Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Ich bin Lindsay Garver und Doktorandin im Labor von Dr. George Dimopoulos an der Johns Hopkins School of Public Health. Und ich zeige Ihnen, wie Sie RNAi-vermitteltes Silencing von Genen mit einer Injektionstechnik durchführen können. Der erste Schritt besteht also darin, die Mücken zu sammeln, die wir injizieren werden.

Diese sind nur ein schrecklicher Gabi. Es ist eine Mischung aus Männchen und Weibchen. Und das ist unser batteriebetriebener Sauger.

Im Inneren befindet sich ein Ventilator, der einen Sog erzeugt und die Mücken durch diese Düse in dieses Reservoir zieht. Also ziehen wir den Stecker. Wir haben eine kleine Zugangstür, die normalerweise mit Klebeband verschlossen ist, um die Mücken im Inneren zu halten, aber wir öffnen sie und setzen die Düse ein, schalten sie ein und verwenden sie zum Sammeln.

Sobald wir die Mücken im Inneren haben, stecken wir die Oberseite der Düse ein und sehen die Mücken dort im Reservoir. Dann wollen wir diese Mücken betäuben. Also vergraben wir dieses Reservoir in einem Eiskübel, den wir mit Eis abdecken, und warten, bis die Mücken runtergehen.

Okay, der nächste Schritt besteht darin, die Moskitos zu injizieren und das zu verwenden, wir werden dies verwenden, das ist ein Nanojet zwei. Er besteht aus einem Zauberstabteil, den ich in der Hand halten werde. Und diese enthält die Nadel, die die Flüssigkeit an die Mücke abgibt.

Das Bedienfeld, das über unsere Füll- und Entleerungstasten verfügt und für das Ein- und Aussaugen von Flüssigkeit in die Nadel und aus ihr verantwortlich ist. Und dann ist das der Fuß. Dieser wird auf den Boden gelegt.

Und wenn ich dies mit dem Fuß drücke, wird ein Tropfen des entsprechenden Volumens in die Mücke abgegeben. Während also die Mücken auf Eis liegen, bereiten wir den Arbeitsplatz vor, indem wir einen kalten Block auf null bis zwei Grad Celsius einstellen. Dieser Kaltblock hat einen flachen Aufsatz, auf dem dann ein Glasschieber montiert ist.

Und das wird die Mücken davon abhalten, sich zu bewegen, während wir versuchen, sie zu manipulieren. Ich werde auch eine dieser Glaskapillarnadeln nehmen. Dies ist nur ein normales Glaskapillarrohr, das erhitzt und in der Mitte gezogen wurde, um eine Nadel zu erzeugen.

Und das ist es, was unsere Flüssigkeit halten wird. Und dann ist es das, was wir verwenden, um die Mücke zu injizieren und die Flüssigkeit abzugeben. Das nächste, was wir tun müssen, ist, die Kapillarnadel auf unseren Injektionsstab zu setzen.

Wir entfernen das Nasenstück. Stellen Sie sicher, dass die Innenringe gemäß den Anweisungen Ihres Herstellers angeordnet sind. Schiebe die Glasnadel nach unten in das Nasenstück und achte dabei auf die Spitze, damit du sie nicht zerbrichst.

Sobald das sicher ist, schiebe die Nadel des Stabs in die Kapillarnadel und schraube das Nasenstück fest fest. Als nächstes müssen Sie sicherstellen, dass die Nadel Ihres Kapillarrohrs eine gute Breite für Injektionen hat. Dies ist ein wirklich wichtiger Punkt, da eine zu dünne Nadel nicht die richtige Menge an Flüssigkeit abgibt und eine zu dicke Nadelspitze die Mücke verletzt und möglicherweise zum Tod führt.

Dies ist etwas, das viel Übung erfordert, aber eine gute Breite ist tatsächlich entscheidend für die richtige Injektion und das Überleben Ihrer Mücken. Was ich mache, ist, die Spitze der Nadel mit Ihrer feinen Pinzette so zu brechen, dass die Nadel immer noch nachgiebig und dennoch stabil ist. Wir brauchen unsere doppelsträngige RNA-Probe.

Diese Probe wurde mit einem Kit hergestellt. Es gibt eine Vielzahl von Kits auf dem Markt, mit denen spezifische Doppelstandard-RNAs für das gewünschte Gen erzeugt werden können. Wir verwenden unsere RNAs in einer Konzentration von drei Mikrogramm pro Mikroliter, und wir haben unser Nano-Injektionsset so eingestellt, dass eine Injektion 69 Nanoliter Position ausgibt.

Das Rohr steckt unsere Nadel in die Flüssigkeit und benutze den Füllknopf am Auswurf, um Flüssigkeit in die Nadel zu ziehen. Die Menge an Flüssigkeit, die du in der Nadel benötigst, ist direkt proportional zur Anzahl der Mücken, die du injizieren wirst. Okay? Und jetzt müssen wir die Mücken vorbereiten.

Also nehmen wir unsere Plastikschale P zwei und betten sie in unseren Eimer mit Eis ein. Wir kontrollieren, dass sich unsere Mücken nicht bewegen und verteilen sie dünn auf der kalten Petrischale. So wird sichergestellt, dass sich die Mücken während unserer Arbeit nicht bewegen und nicht herumfliegen.

Dann positionieren wir die Mücken auf unserer Glasrutsche, die nun null Grad Celsius hat. Und die Positionierung der Mücken ist entscheidend dafür, wie wir sie injizieren. Sie möchten also, dass Ihre Mücken geordnet aufgereiht sind, damit Sie wissen, welche injiziert wurden und welche nicht.

Und Sie möchten auch, dass zwischen Ihren Mücken genügend Platz ist, damit Sie sie mit dem Injektor erreichen können. Also bringen wir einzelne Mücken von der Pipischale auf die Rutsche, wobei wir darauf achten, sie an ihren Beinen zu behandeln. Dies vermeidet das Zerquetschen der Körper und führt zu einem besseren Überleben.

Jetzt sind wir also bereit für die Injektion. Wir verwenden die Pinzette mit feiner Spitze, um die Mücke auf einer Seite zu stützen, ich bin Rechtshänder, also benutze ich sie in meiner linken Hand. Und dann injizieren wir von der anderen Seite und führen die Spitze der Nadel in die Seite des Brustkorbs ein, so dass der Brustkorb der Mücke zwischen den Spitzen der Pinzette und der Nadelspitze eingeklemmt ist und die Nadelspitze eintritt.

Sobald sich die Nadelspitze im Brustkorb befindet, drücken Sie das Fußpedal, Sie hören einen Piepton und die Flüssigkeit wird in den Brustkorb der Mücke abgegeben. Dann gehst du zum nächsten und wiederholst. Hin und wieder, wenn Sie die Nadel zurückziehen, sehen Sie einen Tropfen Flüssigkeit, der die Eintrittsstelle verlassen hat.

Und wenn dies passiert, können Sie warten, bis die Flüssigkeit wieder in die Eintrittsstelle aufgenommen wird. Wenn das passiert, ist das in Ordnung. Wenn der Tropfen nicht resorbiert wird, wenn der Tropfen an der Außenseite des Brustkorbs verbleibt, muss diese Mücke entsorgt werden und Sie injizieren an ihrer Stelle eine andere.

Es ist auch wichtig, dass Sie darauf achten, dass Ihre Nadel nur so weit in den Brustkorb eindringt, wie es nötig ist. Sie möchten nicht auf die andere Seite durchstechen oder zu viel Nadelbreite durchlassen. Das Überleben des Thorax oder der Mücke wird beeinträchtigt.

Also setzen wir dieses Verfahren für alle Mücken nach Bedarf fort. Um Ihre injizierten Mücken aufzubewahren, haben wir einen mit Wachs ausgekleideten Pappbecher verwendet, der mit einem dünnen Netzgewebe bedeckt und mit einem Gummiband und einem Pappdeckel gesichert wurde. Wir öffneten die Zugangstür, die mit Klebeband abgedeckt ist, und fügten vorsichtig unsere Mücken hinzu, um Ihren Mücken beim Überleben zu helfen.

Du solltest einen Wattebausch hinzufügen, der mit einer 10%igen Saccharoselösung verheiratet wurde, die als Nahrungsquelle für die Mücken dient, während sie hier drin sind. Und ein feucht gefaltetes Papiertuch. Da verwundete Mücken dazu neigen, auszutrocknen, hilft dies, die Feuchtigkeit zu bewahren und das Überleben Ihrer injizierten Mücken zu unterstützen.

Wir runden das Ganze mit einem Petrideckel ab, um die Feuchtigkeit einzudämmen, damit unser Papiertuch und unsere Wattebällchen nass bleiben. Und dann inkubieren wir es unter normalen, umweltkontrollierten Bedingungen. Die molekulare Kinetik des RNAi-vermittelten Gen-Silencing variiert also von Gen zu Gen erheblich.

Bei einigen Genen kann das Silencing innerhalb eines Tages stattfinden, bei anderen Genen findet das effiziente Silencing erst nach mehreren Tagen statt. Unterschiede zwischen den einzelnen Genen können mit quantitativer Echtzeit-PCR gemessen werden, und dies überwacht die Transkriptspiegel in Ihren Mücken und sagt Ihnen, wann Sie eine effiziente Stilllegung erreicht haben. Daher würde ich empfehlen, ein paar Ihrer injizierten Mücken für diesen Zweck beiseite zu legen.

Dies wird Ihnen auch dabei helfen, festzustellen, wie effizient Ihre doppelsträngigen RNAs im Allgemeinen sind und ob Sie mit Ihren spezifischen doppelsträngigen RNAs ein effizientes Silencing erreichen können. Und wenn Sie tatsächlich in die Transkriptspiegel eingreifen, habe ich Ihnen gerade das Verfahren für RNAi-vermitteltes Gen-Silencing von Anomalie-Gambia-Mücken gezeigt. Bei diesem Verfahren werden dublettensträngige RNAs in den Thorax von Anole Gabi-Mücken mikroinjiziert.

Dieses Verfahren ist wichtig, da es eine der einfachsten und effektivsten Verschwendungen ist, um einzelne Gene in Mücken zu manipulieren.