Name: Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie physiologische Experimente am Krebsdarm durch Präparation, Kontraktionsmessung und pharmakologische Tests. Diese Methode vermittelt Studierenden Einblicke in Neurophysiologie und Rezeptorfunktion.

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Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts &amp; Sciences.

1. Einführung Die jüngsten umfassenden Überblick über die Krebse Enddarm wurde in einer Dissertation von Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), die in erster Linie auf serotonerge Modulation und Innervation (Musolf et al., 2009 konzentriert eingehalten ). Krustentier hindguts wurden erstmals vor über 100 Jahren von Alexandrowicz, ein Pionier in der vergleichenden Anatomie (Alexandrowicz, 1909), der die verschiedenen Aspekte ihrer Innervation beschrieben untersucht. Forschung weiterhin im Laufe der Jahre, die Identifizierung der Art der Muskelschichten und Architektur, Bewältigung der Gesamtfunktion der Enddarm in Osmoregulation für das ganze Tier, und die Prüfung modulatorische Kontrolle über Enddarm Kontraktilität durch verschiedene Verbindungen (siehe Review von Musolf, 2007). Es ist interessant festzustellen, dass die anale Teil der Enddarm wirkt nicht nur auf Kot zu vertreiben, sondern auch für die Aufnahme der Wasser aus der Umgebung für die Osmoregulation. Diese Region des Darms kann nach vorne zu unterziehen oder Reverse Peristaltik abhängig von dem Tier braucht. Alexandrowicz (1909) identifizierten zwei Nervengeflechte innervieren die Krustentier Enddarm, eine innere und eine äußere Plexus Plexus, die sich später als reiche Quellen werden zur Identifizierung und Charakterisierung Neurotransmitter. In den 1950er Jahren Dr. Ernst Florey begann eine Reihe von pharmakologischen Studien über die Krebse Enddarm und gezeigt, dass Kontraktionen moduliert durch Acetylcholin und seine verwandten Verbindungen und auch von Adrenalin und Noradrenalin (Florey, 1954) sind. Florey, der Entdecker der eine hemmende Substanz bekannt als "Factor-I", untersuchten die Auswirkungen dieser Substanz auf verschiedene Präparate, darunter die GI-System in Krebsen (Florey, 1961). Factor-I wurde später gezeigt, dass GABA werden. So spielte die Krebse Enddarm eine wichtige Rolle in den frühen Studien der synaptischen Hemmung. Nach der Entdeckung von GABA, waren andere vermeintliche Sender auch gezeigt, dass mit dem Enddarm Plexus in Verbindung gebracht werden und physiologischen Reaktionen zu entlocken. Solche Sender enthalten Dopamin (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) zwei orcokinin Peptide (NFDEIDRSGFGFN und AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) und eine myosuppressin Peptid (Mercier et al 1997;... wahrscheinlich pQDLDHVFLRFamide, vgl. Stemmler et al 2007). Jede dieser Substanzen moduliert spontane Enddarm Kontraktionen, und alle außer GABA zu sein scheinen exzitatorischen. Der Enddarm reagiert auch auf Glutamat und Quisqualat (Jones, 1962;. Wrong et al 2003), aber eindeutige Beweise für glutamatergen Innervation wurde nicht berichtet. Zelluläre Botenstoffe, die die Auswirkungen der verschiedenen Sender vermitteln, sind noch weitgehend unerforscht, aber es gibt Beweise für die Beteiligung von cAMP in Dopamin Fähigkeit, Kontraktionen (Knotz &amp; Mercier, 1995) zu erhöhen. Obwohl der Krebs Enddarm Verträge spontan folgende Denervierung sind solche Kontraktionen in der Regel schwach und unorganisiert (Wales, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Peristaltische Bewegung erfordert ein abgestimmtes Motorleistung aus dem zentralen Nervensystem, offenbar mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). In Krebse, ist die Motorleistung auf den Enddarm durch die 7 th abdominale Wurzel, die 75 Axone, deren Zellkörper in den letzten Abdominalganglion (Kondoh &amp; Hisada, 1986) lokalisiert enthält, durchgeführt. Zumindest einige der Peptide scheinen auf den Enddarm Plexus von Neuronen mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Dircksen et al 2000..; Mercier et al 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986) geliefert werden, aber Dopamin wird durch Neuronen in mehr geliefert vorderen Ganglien (Mercier et al. 1991a). Da Motorleistung durch das 7. Abdominal Wurzel notwendig ist für große, koordinierte Kontraktionen, ist es wahrscheinlich, dass einige oder alle der vermeintlichen Sender oben aufgeführten in irgendeiner Weise die Peristaltik beitragen. Ihre relative Beiträge sind jedoch nicht bekannt. Einige Einblicke kann durch die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf die Ring-und Längsmuskeln getrennt (Mercier &amp; Lee, 2002) gewonnen werden. Neben der Steuerung der Bewegung der unverdauten Nahrung, erscheint das Nervengeflecht mit dem Krustentier Enddarm verbunden, um eine wichtige endokrine Funktion mit Häutung verbundenen spielen. Der Enddarm der Taschenkrebs, Carcinus maenas, enthält endokrinen Zellen, die Krebs hyperglycemic Hormon und die damit verbundenen Vorläuferpeptid Freisetzung während ecdysis (Webster et al. 2000), was auf eine Rolle in Wasseraufnahme und Schwellungen im Zusammenhang mit der Häutung. So beteiligt sich das Krustentier Enddarm in mehreren wichtigen physiologischen Prozessen. Dieser Bericht ist in erster Linie ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler und Studenten in Physiologie Kurse, die in Experimenten teilnehmen. Die Bedeutung sowie die möglichen Mechanismus hinter, wie der Enddarm Verträge und Funktionen können von den Schülern angesprochen werden. Pharmakologische Wirkstoffe, Neurotransmitter und Neurohormone wird verwendet werden, und Dosis-Wirkungs-Kurven konstruiert werden, die die Schüler, wie zu erwerben und zu interpretieren, physiologische und pharmakologische Daten zu engagieren. Ein allgemeines Verständnis der Rezeptor-Funktion im Hinblick auf Agonisten und Antagonisten können auch erreicht werden. Die Schüler lernen auch, um Daten in grafischer Form zur statistischen Analyse zu präsentieren. Es ist sehr leicht zu zerlegen und aufzeichnen Kontraktionen aus der Krebse Enddarm. In der sezierten Vorbereitung, ist der Darm leicht an körperfremde Substanzen ausgesetzt. Die Veränderung in peristaltische Aktivität kann visuell oder mit einem Kraftaufnehmer, die auch überwachen kann die Kraft der Kontraktionen beobachtet werden. Aufgrund seiner Einfachheit und Zuverlässigkeit als Bioassay Vorbereitung ist die Krebse Enddarm noch sehr nützlich für die Untersuchung von vielen Fragestellungen über die Mechanismen der Peristaltik, Modulation der Motorleistung und der Muskelkontraktion und-Rezeptor-Funktion. Der Enddarm ist auch für die Prüfung Insektizide, crustaceancides und Schadstoffe, für spezifische Mechanismen der Aktionen nützlich. 2. Methoden 2,1) Materialien <ul><li> Flusskrebs </li><li> Krebse Kochsalzlösung </li><li> Dissektion Instrumente (Grob-und einer feinen Schere, grob &amp; feinen Pinzette) </li><li> Sylgard-Talsohle Petrischale </li><li> Stahl Sezieren Pins </li><li> Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten) </li><li> Parafilm (zum Abdecken &amp; Mischen von Lösungen) </li></ul> 2,2) Dissection <ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii) messen 6-10 cm in Körperlänge sollte auf Eis 5 bis 10 Minuten gegeben werden, um das Tier zu betäuben, bevor Dissektion beginnt. </li><li> Halten Sie den narkotisierten Krebse hinter den Klauen mit einer Hand. Schnell, aus der Augenhöhle in die Mitte des Kopfes auf beiden Seiten abgeschnitten, und dann enthaupten die Krebse (Anmerkung: das Blut aus der Vorbereitung wird klebrig sein, wenn es trocknet, so waschen Sie die Werkzeuge, wenn abgeschlossen). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Enthauptung von Flusskrebsen </li><li> Schneiden Sie die chelipeds und Laufbeinen. </li><li> Schneiden Sie den linken und rechten Heckflossen, nur Verlassen der Mitte Heckflosse (uropod). </li><li> Auf der Rückenseite des Krebses Schnitt ventral an der linken und rechten Seite des dorsalen Kutikula. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Entfernen von Dorsal Cuticle </li><li> Cut quer auf der Rückenseite der Kutikula, um sicherzustellen, dass der Schnitt flach, um Schäden an der GI verhindern Dann entfernen Sie den unteren Abschnitt der dorsalen Bauch-Kutikula. </li><li> Setzen Sie den sezierten Krebse in einen Sylgard gesäumten Gericht. </li><li> Pin die Krebse, die Schüssel an der Spitze der Heckflosse. Man kann mehrere Stifte auf beiden Seiten der GI als notwendig, um den Körper gedrückt. </li><li> Füllen Sie die Schale mit Flusskrebsen Kochsalzlösung für den GI Achten Sie darauf, immer wieder übergießen GI mit Kochsalzlösung mit einer Pipette. Saline ist eine modifizierte Van Harreveld-Lösung (1936), die mit 205 mM NaCl hergestellt wird, 5,3 mM KCl; 13,5 mm CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 mm MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Die seziert Krebse sollte wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Dissected Flusskrebse mit GI intakt. </li></ol> 2,3) Experimente 2.3.1) Kontraktionen in der Tier- <ol><li> Haben Lösungen der zu testenden Verbindung bereit und bei der gleichen Temperatur wie die Bade-Kochsalzlösung. Am vielleicht nutzen individuelle Lösungen von Serotonin (100 nM, 1microM), Glutamat (1microM) und Dopamin (1microM) in Flusskrebse Kochsalzlösung als Ausgangspunkt zu testenden Substanzen hergestellt. </li><li> Lassen Sie den sezierten Krebse in die Krebse Lösung für ca. 10 Minuten sitzen, damit sie den Schock der Dissektion und Kochsalzlösung Belichtung einzustellen. Die langsame Peristaltik Kontraktionen aus dem Enddarm beginnen sollte, auftreten. </li><li> Sobald die Wehen beginnen, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die in 30 Sekunden (man beachte die Art der Kontraktionen, die auftreten, dh die Peristaltik Typ oder spastische, und die Richtung einer peristaltischen Wellen) auftreten. Tabelle 1: Die Kontraktionen in Crayfish Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Art der Kontraktionen </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Mit Hilfe eines piPette, entfernen Sie die Salzlösung in den Hohlraum der Krebse ist ausgesetzt Bauch, und wenden Salzlösung, die die Substanz direkt auf den Enddarm untersucht werden. </li><li> Unmittelbar nach Zugabe der Lösung, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen, (dh peristaltische oder spastische) auftreten. Tabelle 2: Die Kontraktionen mit der Exposition gegenüber Verbindungen <table border="1"><tbody><tr><td> Compound getestet </td><td> Konzentration </td><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Art der Kontraktionen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Unmittelbar nach der Aufnahme die Reaktion auf die Testsubstanz, spülen Sie die GI mehrmals mit normalen Krebse Kochsalzlösung. Lassen Sie die Vorbereitung für 5 Minuten stehen lassen, während Spülen etwa alle 30 Sekunden mit Flusskrebsen Kochsalzlösung. </li><li> Mit einer Pipette Ort einige Kochsalzlösung mit der nächsten Verbindung zu prüfende oder ein abwechslungsreiches Konzentration der letzten Substanz getestet direkt auf den Enddarm. Am besten ist es mit einer geringeren Konzentration und Arbeit seinen Weg zu höheren Konzentrationen zu starten. </li><li> Unmittelbar nach Zugabe von jedem neuen Stoff oder jede neue Konzentration, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen. </li></ol> 2.3.2) Recording Kräfte der Kontraktion in herausgeschnitten Vorbereitungen <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Setup <ol><li> Bringen Sie den Schwinger an der Brücke pod. </li><li> Bringen Sie die Brücke pod auf die PowerLab 26T. </li><li> Bringen Sie die PowerLab 26T an den USB-Anschluss am Computer. </li><li> Öffnen LabChart7, indem Sie auf den labchart7 Symbol auf dem Desktop. <ul><li> Die LabChart Welcome Center-Box öffnet sich. Schließen Sie es. </li><li> Klicken Sie auf Setup </li><li> Klicken Sie auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 (unten Kasten links) drücken OK. </li><li> An der oberen linken Ecke des Diagramms stellen Sie den Zyklen pro Sekunde bis etwa 2k. Setzen Sie den Volt (y-Achse) bis etwa 500 oder 200 mV. </li><li> Klicken Sie auf Kanal 1 auf der rechten Seite des Diagramms. Klicken Sie auf Eingang Verstärker. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen: single-ended, AC-gekoppelt, und (invertiert das Signal bei Bedarf), Invertzucker und Anti-Aliasing, werden überprüft. </li><li> Um die Aufnahme zu starten drücken beginnen. </li></ul></li><li> Pick-up der Vorbereitung und schneiden Sie die GI-Trakt an der Nahtstelle zwischen dem Brustkorb und den Bauch. Dann vorsichtig um die telson Teil der Schwanz abgeschnitten. Nehmen Sie die GI-Trakt aus dem seziert Krebse und legen Sie sie in die Sylgard Gericht. Es ist ein Blutgefäß, das entlang der Dorsalseite des GI-Trakt führt. Ziehen Sie diese von der GI-Trakt. Füllen Sie frische Krebse Kochsalzlösung auf die Vorbereitung. </li><li> Legen Sie die Kraftaufnehmer in die Klemme in der Nähe des seziert Krebse. </li><li> Haken Sie die Kraftaufnehmer in die Krebse GI wie in Abbildung 5 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Isolierte Enddarm des Krebses in Kochsalzlösung an den Haken des Kraftaufnehmers </li><li> Warten Sie, bis die GI beginnt zu kontrahieren, und drücken Sie Start auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop", und fügen Sie einen Kommentar gekennzeichnet, "Saline only". Füllen Sie das Tabelle 4. Tabelle 4: Die Kontraktionen mit der Verbindung von Interesse <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Amplitude der Kontraktionen (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Fügen Sie die Test-Verbindungen von Interesse, und sofort push "start" auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop" und fügen Sie einen Kommentar direkt im Diagramm-Datei, welche Substanz zugegeben und die Konzentration. Füllen Sie das untenstehende Tabelle. Tabelle 5: Die Kontraktionen mit _________ Verbindung <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Kontraktionen </td><td> Amplitude der Kontraktionen (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Spülen Sie das Präparat mit Flusskrebsen Kochsalzlösung mit einer Pipette. </li><li> Fügen Sie andere Stoffe oder verschiedenen Konzentrationen in einer ähnlichen Weise. Unmittelbar push "start" auf dem LabChart7. </li><li> Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop", und fügen Sie einen Kommentar und Label direkt auf den Diagramm-Datei unter Angabe der compound verwendet und die Konzentration. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Von 2.3.1 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) gegen die Zeit. Erklären Sie keine Trends. </li><li> Von 2.3.2 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) vs die Amplitude der Kontraktionen in mV. Erklären Sie keine Trends. </li></ol> 3,1) messen die Geschwindigkeit und Kraft der Kontraktionen Zur Index der Preise von Kontraktionen auf die Zeit vom Beginn an einer Biegung an den Anfang des nächsten Taktes oder zählen die insgesamt Ausschläge über ein oder zwei Minuten. Die Werte können dann in Form von Kontraktionen pro Minute oder pro Sekunde, je nachdem wie schnell sie auftreten gestellt werden. Zur Index die Kraft der Kontraktionen ein relatives Maß verwendet werden, um unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. Auf die gespeicherte Datei kann man mit der Markierung "M" und bewegen Sie auf die Grundlinie. Dann nutzen Sie den Cursor und auf den Gipfel der Ablenkung bewegen und nehmen den Wert in der oberen rechten Ecke des Bildschirms als Delta-Wert (die Differenz von M bis zum Gipfel) notiert. Beachten Sie den Cursor muss stationär gehalten für das Maß der Veränderung werden. Dann bewegen Sie die M auf der nächsten Welle Form von Zinsen und wiederholen Sie die Messung.

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</ol>

Die Angaben in den zugehörigen Film und Text versehen beschreiben die wichtigsten Schritte, um die Aktivität in den Enddarm des Krebses in situ sowie in vitro aufzunehmen. Ein Ziel unseres Berichts ist es, das Bewusstsein für das Potenzial dieses Präparats Anstieg der Studierendenzahlen-run investigative Labors, die grundlegende Konzepte in Physiologie und Pharmakologie zu lehren. Diese Zubereitungen können verwendet werden, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die zu einem besseren Verständnis der physiologischen Funktionen der Enddarm führt zu untersuchen. Die zugrunde liegenden Mechanismen Regulierung der peristaltischen Wellen und ihre Umkehrung sind noch nicht bekannt. Die Mechanismen, die für eine höhere Kontrolle über den gesamten GI-Trakt sind auch nicht vollständig verstanden. Die Frage, wie höheren Zentren integrieren ihre Tätigkeit mit dem autonomen Ausgang, der direkt den GI-System bleibt eine offene Fläche von Ermittlungen (Shuranova et al., 2006). Darüber hinaus haben die osmoregulatorische Fähigkeiten des Krustentier Enddarm und die Funktionen der Osmoregulation während der Mauser und Umweltbelastungen nicht vollständig geklärt. Es gibt immer noch viele Fragen warten auf Antworten in dieser Zubereitung.

<ol><li> Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard-Krebse Kochsalzlösung: Geändert von Van Harreveld-Lösung (1936). (In mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Serotonin, Glutamat und Dopamin sind in Flusskrebse Kochsalzlösung. Alle Chemikalien sind von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. </li><li> Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette, feine Schere, Messer Messerhalter, # 26002-20 Insektennadeln (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten) </li><li> Sylgard-Talsohle Petrischale </li><li> Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten) </li><li> Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab 26T-Schnittstelle an einen Computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope. <li> Brücke pod für den Kraftaufnehmer (unterschiedliche Brücke Hülsen sind für verschiedene Arten von Kraftaufnehmern erforderlich). </li><li> MLT0402 (2 Gramm) Kraftaufnehmer ist das Forschungs-Klasse wie im Video gezeigt. MLT 0210 / D (10 mg-25 Gramm) und der MLT 500 / A (0-500g) sind die pädagogischen Qualitäten Wandler (ADInstruments). </li></ol>

physiologische experimente mit den crayfish enddarm: ein schülerlabor Übung

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Der Zweck des Berichts ist es, Dissektion Techniken zur Herstellung der Krebse Enddarm zu beschreiben und zu demonstrieren, wie die physiologischen Aufnahmen mit einem Kraftaufnehmer machen, um die Stärke der Kontraktion zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, wie man visuell überwachen peristaltische Aktivität, die als Bioassay für verschiedene Peptide, biogene Amine und Neurotransmitter verwendet werden können. Dieses Präparat ist zugänglich für Schülerlabore in Physiologie und für den Nachweis der pharmakologischen Konzepte für Studenten. Dieses Präparat wird seit über 100 Jahren, und es bietet immer noch soviel wie ein Modell für die Untersuchung der Entstehung und Regulation der Peristaltik Rhythmen und für die Beschreibung der zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Modulation. Die pharmakologischen Untersuchungen und Rezeptor-Sub-Typisierung, die vor über 50 Jahren auf dem Enddarm gestartet wurden noch dazu beitragen, Forschung heute. Diese robuste Vorbereitung ist gut an Ausbildung von Studenten in Physiologie und Pharmakologie geeignet.

In diesem Bericht zeigen wir Techniken, die verwendet werden, um die Biologie des Krebses Enddarm untersuchen lassen. Wir zeigen, wie ein Krebs Bauch sezieren und untersuchen die damit verbundenen Anatomie, Physiologie und Modulation der Aktivität. Die peristaltische Aktivität und Stärke der Kontraktionen werden mit einem Kraftaufnehmer.

Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

Der Zweck des Berichts besteht darin, Dissektionstechniken zur Präparation des Hinterdarms des Flusskrebses zu beschreiben und aufzuzeigen, wie physiologische Ableitungen durchgeführt werden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler in höheren Klassenstufen und für Studierende in Physiologiekursen zu sein, die an physiologischen Experimenten teilnehmen. Die Schüler lernen, Kontraktionen im Hinterdarm von Krebsen freizulegen und aufzuzeichnen. Ein weiterer Schritt besteht darin, den Hinterdarm aus dem Tier zu entnehmen, was die direkte Applikation von Substanzen ermöglicht.Anschließend werden die Kraft und der Rhythmus der Kontraktionen des glatten Darms beobachtet, während verschiedene pharmakologische Wirkstoffe appliziert werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Kontraktionsstärke verändern. Es werden Ergebnisse erhalten, die anhand pharmakologischer Assays und Rezeptorsubtypisierung die Wirkung von Modulatoren entweder auf die neuronale Innervation oder direkt auf den Muskel zeigen. Hallo, ich bin Dr. J. Mercier vom Department für Biologische Wissenschaften der Brock University.Ich verwende den Hinterdarm der Krebse als Präparation, um Forschung über Neurotransmitter durchzuführen, die viszerale Muskeln steuern. Ich setze diese Präparation außerdem als Lehrmittel ein, und im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Robin Cooper an der University of Kentucky entwickeln wir eine Reihe von von Studierenden durchgeführten Experimenten für den Unterricht. Diese Methode kann Einblicke in die Funktion des Hinterdarms der Krebse liefern.Es kann auch in Studien zu Erkrankungen angewendet werden, die peristaltische Rhythmen betreffen, sowie dazu genutzt werden, die Mechanismen zu beschreiben, die der Modulation von Muskel- und nervöser Innervation zugrunde liegen. Die Studierenden lernen, physiologische und pharmakologische Daten mithilfe von pharmakologischen Substanzen, Neurotransmittern und Neurohormonen zu interpretieren, und erwerben ein allgemeines Verständnis der Rezeptorfunktion.Was Agonisten und Antagonisten betrifft, so werden die Studierenden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellen und die Daten grafisch zur statistischen Analyse darstellen. Um das Tier zu betäuben, setzen Sie einen Krebs mit einer Körperlänge von sechs bis zehn Zentimetern für fünf bis zehn Minuten auf Eis. Halten Sie den betäubten Krebs mit einer Hand hinter den Scheren fest. Schneiden Sie schnell von der Augenhöhle bis zur Kopfmitte auf beiden Seiten und trennen Sie anschließend den Kopf des Krebses ab.Das Blut der Zubereitung wird klebrig sein, wenn es versucht wird, daher waschen Sie die Werkzeuge nach Beendigung gründlich. Schneiden Sie danach die Beine und die Scheren ab. Danach die linken und rechten Schwanzflossen, wobei die mittlere Schwanzflosse entlang der dorsalen Seite des Abdomens bis zum letzten Segment aufgeschnitten wird.Schneiden Sie dann entlang des letzten Segmentes und die andere Seite hinunter. Entfernen Sie die dorsale Schale. Legen Sie die präparierte Krebsart in die mit Siger ausgelegte Petrischale.Schwache Krebs-Salzlösung. Zum Abdecken der Präparation verwendete man Operationsstifte, um die Präparation in der Petrischale zu befestigen. Der Hinterdarm ist gewöhnlich von einem Geflecht aus Blutgefäßen und Bindegewebe umgeben.Entfernen Sie diese mit einer Pinzette, wobei darauf zu achten ist, den Darm nicht zu beschädigen. Der Hinterdarm ist nun entlang des Abdomens sichtbar.Lassen Sie das präparierte Krebsexemplar etwa 10 Minuten in der Salzlösung ruhen, damit es sich vom Schock der Präparation und der Exposition gegenüber der Salzlösung erholen kann. Achten Sie auf die langsamen peristaltischen Kontraktionen des Hinterdarms. Nun kann die Kontraktionsfrequenz bestimmt werden.Zählen Sie die Anzahl der Kontraktionen, die innerhalb von 30 Sekunden auftreten, und notieren Sie diese in einem Protokoll. Notieren Sie außerdem die Art der auftretenden Kontraktionen und ob sie peristaltisch oder spastisch sind. Achten Sie auf die Richtung eventueller peristaltischer Wellen.Zählen Sie die Kontraktionsfrequenz in der Nähe des Anus und in der Bauchmitte und prüfen Sie, ob es Unterschiede zwischen diesen beiden Bereichen gibt. Bereiten Sie verschiedene Testlösungen vor, die die gleiche Temperatur wie das Bad-Salz haben. Die hier zuerst getestete Lösung ist einmikromolare Serotoninlösung, hergestellt in Krebs-Salz. Entfernen Sie mit einer Pipette die Salzlösung aus dem Hohlraum des freigelegten Abdomens der Krebsartigen und geben Sie die eine Mikromolar-Lösung von Serotonin direkt auf den Hinterdarm. Unmittelbar nach Zugabe der neuen Lösung warten Sie 30 Sekunden und zählen dann 30 Sekunden lang die Kontraktionen im Bereich nahe dem Anus, danach zählen Sie die nächsten 30 Sekunden lang die Kontraktionen in der Mitte des Abdomens. Notieren Sie diese Zahlen in einer Tabelle und vermerken Sie außerdem die Art der auftretenden Kontraktionen. Weiter.Geben Sie die Testlösung aus der Aufnahmeschale ab und spülen Sie den Hinterdarm mehrmals mit normaler Krebs-Ringer-Lösung aus. Anschließend spülen Sie das Präparat fünf Minuten lang alle 30 Sekunden erneut aus. Danach können Sie die nächste Testlösung hinzufügen, die in dieser Demonstration ein Mikromolar Topamin beträgt.Notieren Sie Ihre Beobachtungen wie zuvor und wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Testsubstanzen. Wenn mehrere Konzentrationen desselben Stoffes verwendet werden, beginnen Sie unbedingt mit der niedrigsten Konzentration und arbeiten Sie sich zu höheren Konzentrationen vor. Die Versuchsanordnung zur Messung der Kraft der GI-Kontraktionen umfasst einen Laptop mit Lab-Chart-7-Software, den Bridge-Pod, das PowerLab, 26 T und den Krafttransducer.Bevor Sie die Kraft der Kontraktionen der gastrointestinalen Muskulatur messen können, müssen Sie den Magen-Darm-Trakt isolieren. Schneiden Sie hierzu die Muskeln im letzten Bauchsegment weg, stechen Sie zwei oder mehrere Nadeln durch die weiche ventrale Kutikula auf beiden Seiten des Anus und entfernen Sie anschließend den Rest des Abdomens, wobei das Hinterdarm und der Anus an einem kleinen Stück Kutikula befestigt bleiben. Der Darm sollte nahe der Verbindung zwischen Thorax und Abdomen durchtrennt werden.Verschieben Sie nun den Magen-Darm-Trakt in eine flache Schale mit einem mit Sardinen beschichteten Boden. Entlang der dorsalen Seite des Magen-Darm-Trakts verläuft ein Blutgefäß. Ziehen Sie dieses vorsichtig vom Magen-Darm-Trakt ab.Geben Sie frische Krebs-Salzlösung auf das Präparat. Bewegen Sie den Krafttransducer über das Präparat. Untersuchen Sie genau den Stift, der an der Unterseite des Krafttransducers befestigt ist.Das Ende, das am Darm befestigt wird, weist eine kleine Biegung auf. Haken Sie die kleine Biegung der Nadel an das durchtrennte Ende des Hinterdarms. Nachdem der Hinterdarm befestigt ist, bewegen Sie die Petrischale leicht, bis der Hinterdarm straff gespannt ist.Seien Sie vorsichtig bei diesem Schritt, da der Darm straff, aber nicht zu fest sein sollte. Zu starke Spannung könnte den Muskel beschädigen. Wenn die Petrischale in der optimalen Position ist, verwenden Sie Wachs oder Ton, um die Schale festzuhalten.Als Nächstes starten Sie die Software. Öffnen Sie die Lab-Chart-Software, um mit der Aufnahme zu beginnen. Schließen Sie die Lab-Chart- und die Welcome-Center-Anwendung.Wechseln Sie oben links zur Einrichtung. Klicken Sie unten links auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Kanaleinstellungen, sodass nur ein Kanal vorhanden ist.Klicken Sie rechts auf dem Bildschirm auf „Okay“. Gehen Sie zum Kanal eins, öffnen Sie die Bridge-Pod. Stellen Sie die Empfindlichkeit auf die empfindlichste Stufe ein, in diesem Fall 200 Mikrovolt, oben in der rechten Ecke des Diagramms.Stellen Sie die Zyklen pro Sekunde auf 2K ein. Sie können nun mit der Aufnahme beginnen. Klicken Sie auf „Start“, um sicherzustellen, dass die Einrichtung ordnungsgemäß funktioniert.Berühren Sie die Transducer-Spitze leicht mit einer Pipette. Sie sollten eine Änderung der vom Software erfassten Kraft sehen. Klicken Sie in der Software auf „Stop“, dann auf „Start“ und lassen Sie das Programm laufen.Klicken Sie etwa 20 Sekunden lang auf „Stop“ und fügen Sie einen Kommentar mit der Bezeichnung Salzlösung hinzu. Berechnen Sie die Kontraktionsrate, indem Sie die Zeit von Beginn einer Ausschlagung bis zum Beginn der nächsten messen oder indem Sie die Gesamtanzahl der Ausschläge über eine oder zwei Minuten zählen. Berechnen Sie die Rate je nach Häufigkeit der Kontraktionen in Kontraktionen pro Minute oder in Kontraktionen pro Sekunde.Um die Kraft von Kontraktionen zu messen, verwenden Sie eine relative Messgröße, um Kontraktionen unter verschiedenen Bedingungen in der gespeicherten Datei zu vergleichen. Bewegen Sie die Markierung M zur Basislinie, dann verschieben Sie den Cursor zur Spitze der Ausschlagung und notieren Sie den Wert, der oben rechts auf dem Bildschirm angezeigt wird. Dies ist ein Delta-Wert, der die Differenz von M bis zur Spitze angibt.Beachten Sie, dass der Cursor am Peak stationär gehalten werden muss, um die Änderung messen zu können. Bewegen Sie dann den M-Marker und den Cursor zur nächsten interessierenden Wellenform und wiederholen Sie die Messung, um die Wirkung von Modulatoren zu untersuchen. Wechseln Sie bei dieser Präparation langsam die Salzlösung zu einer Testlösung.In diesem Fall eine Mikromolar Serotonin zugeben und die Aufzeichnung der Kontraktionsfrequenz und -kraft als letzten Test fortsetzen. Bei dieser Versuchsanordnung testen, ob Hemmstoffe der Nexus-Kontakte die Frequenz oder Kraft der Kontraktionen verändern; zu den Hemmstoffen der Nexus-Kontakte gehören ein Hep-Ethanol oder physiologische Kochsalzlösung, die mit Kohlendioxid durchblubbert wurde. Diese Verbindungen werden zuletzt verwendet, da sie nach längerer Einwirkung die Muskel­fasern schädigen können. Um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen zu vergleichen, die Daten in einem Diagramm darstellen.Eine weitere interessante Anwendung dieser Präparation besteht darin, die von den Ringmuskeln erzeugte Kraft aufzuzeichnen. Wenn Sie jedoch Gap-Junction-Inhibitoren auf Ihre Präparation angewendet haben, könnten die Inhibitoren die Ringmuskeln beschädigt haben; in diesem Fall sollten Sie eine frische Hinterdarmpräparation verwenden, um die Ringmuskeln zu testen. Um die Ringmuskeln freizulegen, schneiden Sie das Darmrohr mit einer feinen Schere in einer Längsebene an.Verwenden Sie feine Nadeln, um eine Seite sicher an der Schale zu befestigen. Befestigen Sie den Haken der Nadel am Wandler an der anderen Seite des Streifens. Setzen Sie das Präparat denselben Verbindungen aus, die zuvor an den Längsmuskeln getestet wurden; die Beziehung zwischen den getesteten Verbindungen und der Anzahl sowie Art der Kontraktionen ist hier dargestellt.Sie können die Anzahl der Kontraktionen in Abhängigkeit von der Zeit für die Salzlösung, Serotonin und Glutamat grafisch darstellen. Außerdem können Sie die Anzahl der Kontraktionen in Abhängigkeit von der Kontraktionskraft in Millivolt für die Salzlösung, Serotonin und Glutamat grafisch auftragen. Solche Darstellungen können sowohl für die longitudinale als auch für die zirkuläre Muskulatur durchgeführt werden, um zu prüfen, ob die longitudinale und zirkuläre Muskulatur in verschiedenen Darmabschnitten unterschiedliche Reaktionen auf die jeweiligen Modulatoren zeigt.Die oben beschriebenen Experimente können an verschiedenen Regionen vom Anus ausgehend entlang des Abdomens durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, den Magen-Darm-Trakt mit der Pinzette nicht zu beschädigen und den Kraftsensor nicht zu stark zu belasten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie elektrophysiologische Ableitungen der Muskulatur durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen wie die Funktion und Modulation von Ionenkanälen zu untersuchen, die als Modell auch für andere Gewebe in weiteren Tiermodellen dienen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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