Name: Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von organotypischen Schnitten aus GFP-exprimierenden Mausembryonen zur Bildgebung des spinalen Nervenwachstums. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung peripherer Nervenentwicklung.

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Die Autoren bedanken sich die ursprüngliche Quelle für die Idee zu schneiden Kultur auf Maus-Embryonen 5 durchführen. Wir möchten Joachim Kirsch für die großzügige wissenschaftliche Unterstützung und Anna Degen anerkennen für die Tätigkeit als unser Mädchen für alles bei den Dreharbeiten. Und der Universität Heidelberg (Exzellenzcluster Cellular Networks): Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) gefördert.

Teil 1: Vorbereitung für das Schneiden und Kultivieren. <ol><li> Bereiten 10-cm-Zellkulturplatten mit Slicing (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) und 3-cm Millicell-CM 0,4-um Kultur Membran-Einsätze und halten in Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Hitze bis 4% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und lassen Sie ihn auf Heizplatte, so dass es bei etwa 37 ° C bleibt </li><li> Füllen Sie 10-cm bakteriologischen Petrischalen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4) und auf Eis stellen. </li><li> Set up Mikrotom Kühleinrichtung oder sicherzustellen, dass Pufferwanne und Kühlelemente in den Gefrierschrank zur Vorkühlung es gespeichert. </li></ol> Teil 2: Embryo-Einbettung. <ol><li> Dissect Embryonen aus der Gebärmutter und untersuchen sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop für GFP-Expression zu überprüfen. </li><li> Legen Embryonen auf eine invertierte 10-cm-Petrischale und orientieren sie mit Whatman Papierstreifen übermäßigen PBS zu entfernen. </li><li> Bewerben Agarose auf den Embryo, um es in dieser Position zu fixieren. Lassen Agarose erstarren. </li><li> Begrenzen Sie die Umgebung des Embryos durch Schneiden mit einer Rasierklinge. </li><li> Drehen Sie die eingebettete Embryo auf der anderen Seite. </li><li> Wenden Sie zusätzliche Agarose an embryonalen Gewebe, um sicherzustellen, dass der Embryo vollständig eingebettet ist. </li><li> Bereiten Agarose-Block mit sauberen Kanten und montieren auf Vibratom Spannfutter mit Loctite 406, einem speziellen Klebstoff ähnlich wie bei "Krazy Glue". </li></ol> Teil 3: Slicing Verfahren. <ol><li> Richten Sie die vorgekühlte Pufferwanne und dem Kühlelement. </li><li> Legen Sie das Futter mit der geklebten Gewebe und fügen 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 +-freiem HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml Penicillin / Streptomycin) bis bedeckt. </li><li> Insert und beheben vorgereinigt (70% Ethanol) Mikrotomklinge. </li><li> Bereiten Sie 350 bis 450 mu m Scheiben schneiden und übertragen Sie sie mit verkürzten Glas Pasteurpipetten in Zellkulturplatten auf Eis gehalten. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Agarose von jeder Scheibe und Transfer zum Kultur-Membranen Millicell. Über 4 Scheiben können auf einer Membran in einer 10-cm Gewebekultur Platte mit 6 ml Kulturmedium gefüllt kultiviert werden. </li><li> Inkubieren Scheiben bei 37 ° C und 5% CO 2 (Kulturmedium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fötalem Rinderserum, 0,5% Glucose, 1 mM Glutamin, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Wenn man Zeitraffer-Imaging-Serie führt man sollte immer das Volumen des Mediums konstant. Im Falle der zeitlich Imaging-Serie für eine kurze Zeitspanne genügt es, das Medium zu verlassen, wie es ist. Für längere Zeiträume Kultur Veränderungen nach 12-20 Stunden empfohlen. </li></ol> Teil 4: Imaging Spinalnerven Auswuchs am Mikroskop. <ol><li> Image Spinalnerven Platzierung einer 10-cm Gewebekulturplatte, mit Millicell Kultur Membranen mit Scheiben, im Rahmen eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Beschriften Sie die Ausrichtung der Millicell Kultur Membranen auf Mikroskop-Bühne, um richtig zu positionieren in den nächsten Bildgebung Zeitpunkt. </li><li> Bild Spinalnerven Auswuchs mit 4x (numerische Apertur [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) oder 20x (NA 0,5) Ziele. </li></ol> Abbildung 1 zeigt ein Imaging-Serie Darstellung der Spinalnerven Auswuchs während 20 Stunden Kultur mit 4x und 10x Ziele. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Imaging Reihe von Spinalnerven Auswuchs in eine transversale Scheibe einer homozygoten tauGPF Embryo. * = Motoneuronen des ventralen Rückenmark, Pfeil = DRG. Die Rückenflosse (D)-ventralen (V) Achse der Scheibe angezeigt. Scalebars: 200 um.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

In einem umfassenden Vergleich von Methoden zur embryonalen Scheibe Kulturen der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen (E10 - E12) vorzubereiten, haben wir beobachtet, dass eine Vibratom ohne Frage stellt die zuverlässigsten Ergebnisse sowohl in Bezug auf die allgemeine Rentabilität der Kulturen und die Reproduzierbarkeit der den Nerv Auswuchs Muster. Im Gegensatz dazu bereit Scheiben mit einem McIlwain Gewebe Chopper 3 erwies sich als völlig lebensfähig. Wir hatten ursprünglich eine Guillotine-Methode <su...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Präparationswerkzeuge</td><td>Fine Science Tools</td><td>verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>L.M.P.-Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann-Papier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Verkürzte, feuerpolierte Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 100x</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM-Einlagen</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Kulturschalen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>keine</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>x4-Objektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>PL-Serie</td><td></td></tr><tr><td>x10-Objektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH-Serie</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Ausstattung für beheizte Kammer</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 und Inkubator S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypischen kultur der gfp-exprimierenden maus embryonen für real-time imaging der peripheren nerven outgrowth

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Für viele Zwecke ist der Anbau von Maus-Embryonen ex vivo als organotypischen Schnitten wünschenswert. Zum Beispiel verwenden wir eine transgene Maus-Linie (tauGFP), in dem die verbesserte Version des grün fluoreszierenden Protein (EGFP) exklusiv in allen Neuronen des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems 1 ist ausgedrückt, so dass die Möglichkeit, beide Filme die Innervation das Vorderbein und diesen Prozess mit pharmakologischen und genetischen Techniken 2 zu manipulieren. Die wichtigsten Parameter für die erfolgreiche Kultivierung solcher Scheiben Kulturen ist die Methode, mit der die Scheiben sind vorbereitet. Nach umfangreichen Tests von einer Vielzahl von Methoden, die wir gefunden haben, dass ein Vibratom die bestmögliche Gerät, um die Embryonen, so dass sie routinemäßig in einer Kultur, die Lebensfähigkeit über einen Zeitraum von mehreren Tagen und vor allem zeigt, Ergebnis Scheibe ist, entwickelt sich in einem Alter, -spezifischen Art und Weise. Für Mitte der Schwangerschaft Embryonen, schließt dies die normale Folge der Spinalnerven aus dem Rückenmark und Spinalganglien, um ihre Ziele in der Peripherie und die richtige Bestimmung des Skelett-und Muskelgewebe. In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode für die Verarbeitung von ganzen Embryonen embryonale Tag (E) E10 bis E12 in 300 bis 400 Mikrometer Scheiben für den Anbau in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator, der für Studium kann bis zu zwei Tage nach slice Vorbereitung. Entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes ist die Verwendung eines Vibratom jedem Agarose eingebettete Embryo in Scheiben schneiden. Dies ist durch den Anbau der Scheiben auf Millicell Kultur Membran-Einsätze auf ein kleines Volumen Medium platziert, wodurch eine Schnittstelle Kultur Technik gefolgt. Ein Wurf mit einem Durchschnitt von 7 Embryonen routinemäßig produziert mindestens 14 Scheiben (2-3 Scheiben von dem Vorderbein Region pro Embryo), das leicht variiert je nach Alter der Embryonen sowie die Dicke der Scheiben. Über 80% der kultivierten Scheiben zeigen Nerven Auswuchs, der througout der Anzucht 2 gemessen werden kann. Repräsentative Ergebnisse mit dem tauGFP Mauslinie demonstriert.

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Für viele Zwecke ist die ex vivo Kultivierung von Mausembryonen als organotypische Schnitte wünschenswert. Beispielsweise verwenden wir eine transgene Mauslinie (tauGFP) in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische Querschnitte aus der Vordergliedmaßenregion von GFP-exprimierenden Maus-Embryonen herzustellen, um das Wachstum der Spinalnerven abzubilden. Dies wird erreicht, indem die Embryonen zunächst in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet werden und der Bereich des Gewebes und der Agarose auf die Region von Interesse begrenzt wird. Der Agarose-Block wird anschließend zum Schneiden montiert.Anschließend werden die in der Blockierung eingebetteten Embryonen mit dem Vibratom geschnitten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die aros, die die Schnitte umgeben, zu entfernen und die Schnitte in Kulturschalen zu überführen. Die Schnitte werden dann kultiviert und zeigen ein Auswachsen peripherer Nerven in die Peripherie, das mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einer Guillotine oder einem Gewebeschneider besteht darin, dass die Schnitte kontrollierter erzeugt werden und eine verbesserte Lebensfähigkeit in der Kultur aufweisen. Daher kann diese Methode bei der Erforschung der Entwicklungsneurobiologie helfen, beispielsweise bei der Untersuchung der Wegleitung und des Auswachsens von Spinalnerven. Die Demonstration des Verfahrens wird Isabel Barman durchführen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 10 cm große Zellkulturplatten mit sechs Millilitern Kulturmedium und drei cm großen Millicell CM, 0,4-Mikron-Kulturmembaneinsätzen vorbereiten.Halten Sie sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Erwärmen Sie anschließend 4 % niedrigschmelzendes Agarose in PBS in der Mikrowelle und stellen Sie es auf eine Heizplatte, damit es etwa bei 37 Grad Celsius bleibt. Füllen Sie 10 cm große bakteriologische Petrischalen mit PBS und stellen Sie sie auf Eis.Danach richten Sie das Viome-K&uuml;hlger&auml;t ein. Bewahren Sie das Pufferfach und die K&uuml;hlelemente im Gefrierschrank auf, bis sie vollst&auml;ndig durchgefroren sind, um die Embryonen einzubetten. Zuerst sezieren Sie die Embryonen aus dem Uterus aus.Untersuchen Sie sie mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop und prüfen Sie die GFP-Expression. Danach bringen Sie die Embryonen mit Hilfe von Watman-Papierstreifen auf einer invertierten 10 cm großen Petrischale in die gewünschte Orientierung und entfernen überschüssiges PBS. Geben Sie Aros auf das Embryo, um es zu fixieren.In der orientierten Position warten, bis das Aros erstarrt, überschüssiges Aros abschneiden und gegebenenfalls das umliegende Gewebe im mittleren Bereich des Embryos entfernen. Den eingebetteten Embryo auf die andere Seite drehen. Weitere Aros auf das embryonale Gewebe auftragen, um sicherzustellen, dass der Embryo vollständig eingebettet ist.Warten Sie, bis das Agarose-Gel erstarrt ist. Bereiten Sie einen mit Embryonen eingebetteten Agarose-Block mit sauberen Kanten vor. Kleben Sie die Probe abschließend mit Loctite 4 0 6 auf einen Vakuumhalter.Richten Sie das vorgekühlte Pufferfach und die Kühlelemente ein. Platzieren Sie den Chuck mit dem verklebten Gewebe auf dem Viome. Geben Sie ein X-H-B-S-S auf den Chuck, bis das Gewebe bedeckt ist.Setzen Sie eine vorgereinigte Viome-Schneide in den Schneidehalter ein. Bereiten Sie anschließend Querschnitte mit einer Dicke von etwa 350 bis 450 Mikrometern vor. Jeder Schnitt wird mit einem HM 650 V Mikrotom durchgeführt.Überführen Sie die Schnitte mit einer verkürzten Glas-Pasteurpipette in Gewebekulturplatten und halten Sie sie auf Eis. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Aros aus allen Schnitten. Anschließend überführen Sie die Schnitte auf die Milli-Zellkulturmembrenen, wobei jeweils vier Schnitte auf jeder Membran in 10-Zentimeter-Kulturplatten angeordnet werden, die mit sechs Milliliter vorgewärmtem Kulturmedium gefüllt sind.Inkubieren Sie die Schnitte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zum Beginn der Zeitrafferaufnahmen und zwischen den Bildaufnahmeintervallen. Stellen Sie die Gewebekulturplatte mit Milli-Zellkulturmembranen und Schnitten unter ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop und lokalisieren Sie die Spinalnerven, um das Auswachsen der Spinalnerven mit vierfachen, 10-fachen oder 20-fachen Objektiven abzubilden. Kennzeichnen Sie die Orientierung der Milli-Zellkulturmembranen auf dem Mikroskoptisch, um sie beim nächsten Bildzeitpunkt korrekt neu positionieren zu können, falls keine stabile Temperatur und kein stabiles Kohlendioxidniveau vorhanden sind.Die hier gezeigte Aufnahme zeigt eine Zeitreihe des Auswachsens von Spinalnerven während 24 Stunden Kultur in einem Querschnitt eines homozygoten tau-GFP-Embryos. Der Stern markiert Motoneurone des ventralen Rückenmarks und der Pfeil zeigt das DRG. Das obere Bild wurde mit einem 4x-Objektiv aufgenommen, das untere Bild mit einem 10x-Objektiv.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Querschnitte von Maus-Embryonen präpariert, die zur Abbildung des Auswachsens der Rückenmarksnerven verwendet werden können.

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Forschung

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Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

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