Name: Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die RNAi-vermittelte Genstilllegung bei Anopheles gambiae durch Thorax-Injektion von dsRNA. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung von Genfunktionen im Zusammenhang mit Malaria-Resistenz.

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RNAi-vermittelten Gen-Silencing in Mücken, bedarf der vorherigen Herstellung und Reinigung von spezifischen dsRNAs, dass das Gen von Interesse Ziel. Für dsRNA-Synthese, empfehlen wir die Ambion Megascript Kit, Verwendung eines T7-RNA-Polymerase-vermittelte in vitro Transkriptions-Reaktion macht. Für dsRNA Reinigung empfehlen wir die Qiagen RNeasy-Kit. Proben von dsRNA zu quantifizieren und angepasst werden, um 3 ug / ul in Wasser. Andere Materialien, die Sie benötigen sind: spitzen Pinzette, Objektträger aus Glas, Glas Mikrokapillare Nadeln, Mikroinjektor (wir verwenden Drummond Nanoject II), einem Lichtmikroskop vor einem kalten Block, eine überdachte Glas-Petrischale, Papierhandtücher und einen Eimer mit Eis montiert . Sie müssen auch einen Weg, um Mücken und geeignete Behälter für sie zusammen mit einer Nahrungsquelle wie Watte in 10% Saccharose getränkt sammeln. <ol><li> Sammeln Sie Ihre Mücken. Mit einem batteriebetriebenen Aspirator, sammeln die Mücken Sie zu injizieren. Stecken Sie die Düse mit einem Papiertuch oder Baumwolle, so dass keine Moskitos entweichen kann, und entfernen Sie das Reservoir. Da kalte Temperaturen Mücken betäuben, zu begraben das Reservoir in einen Eimer mit Eis und warten 5-10 Minuten für die Moskitos nicht mehr bewegt. Betäubung kann auch, indem das Reservoir in einem kalten Raum oder im Kühlschrank oder über CO 2 erreicht werden. Während dieser 5-10 Minuten, mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Bereiten Sie Ihren Arbeitsbereich. Set eine ebene Fläche kalten Block 2 ° C und Ort ein Glasplättchen auf sie. Dies ist, wo die Mücken Rest, wie Sie sie zu injizieren. Bringen Sie ein Glas Nadel auf die Mikroinjektor und nutzen Sie Ihre Zange an der Spitze der Nadel auf die gewünschte Breite zu brechen. Es ist wichtig, dass die Breite groß genug, um genug Platz für Flüssigkeit durchströmt zu einem vernünftigen Preis ist aber schmal genug, um eine minimale Wunde während der Injektion zuzufügen. Eine gute Nadelspitze wird schmal genug, um leicht verbiegen, aber nicht brechen. Legen Sie Ihre Spritzen an die gewünschte Lautstärke (für RNAi, verwenden wir 69 nL). Tauchen Sie die Spitze des Nadel in Ihrer Probe und ziehen Sie Ihre flüssigen Probe in die Nadel mit den Anweisungen des Herstellers. Die flüssige Probe kann eine dsRNA-Lösung Bakteriensuspension oder andere sein, die Injektion Prozess ist für alle gleich. Embed einer Glas-Petrischale in den Eiskübel so dass der Boden der Schale vollständig Kontaktaufnahme ist das Eis. Hier finden Sie Moskitos setzen, bis Sie bereit sind, sie zu injizieren sind. </li><li> Bereiten Sie Ihre Moskitos. Transfer 50-100 Mücken aus dem Reservoir der Glas-Petrischale. Verwenden Sie Ihre Pinzette, um sie zu einer einzigen Schicht dünner, so dass sicher die meisten haben mit dem kalten Boden der Schale kontaktieren, um sie betäubt. Decken diese Mücken mit der Schale bedecken, wenn nicht in Gebrauch ist. Zurück Reservoir zur Eiskübel zu halten den Rest der Moskitos betäubt. </li><li> Berg Mücken an kalten Block. Verwenden Sie Ihre spitzen Pinzette Moskitos ein zu einer Zeit übertragen aus der Schüssel auf den Objektträger auf dem kalten Block unter dem Lichtmikroskop montiert. Behandeln Sie die Mücken sanft, vorzugsweise an den Beinen. Line up so viele wie 30 Mücken side-by-side auf der Folie, so dass Sie sicher, kann jeder mit der Mikroinjektor bekommen und dafür sorgen, jeder Kontakt mit der kalten Folie. Stellen Sie sicher, Mücken bis sich ordentlich gefüttert, so dass während Sie entlang gehen Sie wissen, welche haben und die nicht injiziert. Lassen Sie andere Mücken in den gekühlten Petrischale abgedeckt. </li><li> Inject Ihre erste Gruppe von Mücken. Halten Sie Ihre spitzen Pinzette kippte in einer Hand und halten Sie die Mikroinjektor in der anderen Hand wie einen Bleistift. Verwenden Sie die Zange, um die Moskitos zu bewegen, wie Sie benötigen (handle ihnen durch die Beine, um Verletzungen zu vermeiden) und zu halten, die Mücke stabil wie Sie spritzen. Dies funktioniert am besten, wenn Sie die Zange zu verwenden, um eine Seite des Moskito-Unterstützung, wie Sie injizieren von der anderen Seite. Schieben Sie einfach die Nadelspitze in Mücke Thorax. Es ist am besten in eine straff noch dünnen Teil der Kutikula, um Verletzungen zu minimieren, zu injizieren. Vermeiden Sie auch Injektion zu tief, Sie wollen nur die Spitze, um im Inneren des Thorax werden; tiefere Injektionen verursachen größere Wunden, die das Überleben gefährden wird. Sobald die Nadelspitze in der Position, drücken und loslassen des Pedals der Mikroinjektor Geräte, die Ihren vorgegebenen Volumen von dsRNA liefern wird. Warten Sie eine Sekunde oder zwei, und entfernen Sie die Nadel aus der Mücke. Wenn ein Tropfen Flüssigkeit wird außerhalb der Wunde, ein paar Sekunden warten, um es in die Wunde aufgenommen werden. Wenn es nicht innerhalb von wenigen Sekunden zu absorbieren ist, zu verwerfen, dass Mücken und versuchen Sie es erneut. Fahren Sie mit der Einspritzung für alle Mücken auf dem Glasträger. </li><li> Speichern Sie Ihre Mücken. Wenn Sie fertig sind, legen Sie Ihre injiziert Mücken in gekennzeichneten Behältern (wir bevorzugen 1 Pint Wachs ausgekleideten Karton Tassen gedeckt durchNetzgewebe und sicherte mit Gummibändern und einem Pappdeckel). </li><li> Weiter Injektionen bis zur fertigen. Continue, um Stechmücken auf der Folie platzieren, injizieren und Transfer zum Bechern, bis Sie die Stichprobengröße Sie Lust haben. Konto für einige Todesfälle-Anfänger haben viele Mücken aus dem Trauma der Injektion sterben. Dies wird mit der Praxis zu verbessern, bis fast 100% der Mücken überleben Injektion. </li><li> Wenn Sie fertig sind, legen Sie ein gefaltetes, nasses Papier Handtuch über den Kelch zusammen mit einer Nahrungsquelle und decken die Tassen mit etwas Feuchtigkeit wie Kunststoff-Folie oder ein Kunststoff-Petri Deckel zu behalten. Injected Mücken sind anfällig für Austrocknung, so dass die Feuchtigkeit, die durch das nasse Handtuch zur Verfügung gestellt und erhalten durch den Kunststoff wird dazu beitragen, dies zu verhindern. </li><li> Zeigen Sie mit der Mücken in einer kontrollierten Umweltbedingungen Kammer für die Inkubation. </li></ol> Hinweis: Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt, und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren. Hinweis: Es gibt mehrere Variationen über mehrere Schritte der Mücke Einspritz-und RNAi-vermittelten Gen-Silencing-Technik. Einige Varianten sind beschrieben durch: Boisson, et al (2006) und Blandin, et al (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>für die dsRNA-Synthese; T7-RNA-Polymerase-vermittelte In-vitro-Transkription</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>für die Reinhaltung von dsRNA</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>sollte quantifiziert und auf 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L in Wasser eingestellt werden</td></tr><tr><td>fein-spitzige Pinzette</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glas-Mikrokapillarnadeln</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td><td>über einem Kühlblock montiert</td></tr><tr><td>Petrizelle</td><td></td><td></td><td></td><td>abgedeckt, aus Glas</td></tr><tr><td>Papiertücher</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10%iger Saccharose</td><td>Nahrung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Mücken</td></tr></tbody></table>

protokoll für die rnai-assays in adult moskitos (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse-Genetik-Ansätze haben sich als äußerst nützlich erwiesen, um zu bestimmen, welche Gene der Resistenz gegen vektorübertragene Pathogene bei Mücken zugrunde liegen. Dieses Video ...

Ich bin Lindsay Garver und Doktorandin im Labor von Dr. George Dimopoulos an der Johns Hopkins School of Public Health. Ich werde Ihnen zeigen, wie man die RNAi-vermittelte Stilllegung von Genen mittels Injektionstechnik durchführt. Der erste Schritt besteht darin, die Mücken zu sammeln, die wir injizieren werden.Dies sind lediglich Stammzuchtflaschen mit einer sehr großen Anzahl an Gabi. Es handelt sich um eine Mischung aus Männchen und Weibchen. Und dies ist unser batteriebetriebener Aspirator.Im Inneren befindet sich ein Lüfter, der Saugkraft erzeugt und die Mücken durch diese Düse in das Reservoir hineinzieht. Wir ziehen also den Stecker. Es gibt eine kleine Zugangstür, die normalerweise verklebt ist, um die Mücken im Inneren zu halten; wir öffnen sie, führen die Düse ein, schalten das Gerät ein und sammeln damit.Sobald sich die Mücken im Inneren befinden, verschließen wir die Öffnung der Düse und sehen die Mücken im Reservoir. Anschließend müssen wir diese Mücken betäuben. Dazu stellen wir das Reservoir in einen Eimer, der mit Eis gefüllt ist, bedecken es mit Eis und warten, bis die Mücken bewegungslos sind.Als nächster Schritt erfolgt die Injektion der Mücken, wozu wir das hi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt den allgemeinen Techniken verwendet, um hinten Anopheles gambiae im Labor. Die Methoden für die Pflege Labor Mücken sind in allen Phasen des Organismus Lebenszyklus von Larven zu Blut-Fütterung Erwachsene Puppen gezeigt.

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit...

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

RNA-Seq-Analysen werden immer wichtiger, um die molekularen Grundlagen adaptiver Merkmale in Nicht-Modellorganismen zu identifizieren. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene zwischen Diapause- und Nicht-Diapause-Aedes albopictus-Mücken beschrieben, von der Mückenaufzucht über die RNA-Sequenzierung bis hin zu bioinformatischen Analysen von RNA-Seq-Daten.

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke, Aedes albopictus

Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug zur Modifikation der Genexpression in kontrolliert raumzeitlicher Weise, das eine funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae ermöglicht. Die beschriebenen Verfahren für die Verwendung dieses Systems sind eine semi-standardisierte Klonierungsstrategie, Sexing und Screening von Puppen auf fluoreszierende Proteinmarker und Embryofixierung.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

Dieses Protokoll bietet die Schritte von der DNA-Extraktion bis zum Versuchsaufbau für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), einschließlich der Analyse zur Identifizierung und Quantifizierung von nicht-homologen End-Joining-Ereignissen (NHEJ) an Zielorten nach gRNA-induzierter Cas9-Spaltung und DNA-Reparatur. Andere Anwendungen dieser Methode umfassen Anwendungen wie den Polymorphismus-Nachweis und die Verifizierung von Gen-Editing-Varianten.

Digital-Droplet PCR zum Nachweis von Indel-Mutationen in gentechnisch veränderten Anopheline-Mückenpopulationen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Lernen Sie die RNAi-vermittelte Genstilllegung bei Anopheles gambiae durch Thorax-Injektion von dsRNA. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung von Genfunktionen im Zusammenhang mit Malaria-Resistenz.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

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