Modellierung biologischer Membranen mit Leiterplatten und Messung elektrischer Signale in Axone: Schülerlabor Übungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie biologische Membranen mithilfe elektrischer Modelle verstanden werden können, und um Verfahren zur Ableitung von Aktionspotentialen aus dem ventralen Nervenstrang der Krebse zu demonstrieren. Diese Demonstration verwendet zunächst Bauteile einer Schaltung auf einer Steckplatine, um die elektrischen Eigenschaften von Membranen darzustellen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Widerstand und die Kapazität in einer Modellschaltung zu variieren, um die Auswirkungen auf die Spannungsverläufe zu beobachten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Konzepte, die aus einem Modellkreislauf gelernt wurden, auf eine lebende Nervenpräparation anzuwenden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Ableitung von zusammengesetzten Aktionspotentialen und das Verständnis der Eigenschaften von Schwellen-, Refraktärzeiten und synaptischer Übertragung. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie die Untersuchung von Modellen elektrischer Schaltkreise biologischer Membranen und Eigenschaften lebender Nerven nützliche Lehrmittel darstellen können, wie durch die Veränderung der Komponenten eines Modellkreislaufs und durch die Variation der Stimulation des lebenden Nervs demonstriert wird.

Diese Methode kann Einblicke geben, wie biologische Membranen anhand elektrischer Modelle verstanden werden können. Sie kann außerdem auf andere Gewebe wie Muskelgewebe angewandt werden. Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Präparation des ventralen Nervenstrangs und der Aufbau zur Ableitung anfangs schwierig sein können und sorgfältig darauf geachtet werden muss, die Nerven nicht zu beschädigen, um eine geeignete Anordnung zur Stimulation und Ableitung vom Nervenstrang zu erhalten.

Im ersten Teil des Experiments werden Widerstände und Kondensatoren verwendet, um die elektrische Aktivität der Nervenzellmembran zu simulieren. Der anfängliche Schaltkreis enthält lediglich Widerstände. Kondensatoren werden in einem späteren Schritt hinzugefügt.

Die passiven resistiven Eigenschaften der Nervenmembran werden durch die hier gezeigte Schaltung dargestellt. Die Steckplatine ist mit parallel geschalteten Widerständen von 33 Kiloohm aufgebaut, die den transversalen Membranwiderstand repräsentieren, sowie mit in Reihe geschalteten Widerständen von 10 Kiloohm, die den intrazellulären Widerstand repräsentieren. Diese Schaltung geht davon aus, dass der Widerstand der äußeren Flüssigkeit im Vergleich zu den intrazellulären und transversalen Membranwiderständen vernachlässigbar ist.

Wenn Ihr Modell einer Zelle fertiggestellt ist, verbinden Sie die Ausgangsleitungen des Power Lab mit dem Steckbrettmodell. Das Power Lab erzeugt den Reiz und verfügt über eine Messsonde zur Aufzeichnung der Spannung. Anschließend verbinden Sie das Power Lab mit dem Computer.

Der Computer dient zur Anzeige der elektrischen Signale, die von der Steckplatine aufgezeichnet werden. Im nächsten Schritt wird die Computer-Software eingerichtet, die den vom Power Lab an die Modell-Nervenzelle gesendeten Reiz steuert. Öffnen Sie das Lab-Chart-Programm vom Desktop aus.

Wählen Sie eine neue Datei, dann Setup und anschließend Kanaleinstellungen aus. Wählen Sie einen Kanal zur Anzeige aus, danach das Stimulator-Panel. Es werden lange Impulse mit 1,5 Volt benötigt.

Stellen Sie für diesen Teil des Experiments die Amplitude auf eine Volt ein. Das Power Lab gibt eine Spannung aus, die zwischen positiven und negativen 0,5 Volt schwankt, was einem Spitzenreiz von einem Volt entspricht. Stellen Sie die Frequenz auf 0,75 Hertz und die Impulsdauer auf eine Sekunde ein.

Wählen Sie für die Kanaleinstellungen Kanal eins zur Überwachung aus, klicken Sie auf den Eingangsverstärker und im daraufhin angezeigten Feld auf die Differential-Schaltfläche, stellen Sie den Bereich auf fünf Volt ein und wählen Sie „Okay“. Der nächste Schritt besteht darin, ein elektrisches Signal an das Nervenzellmodell anzulegen und den Signalverlust entlang der Länge des Modells zu untersuchen. Legen Sie eine Spannung an einem Ende des Stromkreises zwischen A und B an, indem Sie am Computer auf „Start“ klicken.

Messen Sie die Spannung pro erster Einheitslänge entlang des Modellaxons und verfolgen Sie diese am Computer. Halten Sie die rote Leitung der Spannungsmesssonde an Punkt A auf der Steckplatine fest, während Sie die andere Leitung an verschiedene Positionen zwischen den in Reihe geschalteten Widerständen bewegen. Achten Sie auf den Spannungsabfall an den weiter entfernten Stellen.

Beenden Sie nun die Aufnahme, indem Sie am Computer auf „Stop“ drücken. Messen Sie die gespeicherten Spannungsunterschiede anhand der auf dem Computer gespeicherten Spuren, indem Sie mithilfe des Cursors die Spur zu jedem aufgezeichneten Puls verschieben. Verwenden Sie den im unteren linken Bereich befindlichen M-Marker-Cursor, um den tiefsten Punkt der Spur zu markieren, und platzieren Sie den freien Cursor am höchsten Punkt der Spur, um den Spannungsunterschied zu messen.

Lesen Sie die Spannungsdifferenzmessung vom Bildschirm ab und notieren Sie sie in Ihrem Protokoll für jeden Messort entlang der Schaltung. Der nächste Schritt besteht darin, die Längenkonstante der Modellzelle zu berechnen, die verwendet wird, um die exponentielle Abnahme des Signals mit zunehmender Entfernung zu beschreiben. Tragen Sie jeden Wert der Spannungsdifferenz in ein Diagramm der Potentialdifferenz über die Entfernung von der Quelle auf, wobei die Membranwiderstände als eine Einheit betrachtet werden.

Bestimmen Sie zusätzlich zu Ihrem Diagramm die Längskonstante dieses Stromkreises. Die Längskonstante einer Nervenfaser ist definiert als die Distanz, über die eine Membranpotentialdifferenz auf 37 % ihres ursprünglichen Werts am Entstehungsort abfällt. Um die passiven Kabeleigenschaften von Nerven- und Muskelzellen besser zu simulieren, wird die Modell-Nervenzelle so erweitert, dass sie sowohl resistive als auch kapazitive Komponenten enthält.

Es ist nicht nur ein transversaler Membranwiderstand in der Nervenzellmembran vorhanden, sondern auch eine Oberflächenmembrankapazität, die das Signal der Nervenzelle verfälscht. Um dies zu simulieren, schließen Sie 10 Mikrofarad-Kondensatoren parallel zur transversalen Membran an. Widerstände auf dem Steckbrett am Computer.

Stellen Sie den Stimulator auf eine Sekunde und einen Volt ein, was einer Amplitude von 0,5 Volt und Impulsen von 0,75 Hertz entspricht. Stellen Sie außerdem oben rechts im Bedienfeld die Aufnahmerate auf 20 K pro Sekunde ein. Klicken Sie anschließend auf Kanal eins auf der rechten Seite des Bildschirms.

Klicken Sie im Feld auf den Eingangsverstärker. Klicken Sie auf die Differenzial-Schaltfläche und stellen Sie den Bereich auf fünf Volt ein. Bestätigen Sie mit OK.

Um diese Änderungen zu speichern, klicken Sie auf Start, um mit der Datensammlung zu beginnen. Messen Sie die Daten an denselben Stellen entlang der Steckplatine. Verwenden Sie nach der Datenerfassung das Zoom-Fenster, um die Anstiegszeit eines der Rechteckimpulse zu vergrößern.

Wiederholen Sie die Vergrößerung nach Bedarf, um die Spur zu strecken. Messen Sie die Zeit, die das Signal benötigt, um vom Grundniveau bis zum höchsten Punkt der Spannungsspur anzusteigen, kurz bevor es sich einpendelt.

Beobachten Sie den zeitlichen Verlauf der Potentialänderung und die Verzerrung der rechteckförmigen Impulse. Achten Sie ebenfalls darauf, ob die gemessene Spannung mit dem M-Cursor und dem freien Cursor wie zuvor beschrieben über 0,2 Volt liegt, lesen Sie die Spannungsänderung ab und notieren Sie die Daten in Ihrem Laborbuch, wobei Sie eine Schwellenspannung von 0,2 Volt annehmen. Messen Sie die Zeit, die das Potential benötigt, um die Schwelle an jedem Membranwiderstand zu erreichen.

Tragen Sie Ihre Ergebnisse als Zeit über Distanz auf, und erhöhen Sie die Dicke der Myelinscheide, wodurch eine Abnahme der Membrankapazität verursacht wird. Simulieren Sie dies, indem Sie die 10-Mikrofarad-Kondensatoren auf der Steckplatine durch kleinere 0,1-Mikrofarad-Kondensatoren ersetzen. Wiederholen Sie das vorherige Experiment.

Beachten Sie die Änderung der Zeit, die benötigt wird, um die Schwelle bei einem ausgewählten Widerstand zu erreichen. Überlagern Sie die Daten mit den größeren Kondensatoren auf dem vorherigen Diagramm der Zeit in Abhängigkeit von der Distanz. Eine Zunahme der Dicke der Markscheide ermöglicht es elektrischen Signalen, schneller in einer Nervenzelle anzusteigen und abzufallen, und erhöht somit die Leitungsgeschwindigkeit.

Im nächsten Teil des Experiments werden die elektrochemischen Eigenschaften von Axonen im ventralen Nervenstrang der Krebse untersucht. Die Eigenschaften der passiven Stromausbreitung, die in den Modellkreisen dargestellt werden, sind ebenfalls in lebenden Präparaten zu beobachten. Allerdings ist ein Aktionspotential erforderlich, sobald ein Signal über eine Distanz von wenigen Millimetern übertragen werden muss, da die passiven elektrischen Eigenschaften der Zellen die Signale über diese Distanz hinweg abschwächen würden.

Wenn Signale entlang der Bauchwurzel des Krebses mit unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten wandern, werden die schnellsten zuerst beobachtet und die langsameren leicht verspätet. Einige der Signale summieren sich bei der Ableitung, abhängig von der Population von Axonen mit ähnlichen Leitungsgeschwindigkeiten. Dieses summierte elektrische Signal aus mehreren Axonen wird als zusammengesetztes Aktionspotential bezeichnet.

Die nächste Versuchsreihe konzentriert sich auf die Ableitung von zusammengesetzten Aktionspotentialen aus den Nerven der Krebse, um den ventralen Nervenstrang des Krebses zu erhalten. Bereiten Sie zunächst die Nervenpräparationschale, die Dissektionsinstrumente und die Salzlösungen vor. Legen Sie den Krebs etwa fünf Minuten lang auf Eis, um ihn zu betäuben.

Wenn die Krebsschere betäubt ist, wickeln Sie sie in ein feuchtes Papierhandtuch und halten Sie sie mit einer Hand fest, wobei die Scheren zwischen Daumen und Zeigefinger liegen. Führen Sie mit der anderen Hand einen Schnitt mit der Schere durch den Rostrum zwischen den Augenhöhlen. Schneiden Sie von dort aus nach unten, bis der Kopf vollständig abgetrennt ist.

Entfernen Sie die Scheren und Laufbeine. Führen Sie einen Schnitt an der Basis des cephalischen Thax oberhalb des Abdomens durch und lösen Sie den cephalischen Thax ab. Entfernen Sie den Schwanz und die Schwimmbeine.

Führen Sie einen Schnitt entlang beider Seiten der Bauchseite des Abdomens durch. Achten Sie darauf, tiefere Gewebe nicht zu beschädigen. Klappen Sie den freigelegten Teil des Exoskeletts bis zur Basis des Schwanzfächers zurück, um den ventralen Nervenstrang freizulegen.

Entfernen Sie mit der Kante der Pinzette vorsichtig die Bauchnerbengeflechtspitze. Achten Sie darauf, das Nervenstrang nicht zu dehnen oder zu zerquetschen. Eventuell am Nervenstrang beobachtete Knötchen sind Krebsganglien.

Legen Sie das Nervenband über die Metallstäbe in der Nervenkammer. Es ist unerlässlich, das ventrale Nervenband feucht zu halten. Um dies zu erreichen, geben Sie so viel Salzlösung für Krebse in die Nervenkammer, dass der Flüssigkeitsstand auf gleicher Höhe mit den Metallquerverstrebungen liegt.

Als Nächstes pipettieren Sie so viel von der Garnelen-Physiologischer Lösung ab, dass der Flüssigkeitspegel gerade die Unterseite der Stäbe berührt. Sobald das Nervenstrang in Position ist, befestigen Sie das Stimulationskabel mit den beiden Mini-Hakenleitungen an der Nervenkammer. Verbinden Sie die positive rote Leitung mit einer der äußeren Metallschleifen am Ende des Nervenstrangs und die negative schwarze Leitung mit der benachbarten Metallschleife, die ebenfalls mit dem Nervenstrang in Kontakt steht.

Verwenden Sie den Manipulator, um die Saugnadel in der Nähe des Nervenendes zu positionieren, das gegenüber den negativen und positiven Leitungen liegt. Saugen Sie vorsichtig die Spitze des ventralen Nervenstrangs in die Ableitelektrode. Befestigen Sie die Elektrode am Kopfverstärker-Probengeber, indem Sie einen Draht der Saugnadel mit dem positiven Eingang des Gebers und den anderen Draht mit dem negativen Eingang verbinden.

Es spielt keine Rolle, welcher Draht mit welchem Eingang verbunden wird. Die Sonde kann mit Hilfe eines Silberchlorid-Drahtes an die Faraday-Kabine oder das Salzbad angeschlossen werden, oder sie wird mit dem Masse-Eingang des Differenzverstärkers verbunden, um ein potentielles 60-Hertz-Rauschen zu verringern. Befestigen Sie die Sonde am Differenzverstärker und schließen Sie den Verstärker an das Power Lab an.

Überprüfen Sie die Einstellungen für den Verstärker RS gemäß der Tabelle im beigefügten Artikel. Verbinden Sie das PowerLab mit dem Computer über das USB-Kabel. Öffnen Sie die Scope-Software auf dem Computerdesktop oben rechts auf dem Bildschirm.

Wählen Sie Kanal zwei aus und schalten Sie ihn aus. Passen Sie den Bildschirm an, sodass nur Kanal eins angezeigt wird, indem Sie den Balken in der Mitte zum unteren Bildschirmrand ziehen. Überprüfen Sie den Eingangsverstärker mit den in der begleitenden Publikation angegebenen Einstellungen.

Danach im Setup oben auf dem Bildschirm Stimulator auswählen, isolierten Stamm ausschalten und Verzögerung auf fünf Millisekunden, Dauer auf eine Millisekunde, zwei Impulse, ein Intervall von 15 Millisekunden, eine Reichweite von fünf Volt und eine Amplitude von 0,5 Volt einstellen. Um die Stimulation des ventralen Nervenstrangs zu beginnen, auf die Schaltfläche „Start“ unten links auf dem Bildschirm klicken. Ein deutlich definierter Aktionspotential sollte im Datenerfassungsfeld des Oszilloskops erscheinen.

Skizzieren Sie die allgemeine Form des Aktionspotentials in Ihrem Laborbuch. Verringern Sie langsam die Spannung mithilfe der Registerkarte oben links auf dem Bildschirm. Das Aktionspotential sollte in seiner Amplitude kleiner werden, bis sein charakteristisches Wellenmuster verschwindet.

Wenn die Spannung verringert wird, nimmt die Anzahl der Neuronen ab, die zur zusammengesetzten Aktionspotentialwelle beitragen; um den Effekt schrittweise umzukehren, erhöht man die Spannung sukzessive. Mit zunehmender Rekrutierung von Neuronen wächst die Amplitude der zusammengesetzten Aktionspotentialwelle. Diese Übung verdeutlicht, dass einzelne Neuronen unterschiedliche Schwellenwerte aufweisen, bei denen ihre Aktionspotentiale ausgelöst werden.

Wenn eine weitere Erhöhung der Reizspannung keine Zunahme des zusammengesetzten Aktionspotentials bewirkt, sind alle Neuronen rekrutiert, und auf dem Computerbildschirm sollten zwei deutliche Peaks in der Aktionspotentialwelle sichtbar sein. Der nächste Teil des Experiments untersucht die Refraktärzeit von Axonen. Ändern Sie die Verzögerung zwischen den Impulsen mithilfe des Tabs in der oberen linken Ecke des Bildschirms.

Verkürzen Sie die Verzögerung so lange, bis das zweite zusammengesetzte Aktionspotential nicht mehr ausgelöst werden kann. Die absolute Refraktärzeit ist definiert als die Zeitverzögerung zwischen den Reizen, bei der ein zweites Aktionspotential nicht mehr ausgelöst wird. Die relative Refraktärzeit ist definiert als die Zeit vom Ende der absoluten Refraktärzeit bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Applikation eines zweiten Reizes ein Aktionspotential mit voller Amplitude erzeugt.

Sie können nun die Eigenschaften eines Hemmstoffs für Gap-Junctions wie Heptanol untersuchen. Die Unterschiede im zusammengesetzten Aktionspotential können bei gleichen Stimulationsbedingungen verglichen werden, um festzustellen, welche Signale über Gap-Junctions entlang des ventralen Nervenstrangs geleitet werden. Sie könnten auch kalte oder warme Salzlösung verwenden und die Unterschiede in den Leitungsgeschwindigkeiten der verschiedenen Komponenten des zusammengesetzten Aktionspotentials messen.

Hier werden zwei zusammengesetzte Aktionspotentiale gezeigt, die vom ventralen Nervenstrang einer Krebsart aufgezeichnet wurden. Diese Abbildung veranschaulicht die relative Refraktärphase, also die Zeit unmittelbar nach einem vollständigen zusammengesetzten Aktionspotential, in der ein zweiter Reiz ein kleineres zusammengesetztes Aktionspotential auslöst. Diese Abbildung zeigt die Wirkung von Heptanolethanol auf das zusammengesetzte Aktionspotential nach diesem Verfahren.

Die Bestandteile des biologischen Membrankreises können variiert werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen, wie beispielsweise die Wirkung einer veränderten Dichte von Leckkanälen in der Membran oder die Funktion spannungsabhängiger Kanäle nach ihrer Entwicklung. Diese Techniken und Verfahren eröffnen Forschern auf dem Gebiet der Physiologie neue Wege, um zu erforschen, wie Zellen als elektrische Schaltkreise funktionieren und wie Gap-Junctions in lebendem Gewebe von Tieren arbeiten.