Name: Einem Mausmodell der In Utero Transplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die In-Utero-Transplantation in Mäusen für Stammzellforschung und Gentherapie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Engraftment und Genexpression im fetalen Umfeld.

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Wir möchten unsere Finanzierungsquellen zu bestätigen: Die California Institute for Regenerative Medicine Clinical Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Perstein Award (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association ( TCM), und der March of Dimes (TCM).

1. Vorbereitung der Injektion Pipetten <ol><li> Kalibrieren Sie die Pipette puller wie die Trennung der Glaspipette innerhalb von 15 Sekunden (siehe Anweisungen des Herstellers bezüglich der Kalibrierung) auftritt. Die Pipette wird eine Verjüngung, wo sie trennt. </li><li> Schneiden Sie das Ende der Pipette, so dass der Abstand vom Beginn der Verjüngung bis zum Ende der Pipette 1.04cm bis 1.05cm ist. Die Länge der Pipette ist umgekehrt proportional zu dem Kaliber der Pipette Öffnung. Seien Sie sich bewusst, dass zuvor eine längere Pipette führt auch zu einer schwächeren Spitze, anfälliger für Brüche während der Injektion ist. </li><li> Der nächste Schritt, um die Pipette, um einen reibungslosen Fase durch Schärfen der Spitze auf einem Diamant-Schleifstein zu schaffen. Zum Zeitpunkt des Schneidens der Pipette auf die entsprechende Größe, die Pipette bricht oft mit einem natürlichen Fase an der Spitze, die beim Platzieren Sie die Pipette auf dem Rad werden müssen. Während dieses Prozesses ist es wichtig, vorsichtig Rest der Pipette auf dem Schleifstein und in regelmäßigen Abständen neu zu bewerten, um sicherzustellen, dass die Pipette noch berühren das Rad (wie die Schräge wird glatter, nimmt sie Kontakt mit dem Schleifstein zu verlieren). </li><li> Sobald die Schräge ist glatt, muss die Pipettenspitze geschärft (Abbildung 1). Elevate der Pipette, so dass es nicht mehr berühren Schärfscheibe, drehen Sie ihn um 10-50 Grad im Uhrzeigersinn, und setzen Sie die Pipette wieder auf den rotierenden Schleifstein für ~ 10 Sekunden. Ziehen Sie die Pipette aus der Schleifstein und nun die Kante. Dieser Schritt muss in der Regel mit mehreren kleinen Anpassungen wiederholt werden, um eine scharfe Kante zu schaffen. Wenn die Pipette an ihrem Rand zu lange steht, ist es eher eine unebene Oberfläche (Abbildung 1) zu entwickeln. Nach Abschluss einer Seite, können Sie fortfahren, um die gegenüberliegende Kante, indem Sie die obigen Schritte zu schärfen. </li><li> Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um eine umlaufende Linie jeder 4mm ab, wo die Verjüngung der Pipette beginnt zu zeichnen. Diese Abgrenzungen zu 5UL Volumen entsprechen. </li></ol> 2. In Utero Transplantation <ol><li> Nach der Vorbereitung des injizierbaren Material (z. B. Zellen, Viren, etc.) können Sie sich für die Injektion. Wir verwenden eine Mikroinjektor an Druckluft mit den folgenden Einstellungen: (Pressure-Einstellungen: Eingang 60-80 psi, füllen 40 psi, spritzen 8-12 psi, Balance 0 psi, halten Sie 0 psi; Injection Zeit von 100 Millisekunden). </li><li> Um sterilisieren Injektionspipette, reinigen Sie sie zweimal mit 70% EtOH gefolgt von zweimal mit sterilem 1X PBS. Als die Spitze der Pipette ist sehr zerbrechlich, empfehlen wir nicht Autoklavieren der Injektion Pipetten. </li><li> Die Injektionen können entweder erfolgt mit 2.5X-3.5X Vergrößerung Lupenbrille oder einem Binokular werden. Bereiten Sie Ihr Verfahren mit einer wärmenden Decke, Beleuchtung und notwendige chirurgische Instrumente. </li><li> Anesthetize die schwangere Maus (wir nutzen Isofluran und Sauerstoff über einen kontinuierlichen Fluss Anästhesie Einheit geliefert). Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der Rückenlage und bringen jedes Glied mit Klebeband, um die Maus zu fixieren. </li><li> Clip das Fell. Dann tragen sterile Handschuhe, den Bauch prep mit 10% PVP-Jod durch Alkohol, gefolgt, und injizieren ein Schmerzmittel wie Buprenorphin. </li><li> Machen Sie einen 1cm Schnitt im Unterbauch (der minderwertigen Aspekt der Schnittführung sollte ca. 1cm über dem Introitus werden). Inzision der Haut und der Faszie. Achten Sie darauf, nicht auf die Bauchorgane (Darm und Blase), die unmittelbar unter der dünnen Schicht der Faszie zu verletzen. </li><li> Mit Wattestäbchen vorsichtig strecken die Faszie und den graviden Uterus durch den Schnitt. Zählen Sie die Anzahl der Föten, indem Sie zunächst die Identifizierung der rechten und linken Eierstock, damit Sie visualisieren die gesamte Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle, bevor Sie fortfahren, so dass die Föten warm bleiben, während Sie für die Injektionen vorzubereiten. </li><li> Ziehen Sie die entsprechende Menge an Material für die Anzahl der Föten Sie planen, zu injizieren. Beim Ausfüllen der Nadel mit der Probe ist es wichtig, die Pipettenspitze eingetaucht zu vermeiden Absaugen Ihrer Probe in die Mikroinjektor Schlauch zu halten. Da Zellen in der Regel in einem kleinen Volumen, wir in der Regel legen Sie sie in einem kleinen Mikrozentrifuge (ex: 0,5 ml) tube oder direkt auf einem Stück Parafilm in der Lage sein, um die Nadel, ohne die Pipettenspitze zu füllen. </li><li> Vorsichtig halten jeden Fetus und den Teil des Fötus, das Sie planen, zu injizieren (zB Leber, Bauchhöhle, Bein, etc.). Mit Daumen und Zeigefinger, müssen Sie stabilisieren den Fötus in die Amnionhöhle, damit es nicht zu drehen, während Sie die Injektion werden. Es ist wichtig für den Fötus fest genug, um es noch zu stabilisieren sanft genug, um nicht zu beschädigen ihn zu halten. </li><li> Schieben Sie die Pipette durch die Gebärmutter, Amnion und fetaler Haut und in das Zielorgan. Wenn die Pipette ist scharf, sollte es leicht passieren diesen Geweben. Wenn die Pipettenspitze ist langweilig, man wi werden bemerken, Zelten der Gebärmutter und Fruchtwasser Membranen. Spritzen Sie die gewünschte Lautstärke in jedem Fötus. Es ist zwingend notwendig, dass Ihre Bewegungen stetige werden während der Zeit der Insertion, Injektion, und dem Rückzug der Pipette. </li><li> Sobald die gewünschte Lautstärke injiziert ist, ziehen Sie die Pipette vorsichtig. Wenn es richtig gemacht, sollte das Material nicht austreten aus der Amnionhöhle oder Gebärmutter. Wenn ein großes Loch in das Amnion, die man durch Austreten von Fruchtwasser erkennen kann erstellt wird, dann das Überleben gefährdet ist. Schließlich wird für Studien, dass postnatale Ernte zu erfüllen, müssen alle Feten erhalten technisch perfekt Injektionen, da es keine Möglichkeit, die injiziert und injizierten Feten nach der Geburt zu erkennen. </li><li> Wenn Sie die Durchführung Injektionen werden in der fetalen Leber, kann es zuweilen Blut sehen in der Pipettenspitze, nachdem sie zurückgezogen wird, das bestätigt Ihnen in die richtige Position und sollte keinen Einfluss auf das Überleben. Wenn die Durchführung intraperitoneale Injektionen, leicht unterhalb der fetalen Leber Ziel. Für die intramuskuläre Injektionen, können Sie Position des Fötus bis zur Hüfte und Oberschenkel zu identifizieren und injizieren Sie die gluteus Muskel. Schließlich wird für intraventrikuläre Injektion, ist es leicht, die Koronarnaht sehen Sie die Pipette an die entsprechenden Ziel zu lenken. Für diese Injektionen, sind etwas größer Kaliber Pipetten benötigt, um den Schädel, ohne die Pipette eindringen. </li><li> Als nächstes legen Sie sorgfältig die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle. Achten Sie darauf, es nicht auf sich selbst oder um seine Gefäßversorgung verdreht. Deliver 1ml steriler 1X PBS in der Mutter Bauchhöhle keine Flüssigkeit, die während des Verfahrens verloren zu ersetzen. Schließen Sie den Schnitt in 2 Schichten mit einer 5-0 Vicryl resorbierbares Nahtmaterial (ex: Vicryl). Schließen Sie zuerst die Faszie ohne Verletzung der darunter liegenden Darm oder Blase, und schließen Sie dann die Haut. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt kann nach dem Eingriff Medikamente zur Analgesie verabreicht werden. Zurück jedes injiziert Buchse auf seinen eigenen Käfig und platzieren Sie den Käfig auf eine wärmende Decke. Überwachen Sie die Maus, bis er aufrecht steht. Put Betten in den Käfig und die Maus in einer ruhigen Gegend von der Maus-Anlage, wo sie nicht gestört werden soll (dh keine Käfig-Reinigung) erst einige Tage nach Lieferung. Minimierung zusätzlicher Stress für das Tier sinkt die Wahrscheinlichkeit von Frühgeburten. </li><li> Sobald Sie die Injektion beendet haben, reinigen Sie Ihre Pipette zweimal mit sterilem 1X PBS und einmal mit 70% EtOH. </li><li> Injected Frauen sollen täglich beobachtet, um sicherzustellen, sie sind von dem Verfahren erholt ohne Schwierigkeiten. Der Schnitt sollte bei Schwellungen, Entzündungen, Wunden Trennung und andere Anzeichen einer Infektion überwacht werden. Postoperative Schmerzmittel können bei Bedarf verabreicht werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Survival of the injiziert Föten zu Begriff Lieferung ist der wichtigste limitierende Faktor für den Erfolg mit dieser Technik. Je nach Material injiziert und die Belastung der Maus verwendet wird, können die Überlebensraten variieren. Im Allgemeinen sollten die Injektionen von hämatopoetischen Zellen in Wildtyp-Mäusen auf E14 in mindestens 50% live-Welpen geboren führen. Höhere Überlebensraten sind je nach sowohl die technischen Aspekte der Injektion sowie die Eigenschaften der Mäuse injiziert werden. Minimierung der Verletzungen der Gebärmutter und Fruchtwasser Membranen ist die wichtigste technische Aspekt dieses Protokolls. Sharp wird Kleinkaliber Pipetten in minimal uterine Trauma während der Injektion führen. Wir empfehlen nicht, mit Standard-Injektionsnadeln als das Kaliber von vorgefertigten Nadeln ist zu groß und würde in ein großes Loch in der Gebärmutter führen. Handgefertigte Glas-Pipetten sind die einzigen kleinen Kalibers Nadeln, die in utero-Injektionen genutzt werden kann. Sorgfältige und gewissenhafte chirurgische Technik, einschließlich schonenden Umgang mit der Gebärmutter und eine kurze Narkose ist auch entscheidend für optimale Ergebnisse. Besondere Merkmale des Empfängers Mäusen wie der genetische Hintergrund, Gestationsalter, und Wurfgröße kann auch Auswirkungen auf das Überleben. Bestimmte Stämme von Mäusen sind anfälliger für vorzeitige Wehen und Fehlgeburten in Abhängigkeit von ihrer genetischen Hintergrund. 15 Transgene Tiere mit Muskel-oder neurodegenerative Defekte können eine gestörte Fähigkeit, Föten vaginal nach Durchlaufen eines medianen Laparotomie liefern haben. 8 Diese schwangeren Frauen kann die Lieferung von benötigen Kaiserschnitt. Wir haben auch festgestellt, dass das Gestationsalter zum Zeitpunkt der Injektion kann die Lebensfähigkeit auswirken. Föten, die jünger als embryonale Tag 12 sind, haben niedrigere Überlebensrate als bei älteren Föten. Schließlich haben wir festgestellt, dass große Wurf Größen (&gt; 10 Föten) zu höheren Raten von fetalen Tod nach der Injektion neigen. Achtung, sowohl die technischen Aspekte dieser Technik und die besonderen Merkmale der Mäuse injiziert werden kann das Überleben der injizierten Feten zu maximieren. ve_content "&gt; Wenn diese Methoden ordnungsgemäß durchgeführt werden, kann man erwarten, dass alle Föten, die eingespritzte Material ausgesetzt sind. Ähnlich wie bei der postnatalen Einstellung, jedoch die erfolgreiche Bereitstellung von Zellen oder Viren in utero nicht immer in Donorzelle Transplantation oder Gen-Ergebnis Ausdruck bzw.. Die Transplantation von Stammzellen, zum Beispiel, ist von mehreren Faktoren abhängig, wie die Dosis und die Quelle der transplantierten Zellen. Auch der Erfolg der viralen Transduktion, ist zum Teil bestimmt durch die Art der viralen Vektor verwendet. Man muss verstehen, die zahlreichen Faktoren, die Auswirkungen Überlebensrate der Jungtiere, zelluläre Transplantation und virale Transduktion zum Erfolg mit diesem Protokoll zu erreichen. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Diagramm mit korrekten Schärfen der Injektion Pipetten (Schritt 1,4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
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<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
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<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

Vor über 50 Jahren, Billingham, Brent, und Medawar in utero Transplantation in Mäuse verwendet, um Immuntoleranz gegenüber fremden Proteinen zu induzieren. 16 Seit dieser Zeit haben mehrere Varianten dieser Technik verwendet worden, um Fragen in der Immunologie und Stammzellbiologie Adresse. Das Protokoll detaillierte hier ist eine der am besten zugänglichen Methoden zur IUT. Die fetale Leber bietet eine einfach visualisiert Ziel und bietet Zugang zu den systemischen Krei...

<table><tbody><tr><td>Pipetten</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen-Schleifer</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

einem mausmodell der in utero transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Die Transplantation von Stammzellen und Viren in utero hat ein enormes Potenzial für die Behandlung von angeborenen Störungen im menschlichen Fötus. Zum Beispiel, in utero Transplantation (IUT) von hämatopoetischen Stammzellen verwendet wurde, um erfolgreich zu behandeln Patienten mit schwerer kombinierter Immundefizienz. 1,2 In mehreren anderen Bedingungen, jedoch hat IUT ohne Erfolg versucht worden. 3 Da diese gemischte Ergebnisse, die Verfügbarkeit eines effizienten nicht-menschlichen Modell, um die biologischen Folgen der Stammzelltransplantation und Gentherapie-Studie ist von entscheidender Bedeutung, um diesem Bereich voranzubringen. Wir und andere haben das Mausmodell der IUT zu Faktoren, die erfolgreiche Transplantation von in utero transplantierten hämatopoetischen Stammzellen in beiden Wildtyp-Mäusen 4-7 und die mit genetischen Erkrankungen Studie verwendet. 8,9 Die fetalen Umfeld bietet auch erhebliche Vorteile für die Erfolg in utero Gentherapie. Zum Beispiel hat die Lieferung von adenoviralen 10, Adeno-assoziierte virale 10, retrovirale 11 und lentiviralen Vektoren 12,13 in den Fötus in der Transduktion von mehreren Organen entfernt von der Injektionsstelle mit langfristigen Genexpression führte. In utero Gentherapie kann daher als eine mögliche Behandlungsstrategie für einzelnes Gen Erkrankungen wie Muskeldystrophie oder zystische Fibrose in Betracht gezogen werden. Ein weiterer potenzieller Vorteil von IUT ist die Fähigkeit, die Immuntoleranz zu einem bestimmten Antigen zu induzieren. Wie in Mäusen mit Hämophilie, die Einführung des Faktor IX früh in der Entwicklung führt zu Toleranz gegenüber diesem Protein zu sehen. 14 Zusätzlich zu seiner Verwendung bei der Untersuchung von potentiellen menschlichen Therapien kann das Mausmodell der IUT ein mächtiges Werkzeug, um grundlegende Fragen in Entwicklungs-und Stammzell-Biologie zu studieren. Zum Beispiel kann man liefern verschiedene kleine Moleküle zu induzieren oder hemmen Genexpression in definierten Stufen Gestationsalter und manipulieren Entwicklungspfaden. Die Auswirkungen dieser Änderungen können zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ersten Transplantation beurteilt werden. Darüber hinaus kann man pluripotent oder Abstammung bestimmte Vorläuferzellen in das fötale Umfeld zu Stammzell-Differenzierung in eine nicht-bestrahlten und unbeirrt Host-Umgebung Studie zu verpflanzen. Das Mausmodell der IUT hat bereits zahlreiche Erkenntnisse in den Bereichen Immunologie und Entwicklungs-und Stammzell-Biologie zur Verfügung gestellt. In diesem Video-basiertes Protokoll, beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung IUT in Maus-Föten und einen Überblick über die wichtigsten Schritte und mögliche Fallstricke dieser Technik.

Das Mausmodell der<em&gt; In utero</em&gt; Transplantation ist ein vielseitiges Werkzeug, mit dem die potenzielle klinische Anwendungen der Stammzell-Transplantation und Gentherapie in den Fötus untersucht werden können. In diesem Protokoll, präsentieren wir Ihnen einen allgemeinen Ansatz zur Durchführung dieses Verfahrens

Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

Die intrauterine Transplantation von Stammzellen und Viren bietet ein enormes Potenzial für die Behandlung angeborener Störungen beim menschlichen Fötus. Beispielsweise in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen oder Viren in Mäusefeten zu transplantieren. Erstellen Sie zunächst einen Schnitt an der ventralen Seite der Maus. Anschließend werden die Gebärmutter und die Feten nach außen verlagert und daraufhin die In-utero-Injektionen durchgeführt.Schließlich die Gebärmutter vorsichtig in die Bauchhöhle zurückbringen und die Bauchdeckenfaszie sowie die Haut verschließen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels PCR, Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie die zelluläre Einwanderung oder Genexpression in der Stammzelltransplantation und Gentherapie an der Gebärmutter nachweisen. Bei unseren innovativen Strategien zur Behandlung angeborener Erkrankungen vor der Geburt können wir das unreife fetale Immunsystem nutzen, um Toleranz gegenüber allogenen Zellen oder gebildeten Proteinen zu induzieren.Das Mausmodell der Transplantation in utero ermöglicht es uns, die biologischen Faktoren zu untersuchen, die dem Fetus eigen sind und zu einer erfolgreichen Induktion der Engraftment-Toleranz führen. Diese Technik wird nun von Amer Nial, einem Chirurgen und Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Die Vorbereitung der Injektionspipetten beginnt mit dem Ziehen von Glaspipetten mithilfe eines auf die Trennung der Pipette kalibrierten Pipettenziehgeräts.Positionieren Sie die Pipette innerhalb von 15 Sekunden in der Pipettenziehvorrichtung und befestigen Sie sie mit den oberen und unteren Klemmen. Drücken Sie anschließend die Zugtaste. Der Glühfaden wird heiß und die Pipette wird sich trennen.Die Pipette weist eine konische Verjüngung auf, an der sie abgeschnitten wird, sodass der Abstand vom Beginn der Verjüngung bis zum Ende der Pipette 1,04 bis 1,05 Zentimeter beträgt. Da die Länge der Pipette umgekehrt proportional zum Kaliber der Pipettenöffnung ist, führt eine längere Pipette zu einer schwächeren Spitze, die während der Injektion anfälliger für Brüche ist und das Überleben des injizierten Mäusefetus beeinträchtigen kann.Um eine glatte Abschrägung zu erzeugen, muss die Pipettenspitze auf einem Diamantschleifrad geschliffen werden. Schalten Sie das Rad ein und senken Sie die Pipette dann vorsichtig auf das rotierende Schleifrad. Wenn die Pipette zunächst geschnitten wird, bricht sie oft mit einer natürlichen Schräge ab. An der Spitze die Pipette regelmäßig über das angeschlossene Mikroskop neu bewerten, um sicherzustellen, dass die Pipette weiterhin das Rad berührt. Denn sobald die Schneidkante glatt wird, verliert sie den Kontakt zum Schleifrad. Sobald die Schneidkante glatt ist, muss die Pipettenspitze geschärft werden.Heben Sie die Pipette an, sodass sie das Schleifrad nicht mehr berührt. Drehen Sie sie um 10 bis 50 Grad im Uhrzeigersinn und setzen Sie die Pipette erneut etwa 10 Sekunden lang auf das rotierende Schleifrad auf. Achten Sie darauf, die Pipette nicht zu lange auf ihrer Kante abzustellen, da sich sonst eine unebene Oberfläche bilden könnte.Nehmen Sie die Pipette von dem Schleifrad zurück und prüfen Sie die Schneide. Dieser Schritt muss gewöhnlich mehrmals mit kleinen Anpassungen wiederholt werden, um eine scharfe Kante zu erzeugen. Nachdem eine Seite bearbeitet wurde, schleifen Sie die gegenüberliegende Kante auf die gleiche Weise, wie gerade gezeigt. Dieses Diagramm zeigt die korrekte Anspitzung der Injektionspipetten, eine Draufsicht auf eine richtig angespitzte Nadelschräge und eine Seitenansicht einer Pipette mit ungleichmäßiger Kante, wie hier dargestellt. Ziehen Sie abschließend mit einem Permanentstift eine ringförmige Markierungslinie. Beginnend dort, wo die Verjüngung der Pipette ansetzt, wird alle vier Millimeter eine solche Markierung angebracht; diese Einteilungen entsprechen jeweils einem Volumen von fünf Mikrolitern.Nachdem Sie die Injektion, die Pipetten und das injizierbare Material vorbereitet haben, können Sie sich auf die Injektionen vorbereiten. Reinigen Sie zunächst Ihre Injektionspipette zweimal mit einem XPBS, tauchen Sie die Pipette in PBS ein und drücken Sie die Fülltaste, bis genügend Flüssigkeit aspiriert wurde, um die Pipette zu füllen. Überprüfen Sie dann jeweils das PBS.Bereiten Sie als Nächstes Ihren Operationsbereich mit einer Wärmefolie, Beleuchtung und den notwendigen chirurgischen Instrumenten vor. Die Injektionen werden mit 2,5 x chirurgischen Vergrößerungsschleifen durchgeführt. In dieser Demonstration wird, obwohl auch ein Stereomikroskop verwendet werden kann, die anästhesierte Maus in Rückenlage auf eine Heizplatte gelegt und jedes Gliedmaßenende mit Klebeband befestigt, um das Tier zu sichern.Nachdem das Fell abgeschnitten wurde, bereiten Sie den Bauch mit 10% Povidon-Jod, gefolgt von Alkohol, vor und bestätigen Sie durch einen Zehenquetschtest, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Anschließend führen Sie einen einen Zentimeter langen Schnitt im unteren Bauchbereich durch. Der am weitesten kaudal gelegene Teil des Schnitts sollte etwa einen Zentimeter kranial zur Symphyse liegen. Schneiden Sie die Haut und die Faszie ein.Vermeiden Sie es sorgfältig, die unmittelbar unter der dünnen Faszienschicht liegenden Därme und die Harnblase zu verletzen. Dehnen Sie die Faszie mit Wattestäbchen vorsichtig und führen Sie den Uterus gr durch den Schnitt heraus. Identifizieren Sie die rechte und linke Ovarien, um sicherzustellen, dass der gesamte Uterus sichtbar ist, und zählen Sie anschließend die Gesamtanzahl der Feten. Legen Sie den Uterus zurück in die Bauchhöhle, bevor Sie fortfahren, damit die Feten warm bleiben, während Sie sich auf die Injektionen vorbereiten. Da die injizierbaren Materialien in der Regel in kleinem Volumen vorliegen, geben wir sie üblicherweise in ein kleines Mikrozentrifugenröhrchen, um die Nadel füllen zu können, ohne die Pipettenspitze zu beschädigen. Da die Injektionen den schwierigsten Aspekt dieses Verfahrens darstellen, ist eine gute Technik, die ein minimales Trauma des Uterus bewirkt, entscheidend für den Erfolg dieser Methode.Die Feten müssen fest, aber dennoch schonend gehalten werden, um Schäden zu vermeiden. Es ist außerdem unerlässlich, dass Ihre Bewegungen während des Einführens und Zurückziehens der Pipette stabil sind. Saugen Sie das entsprechende Volumen an Material entsprechend der Anzahl der Feten auf, die Sie injizieren möchten.Es ist wichtig, die Pipettenspitzen von Mers sauber zu halten, um zu verhindern, dass die Probe in die Mikroinjektionsschläuche gelangt. Halten Sie einen Feten vorsichtig fest und identifizieren Sie den Körperteil, den Sie injizieren möchten. In dieser Demonstration injizieren wir jeden Feten in einen unterschiedlichen Körperteil, wobei der erste die fetale Leber ist.Stabilisieren Sie mit Daumen und Zeigefinger den Feten innerhalb der Fruchtblase, sodass er sich während der Injektion nicht dreht. Um die Leber zu injizieren, führen Sie die Pipette vorsichtig durch die Gebärmutter, das Amnion und die fötale Haut in die fötale Leber ein. Eine scharfe Pipette sollte problemlos durch diese Gewebe gleiten.Injizieren Sie das gewünschte Volumen in den Fetus und entnehmen Sie die Pipette vorsichtig. Während des Einführens, der Injektion und des Entfernens der Pipette für intraperitoneale Injektionen ist es unerlässlich, dass Ihre Bewegungen ruhig sind. Die Pipette wird ebenfalls durch die Gebärmutter, das Amnion und die fötale Haut eingeführt, jedoch leicht unterhalb der fötalen Leber ausgerichtet.Injizieren Sie das gewünschte Volumen für intramuskuläre Injektionen. Positionieren Sie den Fötus, um Hüfte und Femur zu identifizieren, und injizieren Sie in den Musculus gluteus. Bei intraventrikulären Injektionen können die Sagittalsuturen leicht erkannt werden, um die Pipette zum geeigneten Zielgebiet für diese Injektionen zu führen.Pipetten mit einem etwas größeren Kaliber sind erforderlich, um den Schädel zu durchdringen, ohne dass die Pipette bricht. Bei Studien, die die Gewinnung nach der Geburt beinhalten, müssen alle Feten technisch einwandfreie Injektionen erhalten, da nach der Geburt nicht erkennbar ist, welche Feten injiziert und welche nicht injiziert wurden. Wenn die Injektionen korrekt durchgeführt werden, sollte kein Material aus der Fruchtblase oder dem Uterus austritt.Nachdem die Föten injiziert wurden, legen Sie die Gebärmutter vorsichtig zurück in die Bauchhöhle, wobei sichergestellt werden muss, dass sie weder um sich selbst noch um ihre Gefäßversorgung verdreht ist. Geben Sie ein Milliliter XPBS in die Bauchhöhle der Mutter, um jegliche Flüssigkeit zu ersetzen, die während des Eingriffs verloren ging. Verschließen Sie den Einschnitt in zwei Schichten mit einer fünf-ohm-nichtresorbierbaren Naht.Schließen Sie zuerst die Faszie, ohne den darunterliegenden Darm oder die Harnblase zu verletzen, und anschließend die Haut. Stellen Sie die injizierte weibliche Maus schließlich in ihren eigenen Einzelkäfig zurück. Stellen Sie den Käfig auf eine Wärmefolie und schieben Sie Einstreu in den Käfig.Stellen Sie die Maus in einen ruhigen Bereich der Tierhaltungseinrichtung, wo sie bis zu mehreren Tagen nach der Geburt nicht gestört wird. Die Minimierung zusätzlicher Belastungen für das Tier verringert die Wahrscheinlichkeit einer Frühgeburt. Repräsentative Ergebnisse der Spender-Einwanderung nach intrauteriner Zelltransplantation werden hier gezeigt. Embryonale Tag-14-Feten wurden mit GFP-positiven hämatopoetischen Stammzellen transplantiert.Im Anschluss wurde bei einem chimären Welpen eine Entnahme von peripherem Blut durchgeführt, um mittels Durchflusszytometrie die Expression des GFP-Markergens in den Spenderzellen nachzuweisen, was das Vorhandensein von Spenderzellen bestätigte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man Injektionspipetten herstellt und In-vivo-Injektionen im Uterus durchführt. Sobald diese grundlegenden Techniken beherrscht werden.Diese Methode kann modifiziert werden, um Feten in verschiedenen Schwangerschaftswochen zu injizieren, um grundlegende Entwicklungs- und Stammzellbiologie zu untersuchen.

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