Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die funktionelle Qualität von CD8-positiven T-Zellen in ihrer Reaktion auf ein bestimmtes Antigen zu beurteilen, indem ihre Fähigkeit zur Zerstörung von Zielzellen in vivo untersucht wird. Dies wird erreicht, indem zunächst antigen-spezifische effektorische CD8-positive T-Zellen durch Immunisierung von Empfängermäusen hervorgerufen werden. Als zweiter Schritt erhalten primäre Zielzellen Spezifität oder werden anderweitig behandelt, wodurch das spezifische Effektor-Zielzell-System vervollständigt wird.

Anschließend werden die Zielzellen mittels retroorbitaler adoptiver Übertragung den Empfängermäusen verabreicht. Um die Effektor-vermittelte Zerstörung in vivo zu untersuchen, wurden Ergebnisse gewonnen, die anhand der Durchflusszytometrie-Analyse von CFSE-gefärbten Zellen zeigen, ob die Effektorzellen einige der Zielzellen abgetötet haben. Hallo, mein Name ist Marina Ward.

Ich bin Doktorandin im Labor von Gary Splitter an der University of Wisconsin Madison. Diese Methode liefert Einblicke in die CTL-vermittelte Zerstörung von Zielzellen und kann zudem auf Zellproliferation und Zellüberleben angewendet werden. Die adoptive Transferprozedur wird Dr. Jerome Harms, ein Wissenschaftler aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie strategisch, indem Sie ein spezifisches Effektor-Zielzell-System definieren.

Beispielsweise verwenden Sie bei einem klassischen in-vivo-CTL-Assay eine Immunisierung mit einem gereinigten Peptid, um spezifische CD8-positive T-Zellen hervorzurufen, und nutzen dasselbe Peptid, um die syngenen Zielzellen zu beladen, wodurch ein spezifisches Wirkstoff-Ziel-System entsteht. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche einer Sicherheitswerkbank, um die Sterilität der Injektionen sicherzustellen. Bereiten Sie die Peptid-Immunisierung vor, indem Sie diese zunächst in ein zwei Milliliter fassendes Reagenzglas geben.

50 Mikrogramm gereinigtes Peptid in 100 Mikroliter 10 % DMSO in PBS pro Maus. Danach eine gleiche Menge sehr kaltes, unvollständiges freies Unju mit Ein-Millimeter-Perlen zur Vermischung hinzufügen. Den Tubusdeckel mit Parafilm sichern und das Impfstoffgemisch bis zur Injektion auf Eis lagern.

Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, der auf maximale Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, um die Emulsion drei Minuten lang zu mischen, und stellen Sie die Emulsion nach dem Mischen umgehend auf Eis. Die resultierende Emulsion sollte in ihrer Konsistenz Mayonnaise ähneln. Lassen Sie die Emulsion über Nacht oder bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius ruhen und mischen Sie erneut, falls zum Zeitpunkt der Immunisierung eine Phasentrennung festgestellt wird.

Identifizieren Sie die Mäuse für diesen Teil des Experiments. Ziehen Sie die Emulsion mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 20-Gauge-Nadel auf. Achten Sie darauf, keine Kügelchen aufzuziehen, um Zielzellen vorzubereiten.

Naive syngeneische Mäuse werden verwendet, um diese naiven Mäuse zu töten. Gemäß den von A-A-A-L-A-C genehmigten Standards. Sprühen Sie den betreffenden Bereich der Maus mit 70 % Ethanol ein, um die Gefahr einer Kontamination durch Maushaare oder andere äußere Verunreinigungen zu minimieren. Verwenden Sie eine Dissektionspinzette, um einen kleinen Schnitt durch die Haut auf der linken Seite der Maus zu machen.

Ziehen Sie die Hautlappen zurück, um die Bauchhöhle und die inneren Organe freizulegen. Schneiden Sie vorsichtig durch das Peritoneum, ohne die darunterliegenden Organe zu verletzen. Lokalisieren Sie die Milz, die nahe der Oberfläche liegt und dunkelrot gefärbt ist.

Ziehen Sie die Milz vorsichtig heraus und legen Sie sie sofort in ein 15-Milliliter-Konischglas mit 10 Milliliter vorbereitetem RPMI-Medium auf Eis. Setzen Sie den Vorgang mit den verbleibenden Mäusen fort. Überführen Sie die Milz und das Medium in einen Glasgewebehomogenisator.

Zerkleinern Sie die Milz, bis das gesamte Gewebe seine Farbe verloren hat. Leiten Sie die homogenisierten Produkte durch einen 70-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Spülen Sie den Homogenisator einmal mit frischem Medium und geben Sie die Spülflüssigkeit zusammen mit dem Milzhomogenat durch den Filter. Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius und 1.300 Umdrehungen pro Minute.

Unter Dekantieren und Verwerfen der Überstände sieben Minuten lang. Das Zellpellet in 10 Milliliter Lysereagenzien resuspendieren und sieben Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bis zu 50 Milliliter frisches Medium hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt. Zählen Sie die Zellen und aliquotieren Sie 10 Millionen Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Rundboden-Zellkulturplatte.

Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für eineinhalb Stunden. Überführen Sie in den 37-Grad-Celsius-Inkubator für die letzten 30 Minuten. Bereiten Sie frisches CFSE-Reagenz gemäß Herstelleranleitung vor und verdünnen Sie es auf eine Arbeitskonzentration zwischen 0,5 und 25 Mikromolar.

Stellen Sie zwei CFSE-Lösungen her, die sich zehnfach in ihrer Konzentration unterscheiden. Puffern Sie diese CFSE-Lösungen mit niedriger und hoher Konzentration auf 37 Grad Celsius ein, bevor Sie die Markierung durchführen. Entnehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zielzellen dem Inkubator und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Bei Raumtemperatur die Platte vorsichtig schütteln, um das Überstandsgemisch zu entfernen. Die Zellen in 200 Mikrolitern einer niedrigen oder hohen Konzentration an CFSE-Lösung resuspendieren und 15 Minuten lang in einem 37 °C-Inkubator inkubieren. Die Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur pelletieren, die Platte vorsichtig schütteln, um das Überstandsgemisch zu entfernen, die Zellen in 200 Mikrolitern frischem Medium resuspendieren und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Die Zellen erneut durch Zentrifugation pelletieren, den Überstand verwerfen und die Pellets in 50 Mikrolitern PBS resuspendieren. Einen Teil der markierten Zellen für Nicht-Transfer-Kontrollen während der Datenanalyse beiseitelegen sowie zum Durchlaufen auf dem Durchflusszytometer für die adoptive Transferierung.

Geben Sie eine Vertiefung mit CFSE-markierten Zellen in niedriger Konzentration pro Maus zu einer Vertiefung mit CFSE-markierten Zellen in hoher Konzentration. Somit besteht die resultierende Injektion aus 50 % spezifischen Zielzellen und 50 % irrelevanten Zellen in 0,1 Milliliter. Um die adoptive Übertragung zu erleichtern, betäuben Sie die mit Peptid immunisierten Mäuse und injizieren 0,1 Milliliter der markierten Zielzellen über eine retroorbitale Applikationsroute in den Empfänger.

Mäuse nach sechs Stunden, euthanasieren Sie die Empfängermäuse zur Zellgewinnung, isolieren Sie die Milz der Maus und reinigen Sie die Zellpopulation mit demselben Protokoll, das verwendet wurde. Bei der Vorbereitung von Ziel-Milzzellen pipettieren Sie Zellen mit einer Dichte von einer Million pro Vertiefung in eine 96-Loch-Rundboden-Zellkulturplatte, fixieren Sie die gewonnenen und nicht übertragenen Zellen mit Paraformaldehyd, messen Sie die Proben im Durchflusszytometer und analysieren Sie die Daten. Die typische Darstellung der Ergebnisse der zellspezifischen Lyse erfolgt auf zwei Arten.

Ein vermindertes, epitopspezifisches Peak im Fax-Histogramm und der berechnete Wert zeigen eine zellspezifische Lyse an. Die Zahlen geben den Prozentsatz der Zellen mit hohem oder niedrigem CFSE-Phänotyp in nicht übertragenen Kontroll-CFSE-markierten Zellen an, die aus einer mit PBS immunisierten Empfängertauze gewonnen wurden, sowie CFSE-markierte Zellen, die aus zwei verschiedenen, peptidspezifischen Empfängertieren stammen. Beachten Sie die verminderten, epitopspezifischen Peaks, die auf eine zellspezifische Zerstörung hinweisen.

Alternativ können die Ergebnisse grafisch dargestellt werden, um die zellspezifische Lyse für jede Mausgruppe zu veranschaulichen: PBS, Peptid A und Peptid B. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihren eigenen in-vivo-CTL-Kill-Assay unter Verwendung von Mäusen entwickeln können.