Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, nicht-invasive Echtzeit-Stoffwechselveränderungen auf gesamttierischer Ebene innerhalb der Glykolyse, des Pyruvatstoffwechsels und des Tricarbonsäurezyklus zu überwachen, die durch individuelle Stoffwechselwege, genetische Veränderungen und/oder pharmakologische Behandlungen verursacht werden. Dies wird erreicht, indem lebende Nematoden mit stabilen Isotopen verfüttert werden, um eine ausreichende Isotopenanreicherung in mehr Metaboliten zu gewährleisten und die Quantifizierung genetischer und/oder pharmakologischer Veränderungen in intermediären Stoffwechselwegen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wird der Isotopeneinbau in atmosphärisches und gelöstes Kohlendioxid mittels Gasverhältnis-Massenspektrometrie gemessen, die eine direktere Beurteilung des intermediären metabolischen Flusses über kurze Zeiträume ermöglicht.

Die nächsten Proben werden für die Analyse ganzer Wurm-freier Aminosäuren mittels HPLC sowie durch Isotopenanreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren mittels GCMS aufbereitet, um die Veränderung des metabolischen Flusses in Nematoden zu quantifizieren. Nach der Exposition gegenüber stabilen Isotopen werden Ergebnisse erhalten, die Auswirkungen der unterschiedlichen Dauer der Isotopenexposition, der bakteriellen Beseitigung und alternativer Wurmstörungen in Wildtyp-Würmern zeigen, um die Isotopenhäufigkeit in intermediären Metaboliten zu untersuchen. Der Krieg mit der Methode kann Einblicke in das Segel gegen den intermediären Stoffwechsel geben.

Es kann auch auf unsere Systeme wie Säugetierzelllinien und -gewebe angewendet werden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir in der HPLC konsistente Anomalien in der Analyse von freien Wurmaminosäuren beobachteten, die auf eine gestörte intermediäre metabolische Flussart bei primären respiratorischen Veränderungen hindeuteten. Um dieses Verfahren zu starten.

Würmer, die entweder während der Entwicklung oder im Erwachsenenalter einem mit stabilen Isotopen markierten Stoffwechselvorläufer ausgesetzt waren, werden in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff gesammelt. In der Regel verdünnen wir die Würmer auf eine Konzentration von 1000 Würmern pro Milliliter. 60 % pro Chlorsäure, die Epsilon Aminocapronsäure als internen Standard enthält, werden den Würmern bis zu einer Endkonzentration von 4 % pro Chlorsäure und 20 Nanomolar des internen Standards zugegeben.

Lassen Sie den Wurm fünf Minuten lang durch die Schwerkraft zur Ruhe kommen, entfernen Sie dann den Überstand und bewahren Sie ihn in einem anderen Röhrchen auf. Der folgende Schritt ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens. Die Würmer müssen vor der Analyse der freien Metaboliten durch Screening vollständig zerkleinert werden. Mit einem Kunststoffhomogenisator und einem motorisierten Bohrer werden die Wurmproben 15 Sekunden lang zerkleinert.

Bestätigen Sie den Wurmaufschluss visuell durch Lichtmikroskopie und wiederholen Sie den Schleifvorgang bei Bedarf. In diesem Bild zeigen die Paneele A und B Würmer vor dem Schleifen. Im Gegensatz zu den Platten C und D, die nach dem Mahlen Schnecken aufweisen, wird bei der Schnecken-Homogenat-Zentrifuge der zuvor eingesparte Überstand auf die 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen übertragen.

Die Proben bei 2.250 U/min 1300 Gs für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein frisches Sieben-Milliliter-Glasröhrchen überführt. Bewahren Sie das Pellet für die spätere Verwendung in einem Proteinkonzentrationsassay auf.

Geben Sie nun vier normale Kaliumhydroxide in den SÜBERNAT, bis der pH-Bereich der Proben sieben bis acht Zentrifugen beträgt. Die neutralisierten Proben in den sieben Milliliter Glasröhrchen bei 2.250 U/min 1300 Gs für fünf Minuten Um Salze zu entfernen, geben Sie den Überstand aus jeder Probe in ein frisches sieben Milliliter Glasröhrchen. Die neutralisierten Proben können nun für die Metabolitenquantifizierung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC und Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder GCMS für die HPLC vorbereitet werden.

Trennen Sie 50 Mikroliter jeder neutralisierten Probe für die direkte Injektion in die HPLC. Die Quantifizierung der freien Aminosäuren erfolgt durch Vorkalableitung mit Al-Aldehyd- und Fluoreszenzdetektion. Wie zuvor beschrieben, werden die verbleibenden neutralisierten Proben unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes für GCMS extrahiert, um die Isotopenanreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren zu bestimmen, wie im nächsten Abschnitt gezeigt.

Um die Kügelchen zuzubereiten, fügen Sie eine normale Salzsäure separat zu einer G Eins und einer G 50 Kugel hinzu. In einem Liter Becherglas jede Flasche 30 Minuten lang unter Magnetrührer umrühren. Waschen Sie danach die Kügelchen 10 Mal mit entionisiertem Wasser, bis der pH-Wert der Waschungen dem pH-Wert des Wassers entspricht.

Als nächstes zeigen wir unsere Methode zur Herstellung von maßgeschneiderten kostengünstigen Säulen mit Glaspipetten. Vorgefertigte Säulen sind ebenfalls im Handel erhältlich. Um eine Säule vorzubereiten, führen Sie mit einer Pinzette einen Wattestopfen knapp über der schmalsten Stelle einer Weidepipettenspitze ein, verwenden Sie eine G one Kugel für die Extraktion organischer Säuren und eine G 50 Kugel

Für die Aminosäureextraktion füllen Sie jede Säule bis zu etwa einem Drittel der Säulenhöhe. Wenn eine Probe bereits einen neutralen pH-Wert hat, wird der Probe nichts hinzugefügt, bevor sie auf die Säule AG one aufgetragen wird. Um organische Säuren zu extrahieren Aminosäuren zu extrahieren, geben Sie einen Milliliter 0,1 normale Salzsäure in die Probe, bevor Sie sie auf die AG 50-Säule auftragen.

Tragen Sie nun die zuvor vorbereiteten neutralisierten Proben auf jede Säule auf. Waschen Sie jede Säule 10 Mal mit Wasser, bis die Wäschen neutral sind. Nachdem der Waschvorgang abgeschlossen ist, eluieren Sie jede Säule in frisch beschriftete Probenfläschchen aus vier Millilitern Glas. Für die Extraktion organischer Säuren geben Sie drei Milliliter von drei normalen Salzsäure in die AG eine Säule.

Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtzahl der markierten Kohlenstoffe zwischen drei Kohlenstoffarten, vier Kohlenstoffarten, fünf Kohlenstoffarten und sechs Kohlenstoffarten. Für die Aminosäureextraktion fügen Sie drei Milliliter von vier normalen Ammoniumhydroxid in die a G 50-Säule hinzu. Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtzahl der markierten Kohlenstoffe zwischen drei Kohlenstoffarten und fünf Kohlenstoffarten.

Nach Abschluss der Extraktion aus organischen Säuren und Aminosäuren stellen Sie die Probengefäße über Nacht in einen reaktiven Verdampfer mit drei Angaben, bis sie trocken sind. Die Proben werden dann entnommen und von GCMS analysiert, wie im Protokolltext beschrieben. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie tausend junge erwachsene Würmer auf eine experimentelle 35-Millimeter-NGM-Agri-Platte übertragen, die universell markierten Kohlenstoff, 13, Glukose und E-coli enthält.

Platzieren Sie als nächstes die experimentelle NGM-Platte ohne Abdeckung. In einer speziell angefertigten Glaskammer, die mit einem gut abgedichteten Drei-Wege-Absperrhahn ausgestattet ist, um eine präzise Probenahme und einen Austausch in der Atmosphäre zu ermöglichen. Decken Sie die Dichtung, an der die optisch transparente Glasscheibe auf der Platte sitzt, mit Hochvakuumfett ab.

Verschließen Sie die Kammer mit der Glasscheibe. Notieren Sie die Zeit. Als Zeitpunkt Null, 30 Minuten später, verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze, um 10 Milliliter der Atmosphäre aus der Glaskammer mit dem Dreiwege-Stopphahn zu entnehmen.

Schließen Sie den Absperrhahn zur Kammer Nach der Probenahme wird die Probe in ein vakuumiertes Glasröhrchen mit roter Wanne übertragen, das einen Milliliter Natriumbicarbonat in 0,1 molar Natriumhydroxid enthält. Als nächstes spritzen Sie 10 Milliliter Luft durch den Dreiwege-Absperrhahn in die Glaskammer. Mit einer 20-Milliliter-Spritze den Absperrhahn zur Kammer schließen. Nach erneuter Injektion von Atmosphäre und vor Wiederaufnahme der Inkubation ist die Probenahme der Atmosphäre aus der Glaskammer nach 60, 90 und 120 Minuten zu wiederholen.

Analysieren Sie diese atmosphärischen Kohlendioxidproben auf markierte Kohlenstoffanreicherung mit einem Gasverhältnis-Massenspektrometer, wie im Protokolltext beschrieben, stabile Isotope werden nach zwei Stunden gut in junge erwachsene Würmer eingebaut, wie hier durch markierten Kohlenstoff belegt, der in atmosphärischem Kohlendioxid gemessen wurde, und gelöstes Wurmkohlendioxid in Würmern, die entweder lebend oder UV-bestrahlt mit abgetöteten OP 50 e coli gefüttert wurden. Das Verhältnis von Kohlendioxid 13 zu Kohlendioxid 12 war in der Fraktion des gelösten Wurmkohlendioxids im Verhältnis zum freigesetzten atmosphärischen Kohlendioxid größer. Es wurde beobachtet, dass eine längere Exposition gegenüber einem stabilen Isotop aus der Larvenperiode und die anschließende Beseitigung von Würmern auf NGM Aate ohne Bakterien die Isotopenanreicherung von freiem Glutamat bei jungen erwachsenen Würmern erhöhte.

In dieser Grafik repräsentiert L eins Würmer, die mit universell markierter Kohlenstoff-13-Glukose gefüttert wurden, und OP 50-Bakterien vom Larvenstadium L 1 bis zum 959-zelligen Jungadultenstadium YA repräsentiert Würmer, die 48 Stunden lang mit Kohlenstoff-13-Glukose und OP 50-Bakterien gefüttert wurden, beginnend mit dem ersten Tag der Eiablage im Jungadultenstadium. Die x-Achse zeigt die Gesamtzahl der markierten Kohlenstoffatome in jeder Glutamatspezies an, und die y-Achse zeigt die prozentuale Anreicherung an. Alle Tiere wurden vor der nachgelagerten Probenvorbereitung von überschüssiger Isotopenmarkierung befreit.

Bei GCMS-Analysen zeigen die grünen Balken Würmer an, die nach Isotopenexposition durch Fütterung mit OP 50 E coli auf NGM-Platten für zwei Stunden vor der PCA-Extraktion beseitigt wurden. Die blauen und grauen Balken zeigen Würmer an, die nach Isotopenexposition auf NGM-Platten ohne Bakterien für zwei bzw. sechs Stunden vor der PCA-Extraktion beseitigt wurden, unabhängig vom Zeitverlauf der Isotopenexposition. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Isotopenanreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere entweder zwei oder sechs Stunden lang auf Platten freigelassen wurden.

In beiden Isotopenexpositionskursen wurde eine geringere Isotopenanreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere durch Fütterung unmarkierter Bakterien für zwei Stunden beseitigt wurden. Daher wurde das optimale Clearing-Protokoll für Würmer, die auf bakteriell ausgebreiteten N-GM-Platten mit Isotopen gezüchtet wurden, so bestimmt, dass es zwei Stunden lang auf nicht verteilten NGM-Platten gecleart wurde, um die prozentuale Anreicherung in intermediären Metaboliten zu optimieren. Nach einer 24-stündigen Behandlung in Flüssigkultur mit einer Sechs-Kohlenstoff-13-Glukose ohne Bakterien.

Es wurde ein Vergleich von Wurmproben durchgeführt, die allein durch Beschallung oder durch Beschallung plus Mahlen zerstört wurden, wie in dieser Abbildung gezeigt. Würmer, die durch Beschallung und Zerkleinerung gestört wurden, wiesen eine größere Isotopenanreicherung auf als Proben, die erst durch Beschallung zerstört wurden, und fütterten schließlich lebende Würmer mit einem stabilen Isotopenvorläufer, entweder während der Entwicklung von L in einem Stadium auf Platten oder beginnend am ersten Tag des Eies, wo sie als junge Erwachsene 24 Stunden lang in Flüssigkultur gelegt wurden. Ermöglicht eine empfindliche Analyse der Isotopenanreicherung zwischen Metaboliten, die auf einen Fluss durch Glykolyse und den Pyruvatstoffwechsel im Tricarbonsäurezyklus nach seiner Entwicklung hinweisen.

Diese Technik ebnete den Weg für mitochondriale Erkrankungen und erforschte den intermediären Stoffwechselfluss in der Eleganz des Meeres. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man stabile Isotopen, Profiling des intermediären Stoffwechsels und des metabolischen Flusses in den Nematoden, Die Eleganz, durchführt.