooit hoger zijn dan door de veiligheidsvoorschriften in acht! Slechts een zeer klein totaal volume van desfluraan is nodig om larven verdoven. De toepassing van 15% (v / v) van desfluraan 1 heeft zich bewezen als een goed uitgangspunt voor het bepalen van de ideale concentratie om gebruikt te worden in een experiment. Om veiligheidsredenen raden wij de vaporizer nooit moet bevatten meer desfluraan dan nodig voor 2-4 uur van in vivo beeldvorming. </li><li> Dompel het andere uiteinde van de buis aan de kamer stopcontact in een glas water en open de kleppen regelen van de doorstroming van de narcose in de kamer voor ongeveer vijf seconden. Controleert bij deze stap: Doe luchtbellen opstijgen in het water? Als dat niet de kamer is lekkende. </li><li> Sluit de kleppen voor ongeveer drie seconden. </li><li> Monitor resterende larvale bewegingen in de microscoop. Controleer zowel de hartslag en spierbewegingen. Indien nodig openen en sluiten van kleppen, zoals beschreven in stap 8 en 9 tot verdoving van de larve is voltooid, sluit vervolgens alle kleppen en start beeldvorming. Controleert bij deze stap: Resterende spierbeweging of hartslag geeft aan dat de larve niet goed verdoofd. Volledige verdoving is van vitaal belang voor hoge resolutie beelden. De larve moet normaal niet verdoofd worden voor langer dan 15-20 minuten op een gegeven moment. </li></ol> C) Imaging <ol start="11"><li> Bepaal de juiste positie en het imago van de structuur van belang (figuur 2-4). </li></ol> D) Herstel van verdoving <ol start="12"><li> Na de beeldvorming is voltooid laat lucht in de kamer. Controleert bij deze stap: Controleer hartslag en spiercontracties van de larve door doorgelaten halogeenlicht. Als spieren beginnen aanbestedende het veilig is om de larve te verwijderen uit de beeldvorming kamer. </li><li> Maak de kamer van de verdoving apparaat en verwijder deze uit de microscoop. Demonteer voorzichtig de kamer en plaats de larve in gestampte vliegen teelt medium. </li><li> Bewaar de schaal in een couveuse op de juiste temperatuur. </li></ol> E) Time-serie <ol start="15"><li> Herhaal de stappen 2-14 tot er voldoende tijd punten zijn verkregen. Alternatief protocol: Als de larve is om meer dan een keer worden afgebeeld in een 30 minuten interval kan het praktisch om het te laten in de beeldvorming kamer tot de volgende verdoving tijdstip. Herhaal de stap 7-14 tot er voldoende tijd punten zijn verkregen. Controleert bij deze stap: De larve is niet te worden bewaard in de imaging-kamer voor meer dan twee uur per keer, noch is het om onder narcose langer dan 15-20 minuten bij een keer. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Vergadering van de beeldvorming kamer. (A) Plaats de larve en de plastic spacer op de olie-laag. (B) Plaats een 22 x 22 mm dekglas op de spacer en plaats de plexiglas gids ring in de kamer, naast (C) wordt de positie van de larve met de metalen ring en (D) sluit de kamer. (E) Nu de kamer is klaar om te worden gemonteerd op de microscoop. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Body-wall spieren in Drosophila larven. Spieren en NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een CD8-GFP-Sh fusie-eiwit 8. De spieren worden als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larve. In (AC) de meest oppervlakkige spieren, 27, wordt getoond, in (KL) de meest interieur spieren, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 micrometer, ΔZ tussen plakken is 2 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Identiteit van het lichaam van wand spieren in Drosophila larven. De identiteit van de spieren in L3 Drosophila larven, segment A3, wordt weergegeven. Spieren en NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een CD8-GFP-Sh fusie-eiwit 8. De spieren worden weergegeven als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larven. In de AC de meest oppervlakkige spieren, 27, is weergegeven, in KL de meest interieur spieren, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 um, ΔZ tussen plakken is 2 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4 Identiteit van neuromusculaire verbindingen van Drosophila larven. (AD) NMJs werden gevisualiseerd door de expressie van een DGluRIIA-mRFP fusie-eiwit 1. De NMJs worden als waargenomen wanneer de focus op de buikzijde door de cuticula in de larve. In (AB) de meest oppervlakkige NMJ, 27, is weergegeven, in de CD de meest interieur NMJs, 6 en 7, worden getoond. Schaal Bar: 100 um, ΔZ tussen de schijfjes is 5 micrometer. (E) en (F) de identiteit van de oppervlakkige (E) en meer interieur (F) NMJs wordt gegeven als referentie.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

De gepresenteerde methode is in eerste instantie ontwikkeld voor glutamaat synapsen onderzoek op het lichaam muur spieren van Drosophila melanogaster larven. De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gekenmerkt door een stereotype cyto-architectuur van spieren en neuronen en is daardoor uitermate geschikt voor in vivo beeldvorming. Echter, de beschreven verdoving protocol niet beperkt tot de beeldvorming van de NMJ, de transparantie van de Drosophila larven vergemakkelijkt de aanpassing van de beschreven protocol voor de ontwikkeling van organen studie, migratie van cellen, het transport van axonale cargo en sub-cellulaire reorganisatie binnen de cellen.

Reagentia: <ul><li> Desfluraan (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Duitsland) </li><li> Halocarbon olie (bv. Voltalef H10S olie / Atofina, Puteaux, Frankrijk) </li><li> Fly kweekmedium </li></ul> Uitrusting: <ul><li> Omgekeerde confocale microscoop </li><li> Binoculaire microscoop (bijv. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Duitsland) </li><li> Klein penseel zoals gebruikt voor het sorteren vliegen </li><li> Couveuse </li><li> Maatwerk beeldvorming kamer (voor mechanische tekeningen zie Ref. 3) </li><li> Verdamper / verdoving apparaat (Voor details zie Ref. 3) </li></ul>

in vivo beeldvorming van intact drosophila larven aan subcellulaire resolutie

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recente verbeteringen in optische beeldvorming, genetisch gecodeerd fluoroforen en genetische instrumenten die een efficiënte inrichting van de gewenste transgene dier lijnen in staat hebben gesteld biologische processen te bestuderen in de context van een leven, en in sommige gevallen zelfs gedragen, organisme. In dit protocol zullen we beschrijven hoe intact Drosophila larven, met behulp van de vluchtige anesthetica desfluraan, aan de ontwikkeling en plasticiteit van synaptische populaties op sub-cellulair resolutie 1-3 te volgen verdoven. Terwijl andere nuttige methoden om de Drosophila melanogaster larven verdoven zijn eerder beschreven 4,5,6,7,8, het protocol hierin gepresenteerd toont significante verbeteringen te wijten aan de volgende combinatie belangrijkste eigenschappen: (1) Een zeer hoge mate van verdoving, zelfs de hartslag wordt gearresteerd waardoor laterale resolutie tot 150 nm 1, (2) een hoge overlevingskans van&gt; 90% per cyclus verdoving, waardoor de opname van meer dan vijf tijdstippen gedurende een periode van uren tot dagen 2 en ( 3) een hoge gevoeligheid waardoor we in twee gevallen aan de dynamiek van eiwitten die worden uitgedrukt in fysiologische hoeveelheden te bestuderen. In detail, we waren in staat om de postsynaptische glutamaat receptor subeenheid GluR-IIA uitgedrukt via de endogene promotor 1 in stabiele transgene lijnen en de exon val lijn FasII-GFP een te visualiseren. (4) In tegenstelling tot andere methoden 4,7 de larven kunnen worden afgebeeld, niet alleen in leven, maar ook intact zijn (dwz niet-ontleed), zodat observatie te komen over een aantal dagen een. De bijhorende video details van de functie van de afzonderlijke onderdelen van de in vivo beeldvorming kamer 2,3, de correcte montage van de larven, de verdoving procedure, hoe opnieuw vaststellen van specifieke posities binnen een larve en de veilige verwijdering van de larven van de beeldvorming kamer.

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van intacte<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larven. We hebben gebruik gemaakt van de vluchtige anesthetica desfluraan om voor herhaalde beeldvorming op sub-cellulair resolutie en re-identificatie van structuren zorgen voor maximaal een paar dagen<sup&gt; 1</sup&gt;.

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Recente verbeteringen in optische beeldvorming, genetisch gecodeerde fluorforen en genetische instrumenten die de efficiënte totstandkoming van gewenste transgene dieren mogelijk maken...

Doorbraken in optische beeldvorming en in genetisch gecodeerde fluorescentie hebben wetenschappers in staat gesteld om de biologische processen waarin zij geïnteresseerd zijn te bestuderen in het levende en in sommige gevallen zelfs in het actieve organisme. Hoewel er veel nadruk is gelegd op het in vivo bestuderen van het zoogdierbrein, maakt ons laboratorium gebruik van een vrij eenvoudig modelsysteem, de neuromusculaire junctie van de Drosophila, en in de volgende video zullen we uitleggen hoe fruitvlieglarven moeten worden geanestheseerd en afgebeeld om de ontwikkeling van individuele synapsen te volgen over een tijdsbestek van uren tot dagen. Hoewel er methoden bestaan om de ontwikkeling van Drosophila te bestuderen, wordt het hier gepresenteerde anesthesieprotocol gekenmerkt door de volgende belangrijkste kenmerken.Ten eerste wordt, door een zeer hoge graad van analyse, zelfs de hartslag gestopt, wat essentieel is voor een hoge beeldkwaliteit. Ten tweede is er een overlevingspercentage van 95% en de mogelijkheid om zeer gevoelige beelden te verkrijgen. Het volgende protocol stelt ons bijvoorbeeld in staat om de dynamiek van glutamaatreceptoren te bestuderen die zijn gelabeld met GFP en op fysiologische niveaus worden tot expressie gebracht door hun endogene promotoren.U leert nu hoe u de larven in de beeldvormingskamer plaatst, hoe u de fruitvliegenlarven anestheseert, hoe u een specifieke positie binnen de larven vindt om de sign-up trap in beeld te brengen, en vervolgens hoe u de larven uit de fixatie herstelt. Voorafgaand aan de in vivo beeldvorming is het belangrijk om de larven te wassen. Hoewel dit proces eenvoudig is, moet er zorgvuldig worden gehandeld om de larven niet te beschadigen; daarom mogen er nooit pincetten worden gebruikt om ze te verplaatsen.In plaats daarvan kiezen we voor voorzichtige bewegingen met een penseel. Het water dat voor het wassen wordt gebruikt, heeft kamertemperatuur en is gewoon normaal kraanwater dat niet gedestilleerd is en geen detergentia bevat. We kunnen het nu zien.Hij verplaatst de larven voorzichtig uit het voedsel naar vers kraanwater om goede resultaten te verkrijgen. Het is daarnaast essentieel om de larven zo kort mogelijk in het water te houden. Dit voorkomt dat er water in hun trachea terechtkomt, wat de ademhaling en het anesthetisatieproces belemmert.Vervolgens bereiden we de beeldkamer voor. Eerst verspreiden we een zeer dunne laag olie op het bodemelement van de kamer. Daarna plaatsen we de larven bovenop deze oliefilm.Het is belangrijk om hier goed op te letten dat de uiteinden de olie niet raken. Zodra deze zijn gepositioneerd, plaatsen we hier een afstandshouderrooster bovenop de larven. Het is essentieel dat de drie kanalen naar boven zijn gericht, zodat er lucht bij de larven kan komen en deze niet verstopt raken met olie.We plaatsen nu een dekglas bovenop de spacer en controleren of de larve correct is gepositioneerd. Dit betekent dat de ventrale zijde naar beneden is gericht en de tracheale, dorsale zijde, waar de trachea zichtbaar is, naar boven is gericht. Vervolgens plaatsen we de plastic adapterring en een metalen ring om ervoor te zorgen dat de larve gelijkmatig tussen de twee glazen objectglazen wordt samengedrukt.We sluiten nu de beelduitvoerkamer en verplaatsen deze naar de confocale microscoop om te beginnen met het maken van beelden. Plaats nu de beelduitvoerkamer met de gemonteerde larven bovenop onze confocale microscoop.Er komen drie slangen uit de beeldvormingskamer. Eén is verbonden met het anestheticum isofluraan. Eén is een afvoerbuis en de laatste slang zorgt ervoor dat verse lucht de larven kan bereiken.Nadat de larvenkamer is aangesloten op het anesthesieapparaat, is het belangrijk om te controleren of de larve correct is gepositioneerd. Yao laat vervolgens via de pomp lucht het anesthesiesysteem binnenstromen. Op dit moment is het essentieel om ervoor te zorgen dat de druk in de kamer de maximaal aanbevolen waarde niet overschrijdt.Vervolgens plaatst hij de uitlaatslang in het water om te controleren of er luchtstroom is. De bellen in de fles water tonen de luchtstroom aan. Hij opent nu langzaam de klep en laat het fluor kortstondig door de slangen stromen.Na de initiële anesthesie is het belangrijk om te controleren hoe het dier reageert. Als het hart nog klopt, is het noodzakelijk om meer anesthesie toe te dienen, zoals hier te zien is. In de volgende sectie tonen we het dier onder de microscoop.Nu kunnen we het cruciale deel van het anesthesieproces via de microscoop waarnemen. Aanvankelijk zijn de bewegingen van de larven zichtbaar, waarbij de spieren blijven samentrekken. Zodra de bewegingen vertragen, scant men de larven van boven naar beneden en wordt de voortgang van de anesthesie gevolgd.De bewegingen vertragen en stoppen uiteindelijk. Na het toepassen van meerdere anesthesiepulsen is te zien dat de lava is gestopt met bewegen en dat de enige waargenomen beweging het gevolg is van aanpassingen aan de microscoop. Om de mate van anesthesie te bepalen, is het belangrijk om de hartslag te controleren.He yao focust diep in de lava waar voornamelijk het vetlichaam te zien is. Belangrijk is dat de regio rond het hart zichtbaar is en dat duidelijk is dat de hartslag is gestopt, waardoor de larve klaar is voor beeldvorming. Een grote moeilijkheid bij in vivo beeldvorming is de identificatie van de neuromusculaire junctie waarin men geïnteresseerd is.Om u hierbij te helpen, laten we zien hoe het eruitziet terwijl u door de larven scant. Vervolgens ziet u een neuromusculaire junctie die we doorgaans gebruiken voor beeldvorming. Nu beginnen we langzaam scherp te stellen in de larven.Beginnend bij het oppervlak van de cuticula ziet u enkele spieren verschijnen en verdwijnen. Sommigen hiervan zijn gemarkeerd. De film toont een kunstmatig fusieconstruct dat het CD8-transmembraandomein, GFP en de C-terminale regio van het kaliumkanaal-eiwit Shaker bevat.Dit construct lokaliseert naar alle spiermembranen en vertoont een verhoogde aanwezigheid bij de neuromusculaire junctie. We zullen de film nu langzamer afspelen en met behulp van figuur twee en drie kunt u individuele spieren identificeren terwijl ze verschijnen en verdwijnen. Hoewel deze vliegen bijzonder nuttig zijn om in vivo imaging te leren, gebruiken we over het algemeen larven die markers tot expressie brengen die enkel de postsynaptische of presynaptische regio's van de synaps labelen.Aangezien deze niet het gehele spieroppervlak markeren, is het veel moeilijker om dezelfde positie in larven te identificeren. In deze video tonen we RFP-getagde glutamaatreceptoren. De video laat zien hoe we inzoomen op het label en we hebben individuele neuromusculaire juncties gemarkeerd.We laten de film opnieuw zien in een langzamer tempo, zodat u met behulp van figuur vier de individuele neuromusculaire overgangen kunt identificeren. Nu we de theorie hebben behandeld, tonen we een praktisch voorbeeld.We richten ons nu op neuromusculaire junctie 27 in onze MHC CD acht GFP-shaker-expresserende larven. Na het verhogen van de digitale zoom positioneren we de neuromusculaire junctie opnieuw en bewegen we vervolgens in de C-richting naar de centrale regio om er zeker van te zijn dat de larve correct is gepositioneerd en dat er geen over- of onverzadigde pixels aanwezig zijn. De oververzadigde pixels zijn in het rood te zien en de onverzadigde pixels worden in vergelijking hiermee in het blauw weergegeven.We verminderen het laservermogen en scannen opnieuw. We hebben nu een passende versterking en lasersterkte, waardoor er geen oververzadigde gebieden meer aanwezig zijn. Het is nu belangrijk om de positie van de neuromusculaire overgang in de C-richting te markeren.Ten eerste markeren we de onderste scanpositie en vervolgens de bovenste scanpositie om een nauwkeurige registratie van de gehele CST-stack mogelijk te maken. We gebruiken over het algemeen een pixelgrootte van 100 nanometers bij 100 nanometers en de afstand in C is 500 nanometers. Als we niet van plan zijn om na de beeldvorming deconvolution uit te voeren om onze beelden te verwerken, worden de gains ingesteld op een passend niveau om ruis te voorkomen, maar ook om het gebruik van een lagere lasersterkte toe te staan om bleaching te minimaliseren zodra de CST-stack voltooid is.De neuromusculaire overgang die het M-H-C-C-D-H shaker GFP-construct tot expressie brengt, is correct geregistreerd. In de volgende sectie voltooien we een soortgelijk proces waarbij de focus ligt op de glutamaatreceptoren. Om de RFP-getagde glutamaatreceptoren te registreren, stellen we opnieuw scherp door de cuticula en zien we nu de individuele neuromusculaire overgangen in segment A3.Nadat we op de rechter neuromusculaire overgang hebben ingezoomd, positioneren we deze opnieuw in het centrum van het gezichtsveld. Zoals eerder gedaan, moeten we ervoor zorgen dat er geen overbelichte of verzadigde pixels aanwezig zijn. Opnieuw wordt duidelijk dat sommige pixels oververzadigd zijn, dus passen we de instellingen aan en voeren we nog een testscan uit.De winst van het laservermogen is nu correct afgesteld. Het is nu belangrijk om de limieten van de CST-stapel in te stellen door de bovenste positie te bepalen en te verifiëren, gevolgd door de onderste positie. We kunnen nu beginnen met het scannen van de individuele vlakken van de neuromusculaire overgang.Het is belangrijk om enkele blanco scans te maken van secties net onder en boven de neuromusculaire junctie om te voorkomen dat synapsen die daar gepositioneerd zijn, over het hoofd worden gezien. Nadat de confocale microscopen klaar zijn met scannen, projecteren we de neuromusculaire junctie om een typisch resultaat te zien dat bij in vivo beeldvorming wordt verkregen. Het is belangrijk om deze afbeelding te bewaren voor vergelijking met scans die op latere tijdstippen worden voltooid, zodat de neuromusculaire junctie opnieuw kan worden geïdentificeerd en veranderingen, zoals nieuwe synapsen of synaptische batons, kunnen worden vastgesteld.Na het succesvol maken van de beelden is het belangrijk om de lava snel te wekken en deze onmiddellijk uit de beeldvormingskamer te verwijderen. Yao doet dit nu terwijl hij de lava voortdurend in de gaten houdt; hij stelt het anesthesieapparaat zo in dat er verse lucht in plaats van alleen fluor door het systeem circuleert.Hij plaatst nu de uitlaat van de kamer in het water en de luchtbellen tonen aan dat er lucht door het systeem stroomt. Hij houdt de larven voortdurend in de gaten om te controleren of de hartslag weer begint en de larven ontwaken. Net als bij het anesthesieproces is het optimaal om de larven meerdere luchtstoten toe te dienen om een succesvol ontwaken te garanderen.We kunnen nu via de microscoop zien wat er gebeurt. We zien hoe hij lucht aan het systeem toevoegt. Er worden drukverschillen in de kamer opgewekt, die kunstmatige bewegingen bij de larven induceren.Uiteindelijk begint de larve uit zichzelf te bewegen, wat het best wordt aangetoond door de aanvang van de hartbewegingen; we zoomen daarom in op de larve om deze bewegingen duidelijker te kunnen zien. De ritmische slagen zijn zichtbaar en tonen aan dat de larve succesvol is gewekt. Nadat de larve succesvol is gewekt, is het belangrijk om deze uit de beeldkamer te halen.De larven bevinden zich in het onderste gedeelte van de kamer, waardoor het bovenste gedeelte aan de zijkant is geplaatst. Yara verwijdert het metalen gewicht en de plastic afdekking. Vervolgens wordt het dekglas verwijderd en daarna de plastic spacer met de larven.Hij verwijdert de larven voorzichtig met het penseel uit de plastic spacer. Vervolgens dompelt hij deze kort onder in water en droogt ze af om eventuele overtollige olie te verwijderen. De larve wordt nu in wat vooraf fijngemalen voer geplaatst en blijft daar tot deze opnieuw nodig is.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van...

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer hoe je Drosophila melanogaster larven anestheseert en beeldt met desflurane voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode biedt subcellulaire resolutie en 95% overleving.

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Meer video's verkennen