Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- _L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Methyltransferasen aus komplexen Proteinmischungen mittels Capture-Compound-Massenspektrometrie oder CCMS zu charakterisieren. Die funktionelle Isolierung der Methyltransferasen erfolgt durch trifunktionelle Capture-Verbindungen, die das allgemeine Produktinhibitor der Methyltransferasen, S-Adenosyl-L-Homocystein, kurz SAH, als Selektivitätsfunktion tragen. In dem hier dargestellten Workflow wird die funktionelle Isolierung erreicht, indem ein Zelllysat mit der Capture-Verbindung inkubiert wird, um ein reversibles Bindungsgleichgewicht zwischen der Selektivitätsfunktion der Capture-Verbindung und den Zielproteinen einzustellen. Als zweiter Schritt wird das Gemisch innerhalb der Capra-Box mit UV-Licht bestrahlt.

Das Bestrahlungslicht aktiviert die Reaktivitätsfunktion der Erfassungsverbindung. Dies induziert die Bildung einer irreversiblen kovalenten Vernetzung zwischen der Erfassungsverbindung und den Zielproteinen. Anschließend werden die Erfassungsverbindung-Protein-Konjugate vom Lysat getrennt, gründlich gewaschen, von der festen Trägersubstanz freigesetzt und tryptisch gespalten, um die erfassten Proteine durch massenspektrometrische Analyse der entstandenen Peptide zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen die direkte Isolierung und Identifizierung von Methyltransferasen aus einem Zelllysat von Escherichia coli basierend auf der Erfassungsverbindung-Massenspektrometrie.

Hallo, ich bin Thomas Lentz aus dem Labor von CaTECH in der Abteilung für Biochemie. Ich bin Mathias Rega, ebenfalls aus dem CapTech-Biochemie-Labor. Ich bin Mer Linsky aus der Analyseabteilung.

Heute zeigen wir Ihnen die Methode zur on-beat-Erfassung von Methyltransferasen aus einer äquilibrierten Zelllysatprobe. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und Proteinen zu untersuchen. Die Methode ermöglicht die Isolierung und Identifizierung funktioneller Subproteome wie beispielsweise Kinasen, Metalloproteinasen, GTPasen und AIS.

Wir verwenden diesen Ansatz außerdem für die Entdeckung von Arzneimittelwirkstoffen. Beginnen wir also. Für die Capture-Experimente wird das L-Homocystein-Capture-Kit kurz SAH-Capture-Kit für Schnecken verwendet.

Dieses Kit enthält die SAH-Erfassungsverbindung und freie SAH als Konkurrentin. Ebenfalls enthalten sind mit Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen mit einem Durchmesser von einem Mikrometer, fünfmal konzentrierte Erfassungspufferlösung und fünfmal konzentrierte Waschpufferlösung. Unter Verwendung verschiedener Röhrchen eines 200-Mikroliter-PCR-Röhrchenstreifens bereiten Sie die mit der SAH-Erfassungsverbindung beladenen, mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen vor, indem Sie für jedes Eloqua 50 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchenlösung mit 25 Mikrolitern einer 100-Mikromolar-SAHErfassungsverbindung gründlich mischen.

Schütteln Sie die resultierenden Suspensionen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Bindung der Biotin-Gruppe der Capture-Verbindung an das Streptavidin auf der Oberfläche der magnetischen Perlen zu ermöglichen. Sammeln Sie die Capra-Perlen anschließend magnetisch in den Deckeln der PCR-Röhrchen mithilfe des Capra-Mag, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die resultierenden Capra-Perlen in 200 µL eines Mal Waschpuffer. Sammeln Sie die Capra-Perlen erneut magnetisch in den Deckeln der PCR-Röhrchenstreifen und entfernen Sie den Überstand.

Danach die Röhrchen verschließen, um ein Austrocknen der Kügelchen zu vermeiden. Anschließend neue Röhrchen für den Nachweistest und die erforderlichen Kontrollen beschriften, einschließlich der Wettbewerbskontrolle. Wettbewerbskontrolle für den Pull-down sowie kombinierten Nachweistest plus Pull-down absetzen und die beschrifteten Röhrchen in die Capra-Box stellen, um die Temperatur auf null bis vier Grad Celsius zu regulieren.

Dann pipettieren Sie das Volumen an Milli-Q-Wasser, das für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 100 µL berechnet wurde, sowie 20 µL 5-fach Capture-Puffer. Geben Sie für jede Reaktion 0,26 mg eines E. coli DH5α-Gesamtzelllysats zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Inversion. Für die Wettbewerbskontrolle und die Wettbewerbskontrolle des Pull-downs geben Sie 20 µL einer 10 mM SAH-Konkurrenzlösung hinzu.

Für den Capture-Assay, das Pull-down- und den kombinierten Capture-Assay plus Pull-down geben Sie 20 Mikroliter Milli-Q-Wasser anstelle der SAH-Lösung hinzu, mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig durch Inversion und zentrifugieren Sie kurz. Anschließend suspendieren Sie die Capra-Perlen im jeweiligen Lysat und inkubieren drei Stunden bei vier Grad Celsius. Halten Sie die Perlen durch Rotation in Suspension, um die reversible Bindung der SAH-bindenden Proteine an die SAH-Selektivitätsfunktion der SAH-Capture-Verbindung zu ermöglichen.

Nach der Inkubation kurz zentrifugieren und die Suspensionen in die Capra-Box stellen. Die Röhrchen trennen und die Suspensionen für den Pull-down und die Wettbewerbskontrolle des Pull-downs auf Eis geben. Die verbleibenden Suspensionen für die Wettbewerbskontrolle des Capture-Assays und den kombinierten Capture-Assay zurückbehalten.

Ziehen Sie zusätzlich im Capra-Box, um die Proben mit UV-Licht zu bestrahlen, während sie gleichzeitig gekühlt werden. Bestrahlen Sie die Proben insgesamt 30 Minuten lang mit 2,5-minütigen Bestrahlungsintervallen in geschlossenen Röhrchen zwischen null und vier Grad Celsius. Dieser Prozess führt zur Bildung einer kovalenten Vernetzung zwischen der Reaktivitätsfunktion der SAH-Einfangverbindung und den SAH-bindenden Proteinen.

Entfernen Sie die Suspensionen nach einem Bestrahlungsintervall von 2,5 Minuten aus der Capra-Box. Kühlen Sie sie etwa 15 Sekunden lang in Eiswasser und mischen Sie sie mehrmals durch Umstülpen. Zentrifugieren Sie die Proben dann kurz, um verbliebene Suspensionen aus den Deckeln zu entfernen, und stellen Sie sie für das nächste Bestrahlungsintervall zurück in die Capra-Box.

Nun fügen Sie erneut die Suspensionen für die Abreinigung und die Wettbewerbskontrolle der Abreinigung hinzu, und geben Sie 20 Mikroliter einer 10-Millimolar-SAH-Lösung zum Erfassungsassay für die Wettbewerbskontrolle, Abreinigungswettbewerbskontrolle der Abreinigung und kombinierten Erfassungsassay plus Abreinigung, sowie 20 Mikroliter Milli-Q-Wasser hinzu. Inkubieren Sie die Suspensionen 10 Minuten bei vier Grad Celsius, wobei die Kügelchen und die Suspension im Erfassungsassay unter Rotation gehalten werden. Die SAH-bindenden Proteine, die nicht mit der SAH-Erfassungsverbindung vernetzt sind, werden verdrängt.

Nach der Inkubation sammeln Sie die Capra-Perlen aus den Suspensionen mithilfe des Capra-Magneten und verwerfen Sie das Überstand. Waschen Sie anschließend die Perlen durch Resuspension in 200 Mikroliter 1×-Waschpuffer und Sammlung der Perlen durch magnetische Trennung. Wiederholen Sie diesen Waschschritt fünfmal, resuspendieren Sie die Perlen danach in 200 Mikroliter Milli-Q-Wasser und sammeln Sie die Perlen erneut durch magnetische Trennung.

Suspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikroliter 60 %igem Acetonitril und sammeln Sie die Kügelchen mit dem Capri-Mag. Wiederholen Sie die Acetonitril-Wäsche zweimal. Wenden Sie Ultraschall an, falls sich die Kügelchen nicht leicht resuspendieren lassen.

Als Nächstes werden die gebundenen Proteine durch Zugabe von 200 µL frisch zubereiteter 60 %igen Acetonitril-Lösung mit 0,2 % Trifluoressigsäure von den Kügelchen eluiert, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter intensivem Schütteln. Falls sich die Kügelchen nicht leicht resuspendieren lassen, erneut Ultraschall anwenden.

Sammlen Sie die Kügelchen abschließend magnetisch und entsorgen Sie sie. Schneiden Sie den Röhrenstreifen in Einzelröhrchen, perforieren Sie die Deckel und verdampfen Sie das Überstand bis zur Trockne. Die an dieser Stelle gewonnenen Proteine können entweder einer SDS-Gelelektrophorese unterzogen oder zur Massenspektrometrie weiterverarbeitet werden, wie im folgenden Abschnitt beschrieben; lösen Sie die von den magnetischen Kügelchen freigesetzten Proteine in 10 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat.

Platzieren Sie die Proben in ein Ultraschallbad und wirbeln Sie die Proben anschließend vortex. Geben Sie danach ein Mikroliter Trypsin mit einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter in einmillimolarer HCl hinzu, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie die Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Übernacht-Inkubation entsalzen Sie eine Lösung, die die tryptischen Peptide der erfassten Proteine enthält, mithilfe von C18-Material, wie beispielsweise 20-Mikroliter-Stage-Tips von Thermo Fisher Scientific gemäß den Herstelleranweisungen, und eluieren Sie die Peptide zweimal mit je 10 Mikroliter 50 % Methanol, 5 % Ameisensäure.

Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel mithilfe eines Zentrifugalverdampfers, wobei die trockenen, entsalzten Peptide zurückbleiben. Lösen Sie die Peptide in 5,5 Mikroliter 0,1%iger Ameisensäure unter Anwendung von Ultraschall in einem Ultraschallbad und durch Vortexen. Analysieren Sie die Probe abschließend mittels Nano-Fluss-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Zur Analyse der MSM-S-Daten verwenden Sie einen Proteinidentifizierungsalgorithmus wie Seaquest, implementiert in Bioworks Browser Version 3.3 0.1, SP1 und X! Tandem, implementiert in der Scaffold-3-Software.

Die automatisierte Datenbanksuche wird anhand der aktuellsten Wissensdatenbank der universellen Proteinressource durchgeführt. Die Swiss-Prot-Datenbank wurde auf www.xpai.org für den untersuchten Organismus veröffentlicht.

Die für die vorliegende Studie verwendete Datenbank ist ein coli-Stamm. K12 Release 57–11 innerhalb von Seaquest, wobei die automatisierte Datenbanksuche mit einer Präkursortoleranz von fünf Teilen pro Million eingerichtet wurde. Eine Fragmentionentoleranz von einer atomaren Masseneinheit sowie volle Trypsin-Spezifität wurden verwendet, wobei bis zu zwei unvollständige Spaltungen erlaubt waren.

Legen Sie die variablen Modifikationen so fest, dass Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin, Oxidation von Methionin, Deamidierung an Asparagin und Glutamin, Acetylierung an Lysin, Formylierung an Lysin sowie Methylierung an Arginin, Lysin, Serin, Threonin und Asparagin zugelassen werden. Verwenden Sie keine festen Modifikationen bei der Datenbanksuche. Laden Sie DTA- oder SRF-Dateien, die von Sequest generiert wurden, in die Scaffold-3-Software, die die Wahrscheinlichkeitsbewertung von Peptidzuordnungen und Proteinidentifizierungen durchführt, indem sie Sequest- und X!Tandem-Datenbanksuchen kombiniert. Scaffold eignet sich gut zum einfachen Vergleichen, Validieren und Visualisieren von Proteinlisten aus mehreren Proben.

Legen Sie die Parameter in der Scaffold-Three-Software so fest, dass nur Proteinidentifizierungen akzeptiert und als separate Treffer gemeldet werden. Stellen Sie ein, dass die Treffer mindestens ein diskriminierendes Peptid enthalten müssen, das die Wahrscheinlichkeitsvalidierung bestanden hat. Berücksichtigen Sie gemäß der Scaffold-Three-Analyse nur Peptide mit einer Wahrscheinlichkeit von größer oder gleich 95 %, wie sie durch den Peptide-Prophet-Algorithmus innerhalb von Scaffold festgelegt wird.

Die drei Softwareprogramme setzen die Wahrscheinlichkeit für die Identifizierung von Proteinen bei mehreren Peptidzuordnungen auf größer oder gleich 95 % gemäß dem Protein-Profit-Algorithmus. Bei der Identifizierung von Proteinen anhand eines einzelnen Peptids wurde die Proteinwahrscheinlichkeit willkürlich auf größer oder gleich 50 % festgelegt, und das entsprechende Peptid wurde manuell überprüft. Proteine, deren MS/MS-Spektren ähnliche Peptide aufweisen und allein aufgrund der MS/MS-Analyse nicht unterscheidbar sind, werden von der Software entsprechend dem Sparsamkeitsprinzip zusammengefasst.

Die geschätzte Fehlentdeckungsrate bei der Identifizierung von Peptiden kann mithilfe des umgekehrten Protein-Datenbankansatzes bestimmt werden und sollte hier unter 1 % liegen. SDS-Page, Silberfärbung zur Analyse der erfassten intakten Proteine im Erfassungsassay. Nach dem UV-Bestrahlungsschritt wurde überschüssiges freies SAH hinzugefügt, um sicherzustellen, dass nur Proteine, an die die Erfassungsverbindung über die Photoreaktivitätsfunktion kovalent gebunden ist, isoliert werden.

Proteine wurden mittels MS aus geschnittenen Protein-Gelelektrophorese-Banden nach dem Ingel-Triptychus-Digest identifiziert. Zum Vergleich zeigt die äußerste linke Spur 0,25 % des gesamten Zelllysats von E. coli DH5α, aus dem die Proteine im Capture-Assay isoliert wurden. Dieser Vergleich verdeutlicht die drastische Verringerung der Probenvielfalt, die mit der Capture-Compound-Technologie erreicht wird.

Die Kontrollen wurden in der Mitte des Gels durchgeführt und beinhalten die Wettbewerbskontrolle des Assays. Diese Kontrolle enthält vor dem UVI-Bestrahlungsschritt ein Überschuss an freiem SAH als Konkurrent, um die Bindung von Proteinen an die SAH-Fängerverbindung über die SAH-Selektivitätsfunktion zu verhindern. Die Wettbewerbskontrolle ist entscheidend, um nicht-spezifisch gefangene Proteine zu identifizieren, die nicht an SAH binden.

Daher sind Proteine, die im Capture-Assay identifiziert wurden, jedoch nicht in der Kompetitionskontrolle, spezifische SAH-Bindeproteine. Eingeschlossen ist außerdem ein Pull-down-Experiment ohne UV-Bestrahlung und ohne Zugabe von freiem SAH.

Die Wettbewerbskontrolle des Pull-downs wird ebenfalls nicht bestrahlt, enthält jedoch SAH als Konkurrenten. Schließlich wird der kombinierte Capture-Assay zusammen mit dem Pull-down UV-bestrahlt, und während des Arbeitsablaufs wurde kein freies SAH zugegeben. Es ist offensichtlich, dass die photochemische Vernetzung die Ausbeute und Empfindlichkeit des Experiments verbessert, und die Spezifität kann leicht in Wettbewerbsversuchen mit einem Überschuss an freiem SAH getestet werden, anstatt die erfassten intakten Proteine per SDS-Gelelektrophorese zu analysieren.

Das gesamte Gemisch der gebundenen Proteine kann nach der Triptych-Verdauung in einem Schritt durch Nano-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie analysiert werden. Dies ist der eigentliche CCMS-Ansatz und deutlich empfindlicher als die Analyse mittels SDS-Gelelektrophorese. In dieser Tabelle sind METHYLTRANSFERASEN und andere ausgewählte Proteine aufgeführt, die in CCMS-Experimenten identifiziert wurden.

Die angegebenen Zahlen bezeichnen die ungewichtete Peptidspektralanzahl pro Protein; im Vergleich zum Pull-down wurden im Capture-Assay deutlich mehr Methyltransferasen und andere SAH-bindende Proteine identifiziert. Die SAH-Spezifität zeigt sich im nahezu vollständigen Ausbleiben dieser Proteine in der Wettbewerbskontrolle. Die Gesamtanzahl der identifizierten Proteine in den CCMS-Läufen sowie die Proteinüberschneidung zwischen den Läufen wurde tabellarisch erfasst.

Die Anzahl der Proteine, die mit mindestens zwei Peptiden identifiziert wurden, ist in Klammern angegeben. Die hohe Reproduzierbarkeit der Methode ergibt sich aus der hohen Übereinstimmung der identifizierten Proteine, insbesondere der hauptsächlich unspezifischen Proteine, zwischen vergleichbaren Experimenten, besonders bei den hier robust mit mindestens zwei Peptiden identifizierten Proteinen. Venndiagramme zeigen die Überschneidungen der identifizierten Proteine in der Capture-Assay, der Wettbewerbskontrolle und dem Pull-down an, während die Anzahlen aller identifizierten Proteine rechts angegeben sind, wobei die Anzahlen der Proteine, die mit mindestens zwei Peptiden identifiziert wurden, in Klammern gesetzt sind; die Anzahlen der Methyltransferasen und der SAH-Nuklease sind links dargestellt.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man mithilfe der Capture-Compound-Massenspektrometrie (CCMS) Methyltransferasen oder andere funktionelle Subproteome aus E. coli-Zelllysaten oder anderen Gewebe- bzw. Zelllysaten isolieren und identifizieren kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, lange Belichtungen des Capture-Compounds mit sichtbarem Licht zu vermeiden, um die Proben kühl zu halten, die TFA-Acetonitril-Lösung frisch herzustellen, die zur Freisetzung der gebundenen Proteine von den magnetischen Perlen verwendet wird, und eine Kontamination der Experimente durch externe Proteinquellen wie Keratin aus Staub oder vom Experimentator zu verhindern.

Außerdem haben wir festgestellt, dass es von der spezifischen Versuchsanordnung abhängt, ob die Off-Beat-Konfiguration, bei der die photochemische Vernetzung zwischen der Vorabfang-Verbindung und den Proteinen in Lösung stattfindet, oder die hier beschriebene On-Beat-Konfiguration bessere Ergebnisse liefert. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.