Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

Neurowissenschaftler untersuchen die Funktion des Gehirns, indem sie erforschen, wie Neuronen im Gehirn miteinander kommunizieren. Hier werden Änderungen der elektrischen Aktivität eines einzelnen Neurons hervorgerufen, indem eine experimentell gesteuerte Leitfähigkeit mittels der Dynamic-Clamp-Technik angewendet wird. Zunächst werden dünne Gehirnschnitte geschnitten und in einer Inkubationskammer aufbewahrt, die mit künstlichem zerebrospinalen Liquor gefüllt ist.

Ein Schnitt wird anschließend auf eine Patch-Clamp-Aufnahmekonfiguration übertragen. Ein Neuron wird ausgewählt und dann mit einer Ableitelektrode über einen dynamischen Clamp-Computer, der mit dem Aufnahmeverstärker verbunden ist, verschaltet. Eine NMDA-Rezeptorleitfähigkeit wird in die Zelle eingeleitet.

Die resultierenden Aufnahmen zeigen einen Schub von Aktionspotentialen, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von NMDA-Rezeptoren ein zellulärer Mechanismus ist, über den dopaminerge Neuronen Schübe erzeugen können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber gegenwärtigen Methoden wie direkter Strominjektion oder pharmakologischer Behandlung besteht darin, dass wir präzise die Effekte der Aktivierung eines experimentell definierten Rezeptors auf die elektrische Aktivität eines lebenden Neurons bestimmen können. Nachdem das Gehirn rasch aus einer anästhesierten Bragg-dolly-Ratte entnommen wurde, wurden mithilfe eines vibrierenden Mikrotoms 240 Mikrometer dicke horizontale Gehirnschnitte angefertigt.

Während die Schnitte angefertigt werden, verwenden Sie eine Transferpipette, um sie in eine Inkubationskammer mit einer Temperatur von 32 Grad Celsius zu bringen, die mit künstlichem zerebrospinalen Flüssigkeit gefüllt ist, bis die Aufnahmeexperimente durchgeführt werden. Die Apparatur für intrazelluläre Ableitungen besteht aus einem Mikroskop mit Objektiven für die Kontrastverfahren nach dem Gradientenprinzip, einem Monitor, einem Perfusionsystem, einem Multiclamp-700-B-Verstärker, einem Analog-Digital-Konverter, einem Mikromanipulator und einer Kopfstufe. Ein Mac-Pro-Computer führt die Datenerfassungssoftware Axo Graph X und die Multiclamp-Commander-Software aus, die neben der Apparatur für intrazelluläre Ableitungen und dem Mac-Pro-Computer steht ein Sun-Microsystems-Computer, der Echtzeit-Linux ausführt, zusammen mit seinem Analog-Digital-Konverter, der für die dynamische Klemmtechnik verwendet wird.

Die intrazelluläre Ableitmahlage sollte eine künstliche zerebrospinale Flüssigkeit bei etwa 35 Grad Celsius perfundieren. Falls die aufgezeichnete Schnittpräparation horizontal hergestellt wurde, verwenden Sie eine Transferpipette, um sie in eine Petrischale mit künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit zu geben, und teilen Sie die Schnittpräparation mithilfe eines Schneidwerkzeugs entlang der Mittellinie. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um die Schnittpräparation auf die intrazelluläre Ableitmahlage zu überführen, um elektrophysiologische Ableitungen durchzuführen.

Visualisieren Sie mit dem 40x-Objektiv das Zielneuron, hier ist ein einzelnes dopaminerges Neuron des Substantia-nigra-Gebiets zu sehen. Beachten Sie den elliptisch geformten Zellkörper mit zwei auslaufenden Dendriten. Ziehen Sie mit einem elektronischen Mikropipettenzieher (P 97) Elektroden mit einem Spitzenwiderstand von vier bis 10 Megaohm.

Als Nächstes füllen Sie mit einer Mikrofüll-Spritzennadel eine Elektrode mit der internen Lösung. Führen Sie die gefüllte Elektrode mit Hilfe einer Spritze, die über ein kurzes Stück Schlauch mit der Halbzelle verbunden ist, in die Halbzelle ein, die an die Kopfstufe des Verstärkers angeschlossen ist. Üben Sie einen geringen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode aus.

Unter visueller Kontrolle senken Sie die Elektrode auf das Zielneuron ab. Auf der Zelloberfläche wird eine Delle sichtbar. Geben Sie eine geringe negative Druckmenge an, um eine Giga-Dichtung an dem gewünschten Neuron zu erzeugen.

Üben Sie Saugdruck durch den Mund aus, um die Abdichtung zu durchbrechen. Dies stellt eine Ganzzell-Aufzeichnung dar. Nachdem die Abdichtung durchbrochen wurde, verwenden Sie die Software-Schnittstelle des Multiklamm-Kommandanten, um den Verstärker in den Stromklamm-Modus zu schalten, bei dem kein Strom injiziert werden kann.

Um eine NMDA-Leitfähigkeit in diese Zelle einzubringen, starten Sie zunächst die RTXI-Software auf dem Dynamic-Clamp-Computer. Laden Sie dann ein benutzerdefiniertes Modell, das einen NMDA-Rezeptor enthält, in den Speicher. Sobald das Modell in den RTXI-Speicher geladen ist, wird der Strom, der in Echtzeit in die Zelle injiziert werden soll, mithilfe der hier gezeigten Gleichung berechnet, wobei G-N-M-D-A die gewünschte Leitfähigkeit in Nanosiemens ist, die auf null Nanosiemens eingestellt ist.

Siemens standardmäßig ist MG die Magnesiumkonzentration. E-N-M-D-A ist das Umkehrpotential für den NMDA-Rezeptor, das auf null Millivolt eingestellt ist, und VM ist das Membranpotential der Zelle, gemessen am Verstärker in Millivolt. Verbinden Sie nun mit dem Standard-BNC-Kabel den Ausgang des Dynamic-Clamp-Computers mit dem Befehlseingang des Verstärkers über einen Analog-Digital-Wandler.

Stellen Sie den Verstärker mithilfe der Multi Clamp Commander-Software-Schnittstelle in den Standard-Stromklampen-Modus ic. RTXI wurde so eingerichtet, dass es die gewünschte Leitfähigkeit GFT als Spannungssignal von der Axo Graph X-Datenerfassungssoftware empfängt. Hier führen wir ein einfaches AXO Graph X-Protokoll aus, bei dem eine einsekündige Leitfähigkeitsstufe von 40 Nano Siemens auf die Zelle angewendet wird.

Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Versuchsaufbaus wird ein Aktionspotential-Ausbruch als Reaktion auf einen Leitfähigkeits-Sprung hervorgerufen; dabei wurde eine Ganzzell-Aufzeichnung vom Soma eines dopaminergen Neurons im Substantia-nigra-Pars-compacta-Gebiet durchgeführt. Dopaminerge Zellen feuern typischerweise spontan mit geringer Frequenz in einem schrittmacherähnlichen Muster. Ein Ausbruch von Aktionspotentialen kann durch phasische Anwendung einer NMDA-Rezeptorleitfähigkeit mittels dynamischem Klemmverfahren ausgelöst werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine NMDA-Leitfähigkeit in ein lebendes dopaminerges Neuron in einer isolierten Hirnschnittpräparation einbringt. Diese Technik kann jedoch für jeden Zelltyp verwendet werden, der mit standardmäßigen elektrophysiologischen Methoden aufgezeichnet werden kann. Ebenso kann der dynamische Klemmverstärker erweitert werden, um die elektrischen Effekte, aber eine breite Palette von Rezeptortypen nachzuahmen.

Wir hoffen, dass dieses Video hilfreich war, um zu zeigen, was die Dynamic-Clamp-Technik ist und wie wir sie in unserem Labor anwenden. Vielen Dank fürs Zuschauen.