Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)
20. Dezember 2010
Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound mit S-Adenosyl- L-Homocystein-Bindung, wie Selektivität Funktion Methyltransferasen aus einem isolieren Escherichia coli Ganzzelllysat und weisen sie von MS.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Methyltransferasen aus komplexen Proteingemischen durch Capture Compound Mass Spectrometry oder CCMS zu profilieren. Die Methyltransferasen werden funktionell durch trifunktionale Capture Compounds isoliert, die den allgemeinen Methyltransferase-Produkthemmstoff, S Adenyl, L Homocystein kurz, SAH als Selektivitätsfunktion im hier gezeigten Workflow tragen. Die funktionelle Isolierung wird erreicht, indem ein Zelllysat mit dem Capture Compound inkubiert wird, um ein reversibles Bindungsgleichgewicht zwischen der Selektivitätsfunktion des Capture Compounds und den Zielproteinen als zweiten Schritt zu etablieren. Die Mischung wird innerhalb der capra Box mit UV-Licht bestrahlt.
Die Bestrahlung aktiviert die Reaktivitätsfunktion des Capture Compounds. Dies führt zur Bildung einer irreversiblen kovalenten Quervernetzung zwischen dem Capture Compound und den Zielproteinen. Als nächstes werden die Capture Compound-Protein-Konjugate vom Lysat getrennt, gründlich gewaschen, vom festen Träger gelöst und durch Trypsinierung identifiziert, um die eingefangenen Proteine durch massenspektrometrische Analyse der Triptych-Peptide zu identifizieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die die unkomplizierte Isolierung und Identifizierung von Methyltransferasen aus einem Zelllysat von esia coli auf der Grundlage der Capture Compound Mass Spectrometry zeigen.
Hallo, ich bin Thomas Lentz vom CaTECH-Labor im Fachbereich Biochemie. Ich bin Mathias Rega, ebenfalls vom CapTech-Biochemielabor. Ich bin Mer Linsky vom Analyseabteilung.
Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Echtzeit-Erkennung von Methyltransferasen aus gleichgerichtetem Zellat. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und Proteinen zu untersuchen. Das Verfahren ermöglicht die Isolierung und Identifizierung funktioneller Subproteome wie Kinase, Metalloproteinase, gtpa, ais, um nur einige zu nennen.
Wir verwenden diesen Ansatz auch für die Entdeckung von Arzneimitteltargets. Also, lass uns anfangen. Für die Capture-Experimente wird das Snail L Homocystein Caper Kit, kurz SAH Caper Kit, verwendet.
Dieses Kit enthält das SAH-Capture Compound und freies SAH als Wettbewerber. Ebenfalls enthalten sind Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen mit einem Mikrometer Durchmesser, fünfmal konzentriertes Capture-Puffer und fünfmal konzentriertes Waschpuffer. Verwenden Sie verschiedene Röhrchen von einem 200-Mikroliter-PCR-Röhrchenstreifen, um SAH-Capture Compound-beladene Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen herzustellen, indem Sie 50 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen mit 25 Mikrolitern von 100 Mikromolar SAH-Capture Compound für jedes Eloqua kräftig mischen.
Schütteln Sie die resultierende Suspension bei Raumtemperatur zwei Minuten lang, um die Bindung des Biotin-Motys des Capture Compounds an das Streptavidin auf der Oberfläche der magnetischen Perle zu ermöglichen. Sammeln Sie dann die capra-Perlen magnetisch in den Kappen der PCR-Röhrchen mit dem capra mag, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die resultierenden capra-Perlen in 200 Mikrolitern des Waschpuffers. Sammeln Sie die capra-Perlen erneut magnetisch in den Kappen der PCR-Röhrchenstreifen und entsorgen Sie den Überstand.
Verschließen Sie dann die Röhrchen, um ein Austrocknen der Perlen zu vermeiden. Beschriften Sie anschließend neue Röhrchen für den Capture-Assay und die notwendigen Kontrollen, einschließlich der Wettbewerbskontrolle. Ziehen Sie die Wettbewerbskontrolle des Pull-Downs und der kombinierten Capture-Assay-Plus-Pull-Down-Kontrolle, platzieren Sie die beschrifteten Röhrchen in die capra Box, um die Temperatur bei null bis vier Grad Celsius zu regulieren.
Pipettieren Sie dann das Volumen von Milli Q Wasser, das für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 100 Mikrolitern und 20 Mikrolitern fünfmaliges Capture-Puffer berechnet wurde. Fügen Sie für jede Reaktion 0,26 Milligramm eines coli dh fünf alpha Whole-Cell-Lysat zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Inversion. Für die Wettbewerbskontrolle und die Wettbewerbskontrolle des Pull-Downs fügen Sie 20 Mikroliter einer 10-Millimolaren SAH-Wettbewerbslösung hinzu.
Fügen Sie für den Capture-Assay, Pull-Down und die kombinierte Capture-Assay-Plus-Pull-Down-Kontrolle 20 Mikroliter Milli Q Wasser anstelle der SAH-Lösung hinzu, mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig durch Inversion und zentrifugieren Sie sie kurz. Suspendieren Sie dann die capra-Perlen im jeweiligen Lysat und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Halten Sie die Perlen in Suspension, indem Sie sie rotieren, um eine reversible Bindung der SAH-Bindungsproteine an die SAH-Selektivitätsfunktion des SAH-Capture Compounds zu ermöglichen.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie kurz und platzieren Sie die Suspensionen in der capra Box. Trennen Sie die Röhrchen und entfernen Sie die Suspensionen für den Pull-Down und die Wettbewerbskontrolle des Pull-Downs auf Eis. Lassen Sie die verbleibenden Suspensionen für den Capture-Assay, die Wettbewerbskontrolle und die kombinierte Capture-Assay.
Plus Pull-Down in der capra Box, um die Proben mit UV-Licht zu bestrahlen, während sie gleichzeitig gekühlt werden. Bestrahlen Sie die Proben für insgesamt 30 Minuten mit 2,5-minütigen Bestrahlungsintervallen in den geschlossenen Röhrchen zwischen null und vier Grad Celsius. Dieser Prozess wird eine kovalente Quervernetzung zwischen der Reaktivitätsfunktion des SAH-Capture Compounds und den SAH-Bindungsproteinen bilden.
Entfernen Sie die Suspensionen nach einem Bestrahlungsintervall von 2,5 Minuten aus der Capra-Box. Kühlen Sie sie etwa 15 Sekunden lang in Eiswasser und mischen Sie sie mehrmals durch Inversion. Zentrifugieren Sie dann kurz die Proben, um jegliche Suspension in den Deckeln zu entfernen, und platzieren Sie sie für das nächste Bestrahlungsintervall wieder in die capra Box.
Beinhalten Sie erneut die Suspensionen für Pull-Down und die Wettbewerbskontrolle des Pull-Downs und fügen Sie 20 Mikroliter einer 10-Millimolaren SAH-Lösung für den Capture-Assay für die Wettbewerbskontrolle, Pull-Down-Wettbewerbskontrolle des Pull-Downs und der kombinierten Capture-Assay-Plus-Pull-Down hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter Milli Q Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Suspensionen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius, wobei die Perlen und die Suspension durch Rotation im Capture-Assay gehalten werden. Die SAH-Bindungsproteine, die nicht mit dem SAH-Capture Compound quervernetzt sind, werden verdrängt.
Nach der Inkubation sammeln Sie die capra-Perlen aus den Suspensionen mit dem capra mag und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie dann die Perlen, indem Sie sie in 200 Mikrolitern des Waschpuffers aufschwemmen und die Perlen durch magnetische Trennung sammeln. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang fünfmal, suspendieren Sie sie dann in 200 Mikrolitern Milli Q Wasser und sammeln Sie die Perlen durch magnetische Trennung.
Suspendieren Sie die Perlen in 200 Mikrolitern 60% Acetonitril und sammeln Sie die Perlen mit dem capri mag. Wiederholen Sie diesen Acetonitril-Waschvorgang zweimal. Wenden Sie Ultraschall an, wenn die Perlen nicht leicht resuspendiert werden können.
Geben Sie anschließend die eingefangenen Proteine durch Zugabe von 200 Mikrolitern frisch zubereiteter 60% Acetonitril, 0,2% Trifluoressigsäure frei und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter heftigem Schütteln. Wenden Sie erneut Ultraschall an, wenn die Perlen nicht leicht resuspendiert werden können.
Sammeln Sie schließlich die Perlen magnetisch und entsorgen Sie sie. Schneiden Sie den Röhrchenstreifen in einzelne Röhrchen, perforieren Sie die Deckel und verdampfen Sie das Supranatine, bis es trocken ist. Mit einem Zentrifugenverdampfer können die ein
Overview
This study presents a method for profiling methyltransferases from complex protein mixtures using capture compound mass spectrometry (CCMS). The approach utilizes trifunctional capture compounds to isolate and identify target proteins from Escherichia coli cell lysates.
Key Study Components
Area of Science
- Biochemistry
- Proteomics
- Mass Spectrometry
Background
- Methyltransferases play crucial roles in various biological processes.
- Traditional methods for isolating these enzymes can be complex and inefficient.
- Capture compounds offer a novel approach to simplify this process.
- The study focuses on using S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) as a selectivity function.
Purpose of Study
- To develop a streamlined method for isolating methyltransferases.
- To enhance the identification of proteins in complex mixtures.
- To utilize photo-crosslinking for irreversible binding of target proteins.
Methods Used
- Preparation of SAH capture compounds and magnetic beads.
- Incubation of E. coli lysate with capture compounds for reversible binding.
- UV irradiation to induce covalent cross-linking of proteins.
- Mass spectrometric analysis of tryptic peptides for protein identification.
Main Results
- Successful isolation of methyltransferases from E. coli lysate.
- Identification of target proteins through mass spectrometry.
- Demonstration of the effectiveness of capture compounds in proteomic studies.
Conclusions
- The method provides a reliable approach for studying small molecule-protein interactions.
- Capture compound mass spectrometry can facilitate drug target discovery.
- This technique can be applied to other functional sub-proteomes.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:05
Title
2:23
Performing the Capture Assay and Controls
9:50
Peptide and Protein Identification via Automated Sequence Database Search
8:26
Tryptic Digest of Captured Proteins and Preparation of Peptides for LC-MS/MS
12:33
Representative Results of CCMS Experiments
16:00
Conclusion
