Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Dissektion und Ableitung von primären Sinnesneuronen zu demonstrieren, die Informationen über Gelenkbewegungen und -stellungen als propriozeptive Signale für ein Tier übertragen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Bauch der Krebse dissekiert und die dorsale Hälfte des Präparats freigelegt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die elektrische Aktivität aus einem Gelenkrezeptororgan durch Platzieren eines segmentalen Nervs in einer Saugelektrode abzuleiten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gelenk in verschiedene Positionen zu bewegen und die Bewegung mit dem Aktivitätsprofil zu korrelieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Untersuchung der mit dem Sinnesorgan assoziierten anatomischen Strukturen. Dieses Verfahren zeigt eine Methode zur Ableitung der Aktivität primärer propriozeptiver Neuronen und kann zur Untersuchung der Effekte biogener Neuromodulation verwendet werden.

Diese Methode kann Dozenten dabei unterstützen, grundlegende Konzepte der Sinnesphysiologie zu vermitteln, wie beispielsweise die sensorische Adaption und die Beeinflussung der Sinneswahrnehmung durch Neuromodulatoren. Obwohl diese Methode Einblicke in die Propriozeption und Wirbellose ermöglicht, kann sie auch auf andere Modellorganismen wie Säugetiere angewendet werden, um die intrafusalen Muskelspindeln besser zu verstehen. Dieses Verfahren beschreibt, wie man die in den Abdominalmuskeln der Krebse lokalisierten Muskelrezeptororgane isoliert, stimuliert und von ihnen Ableitungen durchführt.

Der erste Schritt besteht darin, den Krebsnerv und die Bauchmuskeln, die das Muskelrezeptororgan enthalten, zu präparieren. Wählen Sie einen Krebs – wir verwenden Procambarus clarkii mit einer Körperlänge von sechs bis zehn Zentimetern – und legen Sie ihn zwei bis drei Minuten lang auf Eis, um ihn zu betäuben. Die Präparation beginnt mit der Enthauptung des Krebses, wie durch die mit A markierten Linien in der Abbildung dargestellt.

Der nächste Schnitt an Stelle B dient dazu, den Thorax vom Abdomen zu trennen, und der dritte Schnitt an Stelle C öffnet das Abdomen. Sobald die Krebsartige narkotisiert ist, halten Sie sie mit einer Hand hinter den Scheren fest. Schneiden Sie dann schnell von der Augenhöhle bis zur Kopfmitte auf beiden Seiten und entfernen anschließend den Kopf.

Das Blut aus der Präparation ist klebrig, wenn es trocknet, daher reinigen Sie die Werkzeuge sofort. Nachdem die Krebse enthauptet wurde, schneiden Sie an der ventralen Seite zwischen Thorax und Abdomen. Schneiden Sie die Schwimmbeine ab.

Falls die Krebsart männlich ist, schneiden Sie den Stylus ab. Es sollte nun leicht sein, den Abdomen vom Thorax zu trennen. Führen Sie eine Scherenklinge in den Abdomen ein und schneiden Sie entlang der Seitenbegrenzung, wobei die Scherenspitzen von der Präparation wegzeigen.

Wiederholen Sie den Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite. Nehmen Sie das hintere Ende der Pinzette und schieben Sie die Muskulatur und den Magen-Darm-Trakt von der dorsalen Seite der Präparation weg. Achten Sie darauf, nicht auf die Muskeln zu drücken.

Schneiden Sie quer von lateral zu lateral am letzten Rippenbogen entlang, um die ventrale Seite des Schwanzes zu entfernen. Tauchen Sie das Präparat in Krebs-Ringer-Lösung ein und stellen Sie die Zigarrenschale mit dem Krebsabdomen unter das Präparationsmikroskop. Im nächsten Schritt richten Sie Ihre Stimulations- und Ableitungsvorrichtung ein.

Der Versuchsaufbau besteht aus einer Faraday-Kabine, einem Mikroskop, einem Hochleistungs-Beleuchtungsgerät, einem Mikromanipulator und dem Salzlösungsbad. Die Faraday-Kabine dient dazu, äußere elektrische Felder abzuschirmen, die die elektrische Ableitung stören könnten. Positionieren Sie das Mikroskop so, dass es die Mikroskopierbühne überblickt.

Bewegen Sie den Hochleistungsbeleuchter in eine günstige Position. Setzen Sie die Saugnadelelektrode in den Mikromanipulator ein und positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass die Saugnadelelektrode einfach Zugang zum Salinbad hat. Saugen Sie Salzlösung in die Saugnadelelektrode, bis die Salzlösung mit dem Silberdraht in Kontakt steht.

Ordnen Sie den anderen Draht so an, dass er nahe an der Spitze der Saugelektrode liegt, damit beide Drähte mit dem Salzlösungsbad in Kontakt stehen. Schließen Sie den Wechselstrom-DCD-Differenzverstärker an das Power Lab 26 T an und überprüfen Sie die Einstellungen am Verstärker. Schließen Sie die Kopfstufe an die Eingangsprobe des Verstärkers an.

Verbinden Sie die elektrischen Kabel der Saugnadelelektrode mit der Kopfstufe. Die Kabel sollten so angeschlossen werden, dass rot oben links, grün in der Mitte und schwarz unten sitzt. Verbinden Sie nun das USB-Kabel vom Power Lab 2016 mit dem Computer.

Stellen Sie sicher, dass sowohl der Verstärker als auch das Power Lab 26 T angeschlossen und eingeschaltet sind, bevor Sie Lab Chart 7 auf dem Computer öffnen. Starten Sie Lab Chart 7, die Datenaufzeichnungssoftware für den Computer. Das Willkommensfenster von Lab Chart öffnet sich.

Schließen Sie es. Klicken Sie auf Einrichten. Klicken Sie unten links im Feld auf Kanaleinstellungen.

Ändern Sie die Anzahl der Kanäle, indem Sie oben links im Diagramm auf „einen Kanal“ klicken. Stellen Sie die Zyklen pro Sekunde auf etwa 2K ein. Stellen Sie die Skalierung der Y-Achse rechts im Diagramm auf 500 oder 200 Millivolt ein.

Klicken Sie auf Kanal eins. Klicken Sie auf den Eingangsverstärker. Wählen Sie die folgenden Einstellungen: single-ended, AC-gekoppelt, invert, um das Signal gegebenenfalls umzukehren, und Anti-Alias.

Um die Datenaufzeichnung zu beginnen, klicken Sie auf „Start“, um die Datenaufzeichnung zu beenden. Klicken Sie auf „Stop“, um das Bad elektrisch zu erden, indem Sie einen silbernen Chlorid-Elektroden-Draht in das Bad geben und das andere Ende mit einem gemeinsamen Erdungspunkt verbinden. Falls das Erdungskabel das Bad verursacht elektrisches Rauschen, trennen Sie das Bad während der Aufnahme von der Erde.

Der nächste Schritt besteht darin, die Muskeln und Nerven von Interesse freizulegen. Die tiefen medialen Extensormuskeln oder DEM werden anhand ihrer spiralförmigen Fasern identifiziert, während die tiefen lateralen Extensormuskeln oder DEL lineare Fasern aufweisen. Diese Abbildung zeigt eine Fotografie der präparierten DEM- und DEL-Muskeln, die mit einer Strichzeichnung der Muskeln ausgerichtet sind.

Untersuchen Sie die Präparation unter dem Mikroskop und lokalisieren Sie die DEM- und DEL-Muskeln. Zu diesem Zeitpunkt sind die Muskelrezeptororgane selbst nicht sichtbar, da sie unterhalb der sichtbaren Muskeln liegen. Stechen Sie zwei Nadeln in den mittelsagittalen Bereich im distalen Teil des Abdomens zwischen den DEM-Muskeln an der ersten und zweiten Rippe.

Suchen Sie unter dem Mikroskop nach dem Nerv, der die sensorischen Axone von den Muskelrezeptororganen führt. Achten Sie auf das Segment mit dem am besten zugänglichen Nerv. Der Nerv ist weiß und kann sichtbar gemacht werden, indem man mit einer Pipette Salzlösung auf das Präparat sprüht oder leicht auf das Präparat bläst.

Dies bewirkt, dass sich der Nerv bewegt, wodurch seine Identifizierung erleichtert wird. Sobald Sie den Nerv lokalisiert haben, platzieren Sie mit Hilfe des Mikromanipulators die Saugelektrode direkt über dem Nerv. Ziehen Sie vorsichtig an der Spritze, um den Nerv in die Elektrode hineinzusaugen.

Sie können sehen, wie der Nerv durch das Mikroskop in die Elektrode hineingesaugt wird. Klicken Sie zum Beginn des Experiments im Datenaufzeichnungsprogramm auf „Start“. Bewegen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Schwanz der Krebsschere um 180 Grad auf und ab.

Verwenden Sie die Kommentarkennzeichnung in der Software, um den Stimulationswinkel für die spätere Datenanalyse zu notieren. Wiederholen Sie das Experiment unter einem Winkel von 45 Grad und zeichnen Sie die Winkeländerung mit der Kommentarkennzeichnung der Software auf. Wiederholen Sie dies bei einem Winkel von 90 Grad.

Beachten Sie den Unterschied in der sensorischen Nervenantwort bei jedem Winkel. Wenn Sie die Aufnahme abgeschlossen haben, können Sie die muskulären Rezeptororgane direkt betrachten. Diese Abbildung zeigt die relativen Positionen der muskulären Rezeptororgane, gekennzeichnet als SA und RA für schnell adaptierende und langsam adaptierende, sowie der D-E-M-D-E-L- und SEM-Muskeln.

Die Fotografie rechts wurde mit Methylenblau angefärbt. Um die Muskelrezeptororgane in Ihrer Präparation zu beobachten, färben Sie die Präparation zunächst mit Methylenblau an. Gießen Sie die Krebs-Ringer-Lösung aus der Cigar Box heraus und ersetzen Sie sie durch Methylenblau-Lösung. Schwenken Sie die Schale dann einige Minuten lang vorsichtig.

Geben Sie anschließend das überschüssige Methylenblau in den Abfallbehälter und gießen Sie frische Kochsalzlösung auf die Präparation. Setzen Sie die Schale unter das Mikroskop zurück, um den überliegenden Muskel zu dissezieren, um die Muskelrezeptororgane freizulegen.

Schneiden Sie das Segment entlang der Rippe seitlich zur Mittelsagittalebene, indem Sie ein Teil der Schere unter den Muskel legen und beim Schneiden entlang des Muskels nach oben ziehen. Sobald die Muskeln DEL eins und zwei durchtrennt sind, klappen Sie diese Muskeln zurück und betrachten Sie eine dünne Muskelschicht, die als oberflächlicher extensor medialis-Muskel oder SEM bezeichnet wird. Die Muskelrezeptororgane sind die beiden letzten medialen Fasern, die parallel zum Helixmuskel verlaufen.

Seien Sie bei diesem Schritt sehr vorsichtig, um die Muskelrezeptororgane nicht zu beschädigen. Im mechanorezeptorischen System der Krebse existieren zwei unterschiedliche Arten von Dehnungsrezeptoren. Die phasischen Sinneseinheiten werden von schnellen motorischen Axonen innerviert, und die tonischen Sinneseinheiten werden von langsamen motorischen Axonen innerviert, wie in dieser Abbildung dargestellt.

Wenn ein tonischer Rezeptor durch Dehnung stimuliert wird, passt er sich langsam an den Reiz an und setzt ein gleichmäßiges Feuermuster von Aktionspotentialen fort. Im Gegensatz dazu passt sich ein phasischer Rezeptor bei Dehnungsreiz schnell an und feuert nur ein kurzes Muster von Aktionspotentialen ab. Diese Aufzeichnung zeigt die Nervenantwort, wenn das Bauchsegment, das ihn enthält, gebogen wurde.

Zunächst wurde das Segment in einem Winkel von 45 Grad gebogen und entspannt. Die nächste Aufnahme zeigt die Reaktion auf eine Beugung von 90 Grad mit anschließender Entspannung. Dies verdeutlicht, dass das schnelle Muskelrezeptororgan eine verstärkte Aktivität bei stärkerer Dehnung des MRO-Strangs aufweist.

Diese nächste Aufnahme zeigt die Aktivität des Muskelrezeptororgans, die durch Beugen des Schwanzes und Halten in einer 45-Grad-Position ausgelöst wird. Beachten Sie die Anpassung der neuronalen Aktivität, die sich in einer verringerten Feuerrate zeigt. Eine sinnvolle Erweiterung dieses Experiments wäre es, zu untersuchen, ob Neuromodulatoren die Feuerrate verändert haben, den Anpassungsprozess der sensorischen Antwort aufzuzeichnen, indem die Feuerrate zu verschiedenen Zeitpunkten während einer konstanten Position gemessen und die Daten in eine Tabelle wie die hier gezeigte eingetragen werden, entsprechend diesem Verfahren.

Andere Methoden, wie die Untersuchung der Wirkungen von Neurohormonen wie Topamin, Serotonin und Prolaktin, können getestet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich der zellulären Mechanismen von Verbindungen auf primäre sensorische Neuronen. Nach der Entwicklung dieses Präparats beschrieben Forscher den Ort der Aktionspotentialsinitiierung in Neuronen und ebneten Forschern auf dem Gebiet der Neurophysiologie den Weg, mechanische Transduktion sowie die Propriozeption von Gliedmaßen nicht nur bei Wirbellosen, sondern auch bei Wirbellosen zu erforschen. Dies ist ein hervorragendes Präparat, um viele Grundlagen der Neurophysiologie zu lehren.