Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aufzuzeigen, wie phasische und tonische motorische Endigungen mittels morphologischer Färbung und elektrophysiologischer Ableitung im Extensormuskel der Krebsschere exponiert und unterschieden werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst das erste oder zweite Laufbein eines mittelgroßen Krebses abgeknipst, das Cuticula herausgeschnitten und der Flexormuskel im Meitenabschnitt entfernt wird. Dadurch werden der Extensormuskel und das Nervenbündel freigelegt.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Präparation mit vier ethylamino-sterilen und Methylperitoneumjodid oder vier D zwei Asp zu färben, um die Axone und Nervenendigungen sichtbar zu machen. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die selektive Stimulation tonischer und/oder phasischer Neuronen und gleichzeitige intrazelluläre Ableitung evozierter EPSPs in der Muskelzelle. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit einer fokalen Elektrode spontane und evozierte Qu-Ereignisse aus den Endigungen aufzuzeichnen.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die tonische und phasische Endigungen morphologisch und physiologisch mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Elektrophysiologie unterscheiden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie in Bereichen wie Muskelermüdung, synaptische Depression und synaptische Kreuzkommunikation zu beantworten. Das Experiment beginnt damit, die Krebse vorsichtig unter Vermeidung seiner Scheren aufzuheben.

Trennen Sie das Bein am Isiopod-Segment vom Körper ab. Ein kräftiger Druckreiz am Isiopod-Segment führt dazu, dass die Krebse ihr erstes Laufbein automatisch abwerfen. Die Krebse hören auf zu bluten und werden anschließend in ihren Aufbewahrungstank zurückgebracht.

Die Krebs wird nicht geopfert. Legen Sie das Bein auf ein Stück Filterpapier, damit die Präparation beim Durchführen der Schnitte leicht gedreht werden kann. Drehen Sie das Bein so lange, bis die Außenseite, also die laterale Seite, auf der Präparationsplatte nach oben zeigt.

Dies hat im Allgemeinen die gewölbte Seite nach oben gerichtet. Mit einer scharfen Rasierklinge, die an einem Skalpellklingenbrecher befestigt ist, die Kutikula innerhalb des Meite-Segments entlang des in der Abbildung gezeigten Musters ritzen. Achten Sie darauf, beim dorsalen bis ventralen Schnitt entlang des Meite-Carpod-Gelenks nicht zu weit distal zu schneiden.

Dieser Schnitt erzeugt ein Fenster im Meiten über den darunterliegenden Beinmuskeln. Lassen Sie die Cuticula vorerst an Ort und Stelle. Legen Sie das Präparat in eine Präparierschale, die physiologische Salzlösung für Krebse enthält.

Bringen Sie an dieser Stelle mit feinen Pinzette eine Nadel in die Mitte des Carpod-Segments und in den dorsalen Bereich des Ischia-pod-Segments an, heben Sie das im Cuticula-Abschnitt ausgeschnittene Fenster leicht am distalen Ende an und schneiden Sie mit dem Rasiermesser die Flexormuskelfasern von der Cuticula ab. Setzen Sie den Schnitt von distal nach proximal fort und heben Sie schließlich das Cuticula-Fenster vollständig ab. Um den Extensormuskel freizulegen, muss der überlagernde Flexormuskel entfernt werden.

Trennen Sie die Sehne des Flexormuskels, indem Sie sie mit einer Nadel vom Flexormuskel lösen. Schneiden Sie dann die Sehne am Carpometacarpal-Gelenk durch. Wie dargestellt, ziehen Sie die Sehne vor dem Durchtrennen vorsichtig von der Beinhöhle weg und achten Sie darauf, ausschließlich die Sehne und nicht den Hauptnerv des Beins zu durchtrennen, der sich an der Innenseite der Sehne befindet.

Den Sehnenansatz mit der Pinzette an der Schnittstelle ergreifen und den Flexormuskel durch Anheben in Richtung Coddle von dem Bein lösen. Um den Nerv zum Extensormuskel freizulegen, den Hauptbeinnerv am Meropod-Carpod-Gelenk durchtrennen und den Hauptbeinnerv vorsichtig über den Extensormuskel zurückziehen. Die Trennung des Nervs zum Extensormuskel vom Hauptbeinnerv kann verbessert werden, indem der distale Stumpf des Hauptbeinnervs sanft zur Seite der Präparation gezogen wird. Beim Zurückklappen des Hauptbeinnervs über den Extensormuskel müssen gegebenenfalls kleine Äste des inhibitorischen Axons durchtrennt werden.

Das Nervenbündel kann mit Methylenblau-Färbung sichtbar gemacht werden. Allerdings würde Methylenblau für elektrophysiologische Ableitungen in diesem oberen Bild nicht verwendet werden. Rote Pfeile markieren die gewünschte Nervenbahn.

Das Nervenbündel von Interesse ist das größere Bündel, das sich vom Hauptnerv des Beins in der Nähe des proximalen Endes des Meropods abzweigt. Beachten Sie die Axonverzweigungen und die beiden leicht sichtbaren Axone innerhalb des Nervs. Nachdem nun der Nerv und der Muskel freigelegt sind, bereiten Sie die Versuchsapparatur vor.

Die intra- und extrazellulären Ableitungen werden mit einer Standard-Vorstufe und einem Verstärker durchgeführt. Wir verwenden einen Axon-Clamp-Zwei-B-Verstärker und eine Ein-XLU-Vorstufe. Es werden drei Elektroden benötigt, eine intrazelluläre und zwei extrazelluläre.

Die beiden extrazellulären Elektroden dienen zur Reizung des Nervs und zur Aufzeichnung synaptisch hervorgerufener sowie spontaner qual-Ereignisse. Polieren Sie die Fokalelektroden durch Feuer und biegen Sie sie leicht über einer Heizvorrichtung. Nachdem eine Fokalelektrode mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt wurde, setzen Sie sie in den Halter für die Stimulations-Elektrode ein und führen den Stimulationsdraht so ein, dass er die Salzlösung berührt.

Dies wird mit einer Gras-P-15-Stimulationsisolations-Einheit verbunden, die wiederum mit einem S-88-Gras-Stimulator verbunden ist. Während der elektrophysiologischen Ableitungen wird der Vitalfarbstoff D-2-ASP verwendet, um die Axone zum Anfärben der Axone sichtbar zu machen; tauschen Sie die Bad-Physiologische Salzlösung gegen eine Salzlösung, die fünf Mikromolar D-2-ASP-Farbstoff enthält, für fünf Minuten aus. Nach fünf Minuten füllen Sie die Petrischale erneut mit physiologischer Salzlösung für Krebse, stellen das Präparat unter ein Mikroskop und verwenden ein Forex-Objektiv.

Und bei 10x Okular das stimulierende Elektrodenspitze in den interessierenden Bereich bewegen. Der nächste Schritt besteht darin, das Lumen der makroskopischen Patch-Stimulations-Elektrode entweder auf die phasische oder die tonische Axon zu platzieren. Diese Fotografie einer Vierfarben-Zwei-Farbstoff-Präparation zeigt, dass das tonische Axon aufgrund des erhöhten Mitochondriengehalts heller sichtbar ist.

Die tonischen Endigungen weisen unter der Fluoreszenzmikroskopie zahlreiche Varikositäten auf, während die phasischen Endigungen dünner sind. Mit dem 20x-Objektiv wird die Elektrode entweder auf das tonische oder phasische Axon platziert. Hier wird die Elektrode auf das tonische Axon gesetzt.

Platzieren Sie die intrazelluläre Elektrode in ihren Mikromanipulator und führen Sie die intrazelluläre Elektrode in eine Streckermuskelzelle ein. Damit werden intrazelluläre exzitatorische postsynaptische Potentiale oder EPSPs aufgezeichnet. Zur Aufzeichnung qualitativer EPSPs.

Platzieren Sie die zweite fokale Elektrode in einen Mikromanipulator. Dies erfolgt, indem die vorherige intrazelluläre Elektrode und der Halter entfernt und durch einen sauberen Elektrodenhalter ersetzt werden. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um das Lumen der zweiten fokalen Elektrode direkt über eine synaptische Varikosität zu positionieren.

Die Elektroden- und Dichtungswiderstände werden bestimmt, indem Teststromimpulse durch die Elektrode geleitet werden. In unseren Experimenten lagen die Dichtungswiderstände zwischen 0,3 und einem Megaohm und die Elektrodenwiderstände zwischen 0,5 und einem Megaohm. Der Megaohm-Dichtungswiderstand kann während der gesamten Aufzeichnung überwacht werden.

Wenn Sie bereit sind, die Stimulation zu beginnen, schalten Sie die Scope-5.0-Software ein und beginnen Sie mit der Stimulation des isolierten Axons. Im Nervenbündel wird das tonische Axon durch die Saugnade stimuliert, und die EPSPs der Muskelzelle werden mittels einer intrazellulären oder extrazellulären Elektrode aufgezeichnet. Die EPSPs werden über eine PowerLab-Forest-Schnittstelle auf einen Computer aufgezeichnet.

Nach der Reizung des tonischen Axons kann die Stimulationsnadel auf das phasische Axon verschoben und das Experiment nach Nervenreizung wiederholt werden. Die intrazelluläre Elektrode zeichnet EPSPs auf, die als Antwort auf die Aktivität sowohl der tonischen als auch der phasischen Motoneurone entstehen. Die synaptische Facilitation der tonischen neuromuskulären Verbindungen hängt von der Frequenz der Nervenreizung ab, wie hier für aufeinanderfolgende Reizserien von jeweils etwa 20 Reizen bei einer Frequenz von 60 Hertz gezeigt.

Beachten Sie die Erleichterung, die bei mehrfachen Reizen auftritt. Diese Abbildung vergleicht die Amplituden der durch Reizung des tonischen Nervs erzeugten EPSPs bei Frequenzen von 20 Hertz in Blau, 40 Hertz in Grün und 60 Hertz in Rot; beachten Sie die deutliche Erleichterung, die bei höheren Reizfrequenzen sichtbar ist. Tonische Endigungen weisen eine geringe synaptische Wirksamkeit auf, zeigen jedoch dramatische erleichterte Antworten.

Hier sind die tonischen EPSPs allein dargestellt, und anschließend werden die phasischen Antworten im gleichen Maßstab überlagert. Im Gegensatz zu den tonischen Endigungen weisen die phasischen Endigungen eine hohe Qual-Effizienz auf, zeigen jedoch synaptische Depression bei hochfrequenter Stimulation. Die synaptische Depression an den phasischen Endigungen hängt ebenfalls mit der Reizfrequenz zusammen, wie hier gezeigt.

Eine kontinuierliche Stimulation mit fünf Hertz über 30 Minuten hinweg unterdrückt die Antwort an der neuromuskulären Verbindung. Bei höherer Stimulationfrequenz wird das Präparat schneller unterdrückt, sofern die Stimulation angemessen ist. Die neuromuskuläre Verbindung der Krebse erzeugt nicht-aktionspotenzialbildende EPSPs.

Diese EPSPs können verwendet werden, um die qualitativen Eigenschaften zu untersuchen, die die graduellen elektrischen Signale in diesen Muskeln ausmachen. Hier sind die qualitativen synaptischen Antworten des tonischen Endknopfes dargestellt. Beachten Sie, dass nicht alle Stimulationsdurchläufe zu einem qualitativen Ereignis führen.

Die direkte Zählung von quantalen Ereignissen ist bei schwacher Reizung für jede evozierte Antwort möglich. Die Anzahl quantaler Ereignisse kann leicht für die tonischen Endigungen bestimmt werden. Durch die Zählung quantaler Ereignisse können die synaptischen Antworten des phasischen Motoneurons auf die gleiche Weise aufgezeichnet werden.

Allerdings sind die hervorgerufenen Antworten mehrfacher Natur. Der mittlere Qual-Gehalt wird geschätzt, indem die mittlere Amplitude oder Fläche der Ausschläge zusammen mit der durchschnittlichen Spitzenamplitude oder Fläche spontaner Ereignisse verwendet wird. Ein letzter Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen des Flexormuskels, um den Nerv, der auf den Extensormuskel wartet, nicht zu beschädigen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.