Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler und Studenten in Physiologiekursen zu sein, die an physiologischen Experimenten teilnehmen. Die Schüler lernen, Kontraktionen im Hinterdarm des Krebses freizulegen und aufzuzeichnen. Ein weiterer Schritt besteht darin, den Hinterdarm aus dem Tier herauszuschneiden, was eine direkte Anwendung von Verbindungen ermöglicht.

Als nächstes werden die Kraft und der Rhythmus der Kontraktionen der glatten Muskulatur des Hinterbauchs überwacht, während verschiedene pharmakologische Wirkstoffe angewendet werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Stärke der Kontraktion verändern. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Wirkung von Modulatoren auf das neuronale Innere oder direkt auf den Muskel auf der Grundlage pharmakologischer Assays und Rezeptorsubtypisierung zeigen. Hallo, ich bin Dr.J. Mercier vom Department of Biological Sciences an der Brock University.

Ich habe den Hinterdarm der Krebse als Vorbereitung für die Erforschung von Neurotransmittern verwendet, die die viszerale Muskulatur steuern. Ich habe dieses Präparat auch als Lehrmittel verwendet und im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Robin Cooper an der University of Kentucky perfektionieren wir eine Reihe von Experimenten, die von Studenten durchgeführt wurden, für Lehrzwecke. Diese Methode kann Aufschluss über die Funktion des Krebs-Hangdarms geben.

Es kann auch in Studien zu Krankheiten angewendet werden, wie z. B. bei Krankheiten, die an peristaltischen Rhythmen beteiligt sind. Es kann auch verwendet werden, um die Mechanismen zu beschreiben, die die Modulation der Muskel- und Nerveninnervation unterstreichen. Die Studierenden lernen, physiologische und pharmakologische Daten durch den Einsatz von pharmakologischen Wirkstoffen, Neurotransmittern und Neurohormonen zu interpretieren und erwerben ein allgemeines Verständnis der Rezeptorfunktion.

In Bezug auf Agonisten und Antagonisten erstellen die Studierenden Dosis-Wirkungs-Kurven und präsentieren die Daten in grafischer Form für die statistische Analyse. Um das Tier zu betäuben, legen Sie einen Krebs mit einer Körperlänge von sechs bis 10 Zentimetern für fünf bis 10 Minuten auf Eis. Halten Sie den betäubten Krebs mit einer Hand hinter den Krallen hervor. Schnell von der Augenhöhle bis zur Mitte des Kopfes auf beiden Seiten abschneiden und dann den Krebs köpfen.

Das Blut aus dem Präparat wird klebrig sein, wenn es versucht wird, also wasche die Werkzeuge, wenn sie fertig sind. Als nächstes schneidest du die Beine und die Krallen ab. Dann die linke und rechte Schwanzflosse, wobei die mittlere Schwanzflosse entlang der Rückenseite des Hinterleibs geschnitten wird, bis das letzte Segment erreicht ist.

Schneiden Sie dann entlang des letzten Segments und auf der anderen Seite nach unten. Nehmen Sie die Rückenschale ab. Legen Sie die präparierten Krebse in die mit Sigar ausgekleidete Petrischale.

Arme Krebssalzlösung. Um das Präparat abzudecken, werden Präpariernadeln verwendet, um das Präparat an der Petrischale zu befestigen. Der Hinterdarm ist in der Regel von einer Masse aus Blutgefäßen und Bindegewebe umgeben.

Entferne diese mit einer Pinzette. Darauf achten, den Darm nicht zu schädigen. Der Hinterdarm ist nun entlang des Bauches sichtbar.

Lassen Sie das präparierte Krebspräparat etwa 10 Minuten in der Kochsalzlösung ruhen, damit es sich von dem Schock der Dissektion und der Exposition gegenüber Kochsalzlösung erholen kann. Achten Sie auf die langsamen peristaltischen Kontraktionen des Hinterdarms. Zu Beginn kann nun die Rate der Kontraktionen berechnet werden.

Zählen Sie die Anzahl der Wehen, die in 30 Sekunden auftreten, und notieren Sie sie in einem Protokoll. Notieren Sie auch die Art der auftretenden Kontraktionen und ob sie peristaltisch oder spastisch sind. Notiere die Richtung aller peristaltischen Wellen.

Zählen Sie die Rate der Kontraktionen in der Nähe des Anus und in der Mitte des Bauches und prüfen Sie, ob es Unterschiede zwischen diesen beiden Regionen gibt. Halten Sie eine Vielzahl von Testlösungen bereit und haben Sie die gleiche Temperatur wie die Badesalzlösung. Die erste Lösung, die hier getestet wird, ist ein mikromolares Serotonin, das in Krebssalzlösung hergestellt wird.

Entfernen Sie mit einer Pipette die Kochsalzlösung aus der Höhle des freiliegenden Bauches des Krebses und tragen Sie die eine mikromolare Serotoninlösung direkt auf den Hinterdarm auf. Warten Sie unmittelbar nach dem Hinzufügen der neuen Lösung 30 Sekunden und zählen Sie dann die Kontraktionen im Wert von 30 Sekunden in der Region in der Nähe des Anus und dann die nächsten 30 Sekunden der Kontraktionen auf halbem Weg entlang des Bauches. Notieren Sie diese Zahlen in einem Diagramm und notieren Sie sich auch die Art der Kontraktionen, die auftreten. Nächster.

Gießen Sie die Testlösung aus der Aufzeichnungsschale aus und spülen Sie den Hinterdarm mehrmals mit normaler Krebssalzlösung aus. Spülen Sie das Präparat dann alle 30 Sekunden fünf Minuten lang aus. An dieser Stelle können Sie die nächste Testlösung hinzufügen, bei der es sich in dieser Demonstration um ein mikromolares Topamin handelt.

Notieren Sie Ihre Beobachtungen wie zuvor und wiederholen Sie diesen Vorgang für den Rest der Testverbindungen. Wenn Sie mehrere Konzentrationen desselben Stoffes verwenden, achten Sie darauf, mit der niedrigsten Konzentration zu beginnen und mit höheren Konzentrationen zu arbeiten. Der Aufbau zur Messung der Kraft der gastrointestinalen Kontraktionen umfasst einen Laptop mit der Software Lab Chart Seven, den Bridge Pod, das Power Lab, 26 T und den Kraftaufnehmer.

Bevor Sie die Kraft der Magen-Darm-Muskelkontraktionen messen können, müssen Sie den Magen-Darm-Trakt isolieren. Um dies zu erreichen, schneiden Sie die Muskeln im letzten Bauchsegment ab, platzieren Sie zwei oder mehr Stifte durch die weiche ventrale Nagelhaut auf beiden Seiten des Anus, schneiden Sie dann den Rest des Bauches ab und lassen Sie den Hinterdarm und den Anus an einem kleinen Stück Nagelhaut befestigt. Der Darm sollte in der Nähe der Verbindung von Brustkorb und Bauch geschnitten werden.

Bringen Sie nun den Magen-Darm-Trakt in eine flache Schale mit einem mit Sarde beschichteten Boden. Es gibt ein Blutgefäß, das entlang der dorsalen Seite des Magen-Darm-Trakts verläuft. Ziehen Sie diesen vorsichtig vom Magen-Darm-Trakt weg.

Gießen Sie frische Krebssalzlösung auf die Zubereitung. Schieben Sie den Kraftaufnehmer auf die Präparation. Schauen Sie sich den Stift, der an der Unterseite des Kraftaufnehmers befestigt ist, genau an.

Das Ende, das sich am Darm verhakt, hat eine kleine Biegung. Haken Sie die kleine Biegung des Stifts in das abgeschnittene Ende des Hinterdarms ein. Nachdem du den Hinterdarm eingehakt hast, bewege die Schale leicht, bis der Hinterdarm gespannt ist.

Seien Sie vorsichtig bei diesem Schritt, da der Darm straff, aber nicht zu eng sein sollte. Eine zu enge Haltung kann den Muskel schädigen. Wenn sich die Schüssel in der optimalen Position befindet, verwenden Sie Wachs oder Ton, um die Schüssel ruhig zu halten.

Starten Sie als Nächstes die Software. Um mit der Aufzeichnung zu beginnen, öffnen Sie die Labordiagramm-Software. Schließen Sie das Lab-Diagramm, Willkommenscenter.

Gehen Sie oben links zu Setup. Klicken Sie unten links auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Kanaleinstellungen so, dass nur ein Kanal vorhanden ist.

Klicken Sie rechts auf dem Bildschirm auf OK. Wechseln Sie zu Kanal eins mit offenem Bridge-Pod. Stellen Sie den Bereich auf die empfindlichste Einstellung ein, in diesem Fall 200 Mikrovolt oben in der Tabelle in der rechten Ecke.

Stellen Sie die Zyklen pro Sekunde auf 2K ein. Sie können jetzt mit der Aufnahme beginnen. Klicken Sie auf Start, um sicherzustellen, dass das Setup ordnungsgemäß funktioniert.

Berühren Sie die Schallkopfspitze leicht mit einer Pipette. Sie sollten eine Änderung der Kraft sehen, die von der Software aufgezeichnet wird. Klicken Sie in der Software auf Stopp, dann auf Start und lassen Sie das Programm laufen.

Klicken Sie etwa 20 Sekunden lang auf Stopp und fügen Sie einen Kommentar mit der Bezeichnung Kochsalzlösung hinzu. Berechnen Sie die Kontraktionsrate nur, indem Sie die Zeit vom Beginn einer Auslenkung bis zum Beginn der nächsten messen oder indem Sie die Gesamtauslenkung über ein oder zwei Minuten zählen. Berechnen Sie die Rate als Kontraktionen pro Minute oder als Kontraktionen pro Sekunde, je nachdem, wie schnell sie auftreten.

Um die Kraft von Kontraktionen zu messen, verwenden Sie ein relatives Maß, um Kontraktionen unter verschiedenen Bedingungen in der gespeicherten Datei zu vergleichen. Bewegen Sie den Marker M auf die Grundlinie, bewegen Sie dann den Cursor auf den Gipfel der Ablenkung und notieren Sie sich den Wert, der oben rechts auf dem Bildschirm angezeigt wird. Dies ist ein Delta-Wert, der die Differenz von M zum Peak darstellt.

Beachten Sie, dass der Cursor an der Spitze stationär gehalten werden muss, um die Änderung zu messen. Bewegen Sie dann den M-Marker und den Cursor auf die nächste Wellenform von Interesse und wiederholen Sie den Takt, um die Wirkung von Modulatoren zu untersuchen. Schalten Sie bei diesem Präparat die Kochsalzlösung langsam auf eine Testlösung um.

In diesem Fall ein mikromolares Serotonin und fahren Sie mit der Aufzeichnung der Geschwindigkeit und Kraft der Kontraktionen als letzter Test fort. Für dieses Präparat testen Sie, ob Gap-Junction-Inhibitoren die Geschwindigkeit oder Kraft der Kontraktionen verändern, Gap-Junction-Inhibitoren umfassen eine Hepatitis Ethanol oder Kochsalzlösung, die mit Kohlendioxid geblasen wurde. Diese Verbindungen werden zuletzt verwendet, da sie die Muskelfasern nach längerer Exposition schädigen können. Um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen zu vergleichen, stellen Sie die Daten in einer Tabelle grafisch dar.

Eine weitere interessante Anwendung dieses Präparats ist die Aufzeichnung der Kraft, die von den kreisförmigen Muskeln erzeugt wird. Wenn Sie jedoch Gap-Junction-Hemmer auf Ihr Präparat angewendet haben, können die Inhibitoren die Kreismuskulatur geschädigt haben, in diesem Fall sollten Sie ein frisches Hinterdarmpräparat verwenden, um die Kreismuskulatur zu testen. Um die kreisförmigen Muskeln freizulegen, schlitzen Sie die Röhre des Darms in einer Längsebene mit einer feinen Schere auf.

Mit feinen Stecknadeln eine Seite fest an der Schüssel feststecken. Befestigen Sie den Hakenstift am Wandler an der anderen Seite des Streifens. Setzen Sie das Präparat den gleichen Verbindungen aus, die an den Längsmuskeln getestet wurden, wird hier die Beziehung zwischen den getesteten Verbindungen und die Anzahl und Art der Kontraktionen gezeigt.

Sie können die Anzahl der Kontraktionen über die Zeit für die Kochsalzlösung, das Serotonin und das Glutamat grafisch darstellen. Sie können die Anzahl der Kontraktionen im Vergleich zur Kraft der Kontraktionen in Millivolt für die salzhaltigen Serotoninglutamatlösungen grafisch darstellen. Diese Transplantate können sowohl für die Längs- als auch für die Zirkularmuskulatur durchgeführt werden, um zu testen, ob die Längs- und Zirkularmuskulatur in den verschiedenen Regionen des Darms unterschiedliche Reaktionen auf die verschiedenen Modulatoren zeigt.

Die obigen Experimente können an verschiedenen Regionen vom Anus bis zum Bauch wiederholt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie darauf achten müssen, den Magen-Darm-Trakt nicht mit der Pinzette zu beschädigen und nicht zu stark mit dem Kraftaufnehmer zu ziehen. Andere Methoden, wie z. B. elektrophysiologische Aufzeichnungen des Muskels, können durchgeführt werden, um andere Probleme wie Ionenkanalfunktionen und -modulationen zu behandeln, und die als Modell und andere Gewebe in anderen Tiermodellen dienen können.