Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, organotypische Querschnitte der Vordergliedmaßenregion von GFP-exprimierenden Mausembryonen zu präparieren, um das Auswachsen des Spinalnervs abzubilden. Dies wird erreicht, indem die Embryonen zunächst in Aros mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und der Bereich des Gewebes und des Aros auf die interessierende Region begrenzt wird. Anschließend wird der aros Block zum Schneiden montiert.

Dann werden die in den Block eingebetteten Embryonen mit dem Vibrator in Scheiben geschnitten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die die Scheiben umgebenden Aros zu entfernen und die Scheiben in Kulturplatten zu überführen. Die Schnitte werden dann kultiviert und zeigen das Auswachsen peripherer Nerven in die Peripherie, was mit Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie einer Guillotine oder einem Gewebezerkleinerer besteht darin, dass die Scheiben auf kontrolliertere Weise erzeugt werden und eine verbesserte Lebensfähigkeit in der Kultur aufweisen. Daher kann diese Methode bei der Untersuchung der Entwicklungsneurobiologie hilfreich sein, z. B. bei der Betrachtung der Führung und des Auswachsens von Spinalnerven, was zeigt, dass das Verfahren Isabel Barman sein wird. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von 10 Zentimeter großen Gewebekulturplatten mit sechs Millilitern Kulturmedium und drei Zentimeter Millizellzentimetern und 0,4 Mikron großen Kulturmembraneinsätzen.

Bewahren Sie sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf. Erhitzen Sie anschließend 4% niedrigen Schmelzpunkt in PBS in der Mikrowelle und bewahren Sie es auf einer Heizplatte auf, so dass es bei etwa 37 Grad Celsius bleibt. Füllen Sie 10 Zentimeter große bakteriologische Petrischalen mit PBS und legen Sie sie auf Eis.

Richten Sie dann das Viome-Kühlgerät ein. Bewahren Sie die Pufferschale und die Kühlelemente im Gefrierschrank auf, bis sie vollständig eingefroren sind, um den Embryo durchzuführen. Beim Einbetten werden zunächst Embryonen aus der Gebärmutter präpariert.

Untersuchen Sie sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop und prüfen Sie sie auf GFP-Expression. Legen Sie die Embryonen anschließend auf eine umgedrehte 10 Zentimeter große Petrischale, indem Sie Watman-Papierstreifen verwenden, um sie auszurichten und überschüssiges PBS zu entfernen. Tragen Sie Aros auf den Embryo auf, um ihn zu fixieren.

Warten Sie in der orientierten Position, bis sich der Aros verfestigt hat, den überschüssigen Aros beschneiden und falls gewünscht das Gewebe, das den mittleren Teil des Embryos umgibt. Drehen Sie den eingebetteten Embryo auf die andere Seite. Tragen Sie zusätzliche Aros auf das embryonale Gewebe auf, um sicherzustellen, dass der Embryo vollständig eingebettet ist.

Warte, bis sich die Aros verfestigt haben. Bereiten Sie den in den Embryo eingebetteten Aros-Block mit sauberen Kanten vor. Zum Schluss wird die Probe mit Loctite 4 0 6 auf ein Viomefutter geklebt.

Richten Sie die vorgekühlte Pufferwanne und die Kühlelemente ein. Legen Sie das Spannfutter mit dem verklebten Gewebe auf das Viom. Gib ein X-H-B-S-S in das Spannfutter, bis das Gewebe bedeckt ist.

Setzen Sie eine vorgereinigte Viome-Klinge in den Klingenhalter ein. Bereiten Sie anschließend Querscheiben mit einer Dicke von etwa 350 bis 450 Mikrometern vor. Jede Scheibe wird mit einem 50-V-Mikrotom HM six geschnitten.

Übertragen Sie die Scheiben mit einer verkürzten Weidepipette aus Glas auf Gewebekulturplatten und halten Sie sie auf Eis. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig Aros von allen Scheiben. Übertragen Sie dann die Scheiben auf die Milli-Zellkulturmembranen mit einer Anordnung von vier Scheiben auf jeder Membran auf 10 Zentimeter große Kulturplatten, die mit sechs Millilitern Vorwarmkultur gefüllt sind. Mittel.

Inkubieren Sie die Scheiben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zum Beginn der Zeitrafferaufnahme und zwischen den Bildintervallen. Legen Sie die Gewebekulturplatte mit den Millie-Zellkulturmembranen mit Scheiben unter ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop und lokalisieren Sie die Spinalnerven, stellen Sie das Auswachsen des Spinalnervs mit vier x, 10 x oder 20 x Objektiven dar. Markieren Sie die Ausrichtung der Milli-Zellkulturmembranen auf dem Mikroskoptisch, um sie beim nächsten Bildgebungszeitpunkt korrekt neu zu positionieren, falls die Temperatur und das Kohlendioxid nicht stabil sind.

Die hier gezeigte Umgebung ist eine bildgebende Serie des Auswuchses des Spinalnervs während einer 24-stündigen Kultur in einem Querschnitt eines homozygoten Tau-GFP-Embryos. Der Stern zeigt die Motoneuronen des ventralen Rückenmarks an und der Pfeil zeigt DRG an. Das obere Bild wurde mit einem vierfachen Objektiv und das untere mit einem 10-fachen Objektiv abgebildet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Querschnitte von Mausembryonen vorbereitet, die zur Darstellung des Auswuchses des Spinalnervs verwendet werden können.