Name: Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Lernen Sie die stabile Isotopen-Profiling-Methode zur Analyse des intermediären metabolischen Flusses in Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die nicht-invasive Überwachung metabolischer Veränderungen in verschiedenen Lebensstadien.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (K08-DK073545 und NICHD geförderten Geistiges und Developmental Disabilities Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation und der University of Pennsylvania McCabe award (MJF), sowie die Tristan finanziert Mullen Fund (MJF und MY). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung von den National Institutes of Health.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
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<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
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</ol>

Die Anwendung der Massenspektrometrie zur Isotopenhäufigkeit in Vermittler Metaboliten zu messen bietet ein wunderbar detailliertes Bild der kritischen biochemischen Veränderungen 5. Hier haben wir ausführliche Protokolle für die Nutzung dieses hochsensitive und spezifische Methode zur Vermittlung Stoffwechselflusses in den genetisch vielseitige Modell Tier, C. Beurteilung zur Verfügung gestellt elegans. In der Tat, Fütterung lebenden Tieren mit stabilen Isotopen markierte metabolischen Vorstufen (z. B. 13 C-Glucose) ermöglicht neuartige Einblicke in Vermittler Stoffwechselweg flux bei der Messung von Isotopen-Anreicherung in Downstream-Metaboliten. Wir haben zuverlässige Methode entwickelt, um robuste Analyse der Fluss durch die Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und der Tricarbonsäurezyklus erhalten. Dies kann sowohl in Tieren, die stabilen Isotope von Anfang larvalen Entwicklungsstadien oder Anfang in der post-mitotischen Erwachsenen Zeitraum erreicht werden. Isotopen-Anreicherung in verschiedenen Metaboliten Arten können in Verbindung mit ganzen Wurm freie Aminosäure Profilierung durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie untersucht werden, wie zuvor 4 beschrieben, um absolute Isotopenanreicherung in verschiedene Arten von freien Wurm Alanin, Aspartat, Glutamat und Glutamin zu bestimmen. In der Tat sind übereinstimmende Muster von Isotopen-Anreicherung erzielt, wenn die Messung Aminosäure und einer organischen Säure Analyten in Aliquots von 1.000 bis 2.000 junge Erwachsene synchrone Würmer. Diese Methodik kann sensibel diskriminieren abnormal Vermittler Fluss im nuklearen Gen-basierte mitochondrialen Mutanten gegenüber Wildtyp-Würmer. Diese Technik hält Wert flux Veränderungen in bestimmten biochemischen Stoffwechselwege von Relevanz zu untersuchen, um gemeinsame angeborene Stoffwechselstörungen. Insbesondere informiert die Verwertung von Glukose mit stabilen Isotopen markierte Kohlenstoffflusses durch zentrale Stoffwechselwege von Relevanz für mitochondriale Erkrankungen. In der Tat weisen unsere Daten Anwendung dieser Methodik können sensibel diskriminieren abnormal Vermittler flux in ein nukleares Gen-basierte mitochondrialen Komplex III-Untereinheit Mutante (isp-1 (qm150)) relativ zum Wildtyp-Würmer. Es ist wichtig zu erkennen, dass da Isotopen Exposition über einen Zeitraum von einem bis zu mehreren Tagen abgeschlossen ist, quantifiziert Isotopenanreicherung stellt einen &quot;steady state&quot; Bereicherung Wert als quantifizierbare Fluß über einen definierten Zeitraum als in zellbasierten Modellen ermittelt werden könnte ausgesetzt Isotop für einen Zeitraum von Minuten bis Stunden. Eine weitere mögliche Einschränkung der Abfrage Weg Fluss im Laufe der Nematoden Entwicklung betrifft die unterschiedlichen Längen der Entwicklung der Larven, die in bestimmten Mutanten auftreten. Zum Beispiel sind viele schwere mitochondriale Mutationen bekannt, Verhaftung in der dritten (L3) Larvenstadium 6 zu bewirken. So kann die Analyse von Isotopen-Satzung nur bei Tieren, die bis ins Erwachsenenalter überleben nicht repräsentativ für die gesamte Bevölkerung mutierte werden. Allerdings könnte diese Methodik angepasst Isotopen Einbindung in Vermittler Metaboliten zu untersuchen in einem bestimmten Larvenstadium (wie L2), anstatt zu warten für die Tiere der erwachsenen Stadium erreicht zu sein. Ebenso haben Tiere, die die alternative Larvenstadium als dauer bekannt geben dürfte wesentlich verändert (wahrscheinlich weniger) Stoffwechselflusses gegenüber Tieren, die direkt vor durch die vier Larvenstadien. Zukünftige Studien könnten auch durchgeführt werden, um direkt zu bewerten Isotopen Einbindung in dauer der Bühne Tiere verschiedener genetischer Herkunft sein. Offenlegen von Tieren zu stabilen Isotopen für einen festen Zeitraum (hier 24 bis 48 Stunden) zu Beginn einmal Tiere erreichten die jungen erwachsenen Stadium (wie in Protokoll B detailliert) beseitigt die Auswirkungen der variable Entwicklungszeiten. Während 13 C-Glucose nur fragt Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und Tricarbonsäurezyklus Fluss, könnten auch andere Isotopen-Tracer potenziell beurteilt zu biochemischen Weg Fluss durch andere Wege des Interesses in Nematoden verhören werden. Zum Beispiel könnte 15 N-Glycin verwendet werden, um Aminosäure Umsatz in Nematoden zu beurteilen. Eine weitere mögliche Einschränkung dieses Ansatzes ist der Grad der Empfindlichkeit der Metabolit-Erkennung. Unsere Erfahrung zeigt, ein Minimum von 500 jungen Erwachsenen Nematoden notwendig sind, um erfolgreich zu quantifizieren Isotopen Einbau durch die HPLC und GC / MS-Verfahren hier beschäftigt. Einsatz von Instrumenten mit höherer Empfindlichkeit, wie Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), können gestatten, weitere Reduzierung der Anzahl Tiere untersucht, obwohl wir erwarten, dass dies unwahrscheinlich ist, um zuverlässige Quantifizierung von Metaboliten und Isotopen-Einbau in Metabolit Arten von einzelnen Würmern ermöglichen. Wir untersuchten Wurm Populationen von 1.000 Tiere pro Versuch, das fanden wir zuverlässig zu erkennen geringer Menge Metaboliten in jedem Stamm. Allerdings können manche Metaboliten, wie GABA, zuverlässig nur in viel größeren Populationen von Nematoden quantifiziert werden, in der Größenordnung von1x10 6 Tiere 4. Zusammenfassend liefert stabile Isotop Profilierung eine nicht-invasive und sichere (nicht-radioaktive) Ansatz, der seit langem eingesetzt, um angeborene Stoffwechselstörungen zu untersuchen. Die Anwendung dieser Methode auf C. elegans wurden die neuen Kapazitäten in vivo, in Echtzeit, metabolische Veränderungen, die auf das ganze Tier-Ebene auftreten, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologischen Wirkstoff Engagements führen kann untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; – Seite 59</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokolle A und C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>NGM-Agar</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protokolle A, B und C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-Glukose (universell markiert)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protokoll A und C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-Glukose (1,6 markiert)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>60% Perchlorsäure (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-Aminocapronsäure (interner Standard)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protokoll E</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protokoll E</td></tr><tr><td>AG 1-X8, 100-200, Chloridform-Harz</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protokolle A und B (Extraktion organischer Säuren)</td></tr><tr><td>AG 50W-X8, 100-200, Wasserstoffform-Harz</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protokolle A und B (Aminosäureextraktion)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokoll A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>deionisiertes Wasser</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>Helium</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protokoll C2</td></tr><tr><td>SMZ-800 Zoom-Stereo-Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protokolle A, B und C</td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge – 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>inkubierter Plattenschüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>Mini LabRoller Rotator</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>Stößel</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>1-L-Glaskolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1-L-Erlenmeyerkolben</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>25-mL-Erlenmeyerkolben</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>7-ml-Rundboden-Gläser + Gummistopfen</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protokolle A, B und C1,C2</td></tr><tr><td>10-ml-Rundboden-Gläser + Gummistopfen</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protokoll C2</td></tr><tr><td>Blaukappenröhrchen</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Konischförmige Kunststoffröhrchen</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Alle Protokolle</td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protokolle A und B</td></tr><tr><td>Spritzen (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protokolle C1 und C2</td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protokolle C1 und C2</td></tr><tr><td>Poly-Prep-Chromatographiesäulen</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>60-mm-Petri-Schalen</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>Glasgefäß (abgeschnittener Boden eines 1-L-Kolbens) mit fettdichtem Dreiweghahn</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>optisch transparente Glasplatte</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>Reacti-Vap III Verdampfer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>Baumwolle</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protokoll C1</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protokoll B</td></tr><tr><td>Zeitschaltuhr</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protokoll C</td></tr><tr><td>Gas-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protokoll D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protokoll D</td></tr></tbody></table>

stabilen isotopen profiling von intermediary metabolic flux in entwicklungs-und erwachsenen-stadium caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile Isotope Profiling ist seit langem sensitive Untersuchungen des metabolischen Konsequenzen der genetischen Mutationen und / oder pharmakologische Therapien in der Zell-und Säugetier-Modellen erlaubt. Hier beschreiben wir ausführlich Methoden zur stabilen Isotopen Profilierung der intermediären Stoffwechsel und Stoffwechselflusses in dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans ausführen. Es werden Methoden zur Profilierung ganze Wurm freien Aminosäuren, markierte Kohlendioxid, markierten organischen Säuren und markierten Aminosäuren in Tiere ausgesetzt stabilen Isotopen entweder von der frühen Entwicklung von Nematoden Nährmedien Agarplatten oder Anfang als junge Erwachsene, während verschiedene pharmakologische Behandlungen ausgesetzt beschrieben in flüssiger Kultur. Freie Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) in ganzen Wurm Aliquots in 4% iger Perchlorsäure extrahiert quantifiziert. Universell gekennzeichnet 13 C-Glucose-oder 1,6 - 13 C 2-Glucose als stabile Isotopen-Vorläufer, deren Bezeichnung Kohlenstoff wird durch Massenspektrometrie in Kohlendioxid (sowohl atmosphärisch und gelöst) sowie in Metaboliten bezeichnend für Fluss durch die Glykolyse zurückzuführen genutzt , Pyruvatstoffwechsels und die Tricarbonsäurezyklus. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um Auswirkungen von Isotop Belichtungszeit, verschiedene bakterielle Clearing-Protokolle und alternative Wurm Aufschlussverfahren in Wildtyp-Nematoden zu demonstrieren, wie auch das relative Ausmaß der Isotopen-Aufnahme in der mitochondrialen Komplex III-Mutante Würmer (isp-1 (qm150) ) bezogen auf Wildtyp-Würmer. Anwendung von stabilen Isotopen Profilierung in lebenden Nematoden stellt eine neuartige Fähigkeit, auf das ganze Tier-Ebene in Echtzeit Stoffwechselveränderungen, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologische Therapien verursacht wurden, sind zu untersuchen.

Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm beschrieben,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Es werden Methoden zur Beurteilung Isotopenanreicherung in Kohlendioxid, organische Säuren und Aminosäuren folgenden Isotop Exposition entweder während der Entwicklung auf Agarplatten oder im Erwachsenenalter in flüssiger Kultur beschrieben.

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Die stabile Isotopenprofilierung ermöglicht seit langem sensitive Untersuchungen der metabolischen Folgen genetischer Mutationen und/oder pharmakologischer Therapien in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, nichtinvasiv in Echtzeit Stoffwechselveränderungen auf der Ebene des gesamten Organismus im Bereich der Glykolyse, des Pyruvatstoffwechsels und des Tricarbonsäurezyklus zu überwachen, die durch einzelne Stoffwechselwege, genetische Veränderungen und/oder pharmakologische Behandlungen verursacht werden. Dies wird erreicht, indem lebenden Fadenwürmern stabile Isotope verabreicht werden, um eine ausreichende isotopische Anreicherung in einer größeren Zahl von Metaboliten zu erzielen, die eine Quantifizierung genetischer und/oder pharmakologischer Veränderungen in intermediären Stoffwechselwegen ermöglicht. Als zweiter Schritt werden die Einlagerung von Isotopen in atmosphärisches und gelöstes Kohlendioxid mittels Gasisotopenverhältnis-Massenspektrometrie gemessen, was eine direktere Beurteilung des intermediären Stoffwechselflusses über kurze Zeiträume hinweg ermöglicht.Anschließend werden die Proben zur Analyse freier Aminosäuren im gesamten Wurm mittels HPLC sowie durch isotopische Anreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren mittels GC-MS bearbeitet, um Veränderungen des metabolischen Flusses in Nematoden zu quantifizieren. Nach der Exposition gegenüber stabilen Isotopen werden Ergebnisse erhalten, die die Effekte variabler Dauer der Isotopenexposition, der bakteriellen Eliminierung und alternativer Wurmlyse in Wildtyp-Würmern zeigen, um die isotopische Anreicherung in intermediären Metaboliten zu untersuchen. Diese Methode kann Einblicke in die Regulation der intermediären Stoffwechselwege liefern.Es kann auch auf unsere Systeme wie Säugerzelllinien und Gewebe angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir bei der Analyse freier Aminosäuren in Würmern mittels HPLC konsistente Auffälligkeiten beobachteten, die auf eine beeinträchtigte intermediäre metabolische Flussrate bei primären respiratorischen Veränderungen der Funktion hindeuteten. Um dieses Verfahren zu beginnen.Würmer, die entweder während der Entwicklung oder im Erwachsenenalter einem stabilisotopenmarkierten metabolischen Vorläufer ausgesetzt wurden, werden in einem 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen gesammelt. Üblicherweise verdünnen wir die Würmer auf eine Konzentration von 1000 Würmern pro Milliliter. Geben Sie 60 %ige Perchlorsäure, die epsilon-Aminocapronsäure als internen Standard enthält, zu den Würmern hinzu, um eine Endkonzentration von 4 %iger Perchlorsäure und 20 Nanomolar internem Standard zu erreichen.Lassen Sie den Wurm fünf Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, dann entfernen und bewahren Sie den Überstand in einem anderen Gefäß auf. Der folgende Schritt ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens. Die Würmer müssen vor der Analyse freier Metaboliten vollständig durch Siebung zerkleinert werden. Mahlen Sie die Wurmproben mit einem Plastikhomogenisator und einem motorisierten Bohrer 15 Sekunden lang.Bestätigen Sie visuell die Wurmdisruption durch Lichtmikroskopie und wiederholen Sie das Zermahlen gegebenenfalls. In diesem Bild zeigen die Felder A und B Würmer vor dem Zermahlen. Im Gegensatz dazu zeigen die Felder C und D Würmer nach dem Zermahlen; überführen Sie anschließend das zuvor aufbewahrte Überstandsvolumen in 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit dem Wurmhominat und zentrifugieren Sie.Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.250 U/min, 1300 ×g, fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation überführen Sie den Überstand in ein frisches sieben Milliliter fassendes Glasröhrchen. Bewahren Sie das Pellet für spätere Verwendung in einem Protein-Konzentrations-Assay auf.Geben Sie nun vier normales Kaliumhydroxid zum Überstand, bis der pH-Bereich der Proben sieben bis acht beträgt, und zentrifugieren Sie. Zentrifugieren Sie die neutralisierten Proben in den sieben Milliliter fassenden Glasröhrchen bei 2.250 U/min (1.300 ×g) fünf Minuten lang. Um Salze zu entfernen, überführen Sie den Überstand jeder Probe in ein neues sieben Milliliter fassendes Glasröhrchen. Die neutralisierten Proben können nun zur Metabolitenquantifizierung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC sowie Gaschromatographie-Massenspektrometrie oder GC-MS für HPLC vorbereitet werden.Trennen Sie 50 Mikroliter jeder neutralisierten Probe zur direkten Injektion in die HPLC ab. Die Quantifizierung freier Aminosäuren erfolgt mittels vorab durchgeführter Derivatisierung mit Al-Dehyd und fluorimetrischer Detektion. Wie zuvor beschrieben, werden die verbleibenden neutralisierten Proben einer Extraktion mittels Ionenaustauschharz für die GC-MS unterzogen, um die isotopische Anreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren zu bestimmen, wie im nächsten Abschnitt dargestellt.Um die Kugeln vorzubereiten, geben Sie eine normale Salzsäure separat zu G 1 und G 50 Kugeln hinzu. Rühren Sie in Ein-Liter-Bechern jeden Kolben 30 Minuten lang mit einem Magnetrührer um. Danach spülen Sie die Kugeln 10-mal mit entionisiertem Wasser, bis der pH-Wert der Abwässer dem pH-Wert des Wassers entspricht.Danach zeigen wir unsere Methode zur Herstellung maßgeschneiderter, kostengünstiger Säulen unter Verwendung von Glaspipetten. Fertigsäulen sind ebenfalls im Handel erhältlich. Um eine Säule herzustellen, verwenden Sie eine Pinzette, um einen Wattebausch direkt oberhalb des engsten Teils einer Pasteur-Pipettenspitze einzubringen, und verwenden Sie G-one-Perlen zur Extraktion organischer Säuren sowie G-50-Perlen.Füllen Sie für die Aminosäure-Extraktion jede Säule bis zu etwa einem Drittel der Säulenhöhe. Wenn eine Probe bereits bei neutralem pH-Wert vorliegt, wird vor der Applikation auf die AG 1-Säule nichts zur Probe gegeben. Um organische Säuren zu extrahieren und Aminosäuren zu gewinnen, geben Sie ein Milliliter 0,1 normaler Salzsäure zur Probe hinzu, bevor Sie sie auf die AG 50-Säule auftragen.Tragen Sie nun die zuvor hergestellten neutralisierten Proben auf jede Säule auf. Waschen Sie jede Säule zehnmal mit Wasser, bis die Waschflüssigkeit neutral ist. Nach Abschluss des Waschvorgangs eluieren Sie jede Säule in frische, beschriftete Glasprobenfläschchen mit vier Milliliter Inhalt. Für die Extraktion organischer Säuren geben Sie drei Milliliter dreifach normaler Salzsäure zur AG-eins-Säule hinzu.Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtanzahl markierter Kohlenstoffatome unter dreiatomigen, vieratomigen, fünfatomigen und sechsatmigen Kohlenstoffverbindungen. Für die Aminosäure-Extraktion drei Milliliter vierfach normaler Ammoniumhydroxidlösung zu einer G-50-Säule hinzufügen. Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtanzahl markierter Kohlenstoffatome unter dreiatomigen und fünfatomigen Kohlenstoffverbindungen.Nach Abschluss der Extraktionen von organischen Säuren und Aminosäuren die Probenröhrchen über Nacht in einen Drehverdampfer geben, bis sie trocken sind. Die Proben werden anschließend versetzt und gemäß dem im Protokolltext beschriebenen Verfahren durch GC-MS analysiert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie tausend junge adulte Würmer auf eine experimentelle 35-Millimeter-NGM-Agarplatte mit universell markiertem Kohlenstoff-13-Glukose und E. coli überführen.Platzieren Sie als Nächstes die experimentelle NGM-Platte ohne Deckel in einer speziellen Glaswanne, die mit einem gut abgedichteten Dreiweghahn ausgestattet ist, um eine präzise Atmosphärenentnahme und -erneuerung zu ermöglichen. Versiegeln Sie die Stelle, an der die optisch transparente Glasplatte auf der Platte aufliegt, mit Hochvakuumfett.Versiegeln Sie die Kammer mit der Glasplatte. Notieren Sie den Zeitpunkt. Nehmen Sie 30 Minuten später, bezogen auf den Zeitpunkt null, mit einer 20-Milliliter-Spritze 10 Milliliter der Atmosphäre aus der Glaswanne über den Dreiweghahn ab.Schließen Sie den Hahn zur Kammer. Überführen Sie die Probe nach der Entnahme in ein vakuumiertes Glasröhrchen mit rotem Verschluss, das ein Milliliter Natriumbicarbonat in 0,1-molarer Natriumhydroxidlösung enthält. Danach injizieren Sie zehn Milliliter Luft über den Dreiweghahn in die Glas­kammer. Schließen Sie unter Verwendung einer 20-Milliliter-Spritze den Hahn zur Kammer, nachdem Sie erneut Atmosphäre injiziert haben, und wiederholen Sie vor Fortsetzung der Inkubation die Entnahme von Atmosphäre aus der Glas­kammer nach 60, 90 und 120 Minuten.Analysieren Sie diese atmosphärischen Kohlendioxidproben hinsichtlich der Markierung mit angereichertem Kohlenstoff unter Verwendung eines Gas-Verhältnis-Massenspektrometers, wie im Protokolltext beschrieben. Stabile Isotope sind nach zwei Stunden gut in junge erwachsene Würmer eingebaut, wie hier durch markierten Kohlenstoff in atmosphärischem Kohlendioxid und gelöstem Wurmkohlendioxid bei Würmern nachgewiesen, die entweder lebende oder durch UV-Bestrahlung abgetötete OP50 E. coli erhalten hatten. Das Verhältnis von Kohlenstoff-13-Kohlendioxid zu Kohlenstoff-12-Kohlendioxid war in der Fraktion des gelösten Wurmkohlendioxids höher als im freigesetzten atmosphärischen Kohlendioxid. Es wurde beobachtet, dass eine verlängerte Exposition gegenüber einem stabilen Isotop ab der Larvenphase sowie anschließendes Ausspülen der Würmer auf NGM-Agar ohne Bakterien die isotopische Anreicherung von freiem Glutamat in jungen erwachsenen Würmern erhöhte.In diesem Diagramm steht L1 für Würmer, die ab dem L1-Larvenstadium bis zum jungen Erwachsenenstadium mit 959 Zellen (YA) mit universell markiertem Kohlenstoff-13-Glukose und OP50-Bakterien gefüttert wurden, und YA steht für Würmer, die 48 Stunden lang mit Kohlenstoff-13-Glukose und OP50-Bakterien gefüttert wurden, beginnend am ersten Tag der Eiablage im jungen Erwachsenenstadium. Die x-Achse zeigt die Gesamtanzahl der markierten Kohlenstoffatome in jeder Glutamatart an, und die y-Achse zeigt die prozentuale Anreicherung an. Alle Tiere wurden vor der weiteren Probenvorbereitung von überschüssiger isotopischer Markierung befreit.Für GC-MS-Analysen zeigen die grünen Balken Würmer an, die nach der isotopischen Exposition durch Fütterung mit OP50 E. coli auf NGM-Platten zwei Stunden vor der PCA-Extraktion entleert wurden. Die blauen und grauen Balken zeigen Würmer an, die nach der isotopischen Exposition zwei bzw. sechs Stunden vor der PCA-Extraktion auf NGM-Platten ohne Bakterien entleert wurden, unabhängig vom Zeitverlauf der isotopischen Exposition. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der isotopischen Anreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere entweder zwei oder sechs Stunden auf den Platten entleert wurden.Bei beiden isotopischen Expositionsvarianten wurde eine geringere isotopische Anreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere zwei Stunden lang mit nicht markierten Bakterien gefüttert wurden. Daher wurde als optimales Clearance-Protokoll für Würmer, die auf mit Isotopen versetzten bakteriell beimpften NGM-Platten gezüchtet wurden, ein zweistündiges Clearance auf unbeimpften NGM-Platten festgelegt, um die prozentuale Anreicherung in intermediären Metaboliten zu maximieren. Nach einer 24-stündigen Behandlung in Flüssigkultur mit einem sechskohlenstoffhaltigen 13C-Glukose ohne Bakterien.Es wurde ein Vergleich zwischen Wurmproben durchgeführt, die allein durch Sonikation oder durch Sonikation in Kombination mit Mahlung disruptiert wurden, wie in dieser Abbildung dargestellt. Würmer, die durch Sonikation in Kombination mit Mahlung disruptiert wurden, wiesen eine stärkere isotopische Anreicherung auf als Proben, die ausschließlich durch Sonikation disruptiert wurden, wobei lebende Würmer abschließend entweder während der Entwicklung ab dem L1-Stadium auf Platten oder ab dem ersten Tag der Eiablage als junge adulte Tiere für 24 Stunden in Flüssigkultur mit einem stabilen isotopischen Vorläufermolekül gefüttert wurden. Dies ermöglicht eine empfindliche Analyse der isotopischen Anreicherung in Metaboliten, die für den Fluss durch die Glykolyse und den Pyruvatstoffwechsel im Tricarbonsäurezyklus nach der Entwicklung aussagekräftig sind.Diese Technik ebnete den Weg für die Erforschung des intermediären Stoffwechselumsatzes bei C. elegans im Bereich der mitochondrialen Erkrankungen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die stabile Isotopenanalyse zur Untersuchung des intermediären Stoffwechsels und des metabolischen Flusses bei den Fadenwürmern C. elegans durchgeführt wird.

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Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Diese Studie präsentiert Protokolle für zwei halbautomatische Ansätze zur Analyse der Bewegungsaktivität in C. elegans Komplex I Krankheit Gas-1(fc21) Würmer, nämlich ZebraLab (ein Mitteldurchsatz-Assay) und WormScan (ein Hochdurchsatz-Assay) und bieten vergleichende Analysen unter einer Vielzahl von Forschungsmethoden zur Quantifizierung des Nematodenverhaltens und der integrierten neuromuskulären Funktion.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.

Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance

Lernen Sie die stabile Isotopen-Profiling-Methode zur Analyse des intermediären metabolischen Flusses in Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die nicht-invasive Überwachung metabolischer Veränderungen in verschiedenen Lebensstadien.

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans

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