Name: Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie DNA-Methylierung geprägter Gene in Arabidopsis-Endosperm mittels Bisulfit-Sequenzierung bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Analyse epigenetischer Regulation in der Pflanzenfortpflanzung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Frau Jennifer M. Lommel und Tara N. Rognan für die Wartung von Arabidopsis-Pflanzen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung von Saint Louis University und National Institutes of Health gewährt 1R15GM086846-01 und 3R15GM086846-01S1 zu W. Xiao unterstützt.

I. Genetische Crossing 1. Eine Schwächung des weiblichen Elternteils Um die mütterlichen und väterlichen Allele durch DNA-Sequenz-Polymorphismus, zwei verschiedene Ökotypen, zB Columbia-0 (Col-0) und Ler, wird als weiblich und männlich Eltern gewählt werden, zu unterscheiden. Die Pflanzen sollten jung und gesund. Man kann das weibliche Elternteil mit einem Binokular entmannen, Vergrößerungsspiegel Visier, oder mit bloßem Auge. Suchen Bühne-12 Blumen (Smyth et al., 1990) und entfernen Sie alle Blumen oder Schoten über und unter ihnen durch Abschneiden der Basis des Stiels mit der Schere. Sterilisieren Pinzette durch Eintauchen der Basis der Spitze vorsichtig in ein Becherglas mit 95% Ethanol, die alle Pollenkörner an der Zange wird zu entfernen und zu töten den Pollen als auch. Hebeln auseinander die Blütenknospen mit einer Pinzette und sanft Entfernen 4 Kelchblätter, 4 Blütenblätter, Staubblätter und 6, so dass die Stempel kahl und intakt. Versuchen Sie, um eine Beschädigung der Fruchtblätter während dieses Prozesses zu vermeiden. 2. Die Auswahl der Pollenspender und Durchführung Bestäubung Die besten Pollen Geber offene Blüten im Stadium 14 anthesed mit den Blütenblättern Erweiterung in einem 90 °-Winkel zu den Stempel (Smyth et al., 1990), in denen eine Menge von Pollen ist zu vergießen. Besorgen Sie sich die Blume an der Basis und knapp oberhalb des Stiels, die bewirkt, dass die Blume zu gespreizt. Staub das Stigma der vorbereiteten Stempel mit der Anthere. Nach der Bestäubung, wird das Stigma, mit dem gelben Pollen, die leicht unter dem Mikroskop beobachtet werden kann abgedeckt werden. 3. Labeling Kreuz Nach Bestäubung alle entmannt Stempel auf einer Pflanze, markieren wir das Kreuz mit einem Schmuck-tag und Informationen von weiblichen und männlichen Eltern und Datum. Legen Sie einen Pfahl in den Boden in der Nähe der Anlage, verwenden Sie einen String an den Stiel der Blüte auf den Scheiterhaufen binden, und decken den bestäubten Stempeln mit einer Plastiktüte. II. Isolierung von Endosperm Gewebe in Arabidopsis 1. Vorbereitung von Materialien Wir Regel erhalten notwendigen Materialien bereit vor der Ernte das Endosperm und Embryo Gewebe: eine flüssige Stickstoff-Tank, flüssiger Stickstoff, einem Binokular, zwei neue Paar feine Spitze Pinzette (5 INOX FST von Dumont Biologie, Schweiz.), Mikroskop Objektträger ( 3 "X 1" x 1,0 mm), einem pH 5,7 Lösung von 0,3 M Sorbit und 5 mM MES. 2. Sammeln Schoten Am 7 - oder 8-Tage-after-Bestäubung (DAP), sind die Samen bereit, an der mittleren bis späten Stadium der Embryogenese Torpedo geerntet werden und seziert für Endosperm und Embryo. Manchmal kann es dauern 9-10 DAP, wenn die entmannt Blumen zu jung sind. 3. Isolating Endosperm und Embryo Da Arabidopsis Samen sind winzig, verwenden wir ein Binokular auf Endosperm und Embryo zu isolieren. Setzen Sie ein 8-DAP Schote unter dem Mikroskop, verwenden Sie eine Pinzette, um die Schote Stiel halten und mit der Spitze eines anderen Zange zum Öffnen der Schote an den Rand, wo zwei Fruchtblätter Sicherung schieben. Verwenden Sie eine Pinzette zu holen einen Samen auf pH 5,7 Lösung von 0,3 M Sorbit und 5 mM MES, machen einen kleinen Schnitt an der Mikropyle Ende zu gleiten Embryo, drücken Sie die uncut Ende zu verdrängen Endosperm und separate Endosperm von Samenschale (Kinoshita et al., 2004). Setzen Sie den Embryo und Endosperm in separate Röhrchen in flüssigem Stickstoff. Setzen Sie diesen, bis wir Embryo oder Endosperm von 10 bis 15 Schoten sammeln und speichern Sie dann das Rohr in einem -80 ° C Gefrierschrank. In einigen Fällen, Endosperm nicht aus Samenschale, dh getrennt werden, kann man Gesamt-RNA aus dem Endosperm und Samenschale Mischung für die Gen-Imprinting-Analyse zu isolieren. III. Bisulfit-Sequenzierung 1. Benötigte Reagenzien Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur Herstellung von genomischer DNA, Restriktionsenzyme, 3 M NaOH (frisch zubereitet), 6,42 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit (2 M Natriummetabisulfit, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Molekulargewicht: 190), 10 mM Hydrochinon, ein DNA Purification Kit (Promega Wizard DNA Clean-up-System, Cat. # A7280), TE-Puffer, 6,3 M NaOH (frisch), 10 M NH 4 OAc, 20 ug / ul tRNA, und 100% Ethanol . 2. Details der Bisulfit-Behandlung-Protokoll <ol><li> Isolieren Sie genomische Endosperm oder der Embryo DNA mit einer CTAB-Verfahren (Rogers und Bendich, 1988). </li><li> Digest 100 ng - 2 ug genomische DNA in 20 ul bis 100 ul Gesamtvolumen mit Restriktionsenzymen, die außerhalb der Region analysiert werden abgeschnitten. Für die MEA-Promotor, verwenden wir XhoI, NdeI und PstI oder HindIII. </li><li> Denaturieren die Restriktionsenzyme durch Kochen der DNA für 5 Minuten und dann löschen auf dem Eis. </li><li> Add 1 / 9 Volumen (2,2 ul für 20 ul verdaute DNA) von 3 M NaOH und Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die Lösung für ein 250 ul PCR-Röhrchen. </li><li> Lösen von 7,5 g Harnstoff in 10 ml sterilem destilliertem Wasser; Langsam 7,6 g Natriummetabisulfit über 1-2 Stunden und Heizung hilft in der Regel lösen; pH-Wert auf 5 mit frisch zubereiteten 10 M NaOH; Add sterilem destilliertem Wasser zu einer endgültigen Volumen auf 20 mL. Dies ist 6.24 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit-Lösung. </li><li> Add 6,24 m Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit-Lösung auf eine Endkonzentration von 5,36 M und 3,44 M bzw. (Paulin et al., 1998). Fügen Sie z. B. 208 ul von 6,42 M Harnstoff / 4 M Natriumbisulfit Lösung für das obige 22,2 ul denaturierter genomischer DNA (Xiao et al., 2003). </li><li> Add 10 mM Hydrochinon, um die DNA in einer Endkonzentration von 0,5 mM (12 ul für 20 ul Verdauung). </li><li> Conduct Bisulfit-Behandlung in einer PCR-Maschine: 30 Zyklen von 55 ° C für 15 Minuten und 95 ° C für 30 Sekunden. </li><li> Desalt der Bisulfit-behandelten DNA mit Hilfe des Assistenten DNA Clean-Up-System von Promega und Follow-up des Protokolls (Jacobsen et al., 2000). </li><li> Messen Sie die exakte Volumen TE aus der Kolonne nach Entsalzung zurückgewonnen und fügen 6.3 M NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M. Bei 37 ° C für 15 Minuten. </li><li> Add 10 M NH 4 OAc (pH 7,0) bis zu einer Endkonzentration von 3 M, 2 ul von 20 ug / ul tRNA und 3 Volumen 100% Ethanol und dann mischen. Zentrifuge für 15 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen des Pellets einmal mit 70% Ethanol, nicht eine kurze Zentrifuge, und entfernen Sie zusätzliche Ethanol. </li><li> Dry Pellet in einem Speedvac für 5-10 Minuten und resuspendieren in 25 bis 100 ul TE-Puffer je nach Ausgangspunkt der DNA-Menge. Die Natrium-Bisulfit-behandelten DNA ist nun bereit für die PCR-Analyse. </li></ol> 3. PCR-Amplifikation <ol><li> Da nicht methylierter Cytosin in Uracil umgewandelt werden, ist es schwierig, ein großes Fragment mit der Bisulfit-behandelten DNA als Vorlage zu verstärken. So haben wir in der Regel Design-Primer, um ein Produkt nicht länger als 500 bp zu verstärken. Um Abfolge der 4-KB-MEA-Promotor, entwickelten wir viele Sätze von Primer und verstärkt 14 überlappende Fragmente auf die gesamte Region abdecken (Xiao et al., 2003). </li><li> Um Reihenfolge der Top-Strang, bei der Gestaltung eines Forward-Primer, I) wählen Sie einen G (Guanin)-reiche Region, um eine höhere Glühtemperatur ohne extra lang Nukleotide der Primer haben; II) ändern C (Cytosin) bis Y ( Pyrimidin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen C bis T (Thymin). In der Gestaltung eines Reverse-Primer, I) wählen Sie einen C-reiche Region; II) ändern G bis R (Purin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen G zu A (Adenin). </li><li> Um Abfolge der unteren Strang, bei der Gestaltung eines Forward-Primer, I) wählen Sie einen C-reiche Region; II) ändern G bis R am CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die übrigen G zu A. In der Gestaltung eines Reverse-Primer, I) wählen eine G-reiche Region; II) ändern C bis Y (Pyrimidin) bei CG-und CNG-Kontexten und ändern Sie die restlichen C bis T. </li><li> Wir in der Regel Verwenden Sie 1-2 ul der Natrium-Bisulfit-behandelten DNA als Vorlage für jedes PCR-Amplifikation (Xiao et al., 2003). Das PCR-Produkt muss durch Gel-Elektrophorese analysiert werden, um die richtige Größe des Fragments zu bestätigen, dann Gel gereinigt und kloniert in den TOPO TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) als Insert. Eine einzelne Kolonie wird aufgegriffen und kultiviert; Plasmid-DNA extrahiert und für die Sequenzierung. </li></ol> 4. Die Sequenzanalyse Das Prinzip der Bisulfit-Sequenzierung ist, dass methylierte Cytosin wird in Uracil durch hydrolytische Desaminierung durch eine hohe Konzentration von Natriumbisulfit bei pH 5,0, die als Thymin in PCR-Produkt wird verstärkt umgesetzt werden, während 5-Methylcytosin wird nicht durch Natriumbisulfit geändert werden und bleiben bis Cytosin nach PCR-Amplifikation (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992.). Nach Erhalt der Sequenzierung durch, vergleichen wir sie mit dem Strang-spezifische Vorlage, die für die PCR-Amplifikation verwendet wird. Wenn ein Cytosinrest in der Vorlage liest sich wie ein Thymin in der Sequenzierung Ergebnis bedeutet dies, dass das Cytosin nicht methyliert ist. Wenn ein Cytosinrest in der Vorlage bleibt ein Cytosin in der Sequenzierung, bedeutet dies, dass das Cytosin methyliert ist. IV. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Abbildung 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1 /"> Abbildung 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Es ist relativ leicht zu Embryo aus Endosperm und Samenschale getrennt, aber es ist mühsam, Endosperm von Samenschale trennen, vor allem für Saatgut auf Anfang oder Mitte-Torpedo Stadium der Embryogenese. Da Samenschale trägt nur eine sehr kleine Menge an Gewebe, für einige Gene, z. B., MEA und FWA, haben wir nicht zu Endosperm von Samenschale zu trennen. Das heißt, wir können RNAs aus einer Mischung von Endosperm und Samenschale Gewebe zu isolieren, zu überprüfen Ausdruck des mütterlichen und väterlic...

Vorräte <ul><li> Präpariermikroskop </li><li> Schere </li><li> Feine Spitze Pinzette </li><li> Schmuck Tag </li><li> Werk Stakes </li><li> String oder Twist-Ties </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;Polyethylen-Beutel </li><li> 3 &quot;X 1&quot; x 1,0 mm Mikropräparate </li><li> Flüssiger Stickstoff </li><li> Flüssigstickstoffbehältern </li><li> Heizblock </li><li> PCR Tubes </li><li> Thermocycler </li><li> Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> Microcentrifuge </li><li> Gel-Elektrophorese-Anlage </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 Pflanzen </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Pflanzen </li></ul> Reagenzien <ul><li> 70% Ethanol </li><li> 95% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li><li> 0,3 M Sorbitol und 5 mM MES-pH 5,7 </li><li> Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) </li><li> 100% Ethanol </li><li> Cholorform </li><li> Restriktionsenzyme </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6.3 M NaOH </li><li> 6,24 m Urea / 4 M Natriumbisulfit </li><li> Sterilem destilliertem H 2 O </li><li> 10 mM Hydrochinon </li><li> Wizard DNA Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 ug / ul tRNA </li><li> TE-Puffer </li><li> Die TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) </li></ul>

bestimmung der dna-methylierung von geprägten genen in arabidopsis endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana ist ein hervorragendes Modell-Organismus für die Untersuchung epigenetischen Mechanismen. Einer der Gründe ist der Verlust-of-function Nullmutante von DNA-Methyltransferasen lebensfähig ist, so dass ein System zu untersuchen, wie Verlust von DNA-Methylierung in einem Genom beeinflusst Wachstum und Entwicklung. Imprinting bezeichnet differentielle Expression von mütterlichen und väterlichen Allelen und spielt eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung Entwicklung in beiden Säugetier-und Pflanzenarten. DNA-Methylierung ist entscheidend dafür, ob die mütterliche oder väterliche Allele eines aufgedruckten Gen exprimiert wird oder zum Schweigen gebracht. In Blütenpflanzen gibt es eine doppelte Befruchtung bei der Reproduktion: eine Samenzelle befruchtet die Eizelle zum Embryo und einem zweiten Spermien Sicherungen mit der zentralen Zelle zu steigen, um Endosperm Form geben. Endosperm ist das Gewebe, in dem Imprinting tritt in Pflanzen. MEDEA, ein SET-Domäne Polycomb Gruppe Gen und FWA, ein Transkriptionsfaktor Regulierung der Blüte sind die ersten beiden Gene gezeigt, dass in Endosperm und ihren Ausdruck geprägt wird durch DNA-Methylierung und Demethylierung in kontrollierten Pflanzen. Um Imprinting-Status eines Gens und Methylierungsmuster in Endosperm zu bestimmen, müssen wir in der Lage sein Endosperm zunächst zu isolieren. Da Samen ist winzig in Arabidopsis, bleibt es schwierig, Arabidopsis Endosperm isolieren und untersuchen ihre Methylierung. In diesem Video-Protokoll, berichten wir, wie man eine genetische Kreuz zu führen, um Endospermgewebe aus Samen zu isolieren und den Methylierungsstatus von Bisulfit-Sequenzierung zu ermitteln.

Imprinting ist ein Phänomen in Pflanzen-und Säugetier Reproduktion. DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle in Mechanismen der Prägung. Isolating Endosperm und Bestimmung Methylierungsstatus von geprägten Genen in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kann schwierig sein. In diesem Protokoll, beschreiben wir, wie Endosperm isolieren und zu bestimmen Methylierung durch Bisulfit-Sequenzierung.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana ist ein hervorragender Modellorganismus zur Untersuchung epigenetischer Mechanismen. Einer der Gründe hierfür ist die Loss-of-Function-Nullmutante der DNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den DNA-Methylierungsstatus von genomisch geprägten Genen im Endosperm zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die weibliche Pflanze kastriert wird. Anschließend wird die weibliche Pflanze mit Pollen der männlichen Pflanze bestäubt.Anschließend wird das Endosperm aus dem kreuzbestäubten Samen isoliert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Bisulfat-Sequenzierung der Endosperm-DNA. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die mittels DNA-Sequenz-Polymorphismus in verschiedenen Ökotypen und der Bisulfat-Sequenzierung den DNA-Methylierungsstatus des mütterlichen oder väterlichen Allels eines imprägnierten Gens aufzeigen.Hallo, ich bin Dr. Yang Shaw aus dem Fachbereich Biologie der St. Louis University. Hallo, ich bin Matthew Ray im Labor von Dr. J und im Fachbereich Biologie der St. Louis University. Ich bin Diman Panu aus dem Labor von Dr. J.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion eines Rugby-Offiziers und zur Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus mittels Sulfite-Sequenzierung. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die durch DNA-Methylierung und -Demethylierung regulierte Genimprägung zu untersuchen. Beginnen wir also.Um dieses Verfahren zu beginnen, wählen Sie zwei verschiedene Arabidopsis-Ekotypen als weibliche und männliche Eltern, um die mütterlichen und väterlichen Allele anhand von DNA-Sequenz-Polymorphismen unterscheiden zu können. Hier werden Columbia zero und Landsberg Erecta als weibliche bzw. männliche Eltern gewählt. Achten Sie darauf, junge und gesunde Pflanzen auszuwählen.Kastrieren Sie die weibliche Pflanze mit Hilfe eines Stereomikroskops. Suchen Sie Blüten im Stadium 12 und entfernen Sie alle Blüten oder LICs oberhalb und unterhalb dieser, indem Sie die Basis des Stiels mit einer Schere abschneiden. Sterilisieren Sie die Pinzette, indem Sie die Spitze vorsichtig in ein Becherglas mit 95 %igem Ethanol eintauchen.Dadurch werden eventuelle Pollenkörner von der Pinzette entfernt und der Pollen abgetötet. Heben Sie die Blütenknospen vorsichtig mit der Pinzette auseinander und entfernen Sie sorgfältig vier Kelchblätter, vier Kronblätter und sechs Staubblätter, sodass der Fruchtknoten frei und unversehrt bleibt. Versuchen Sie, die Fruchtblätter während dieses Vorgangs nicht zu beschädigen.Der nächste Schritt besteht darin, den Pollenspender auszuwählen und die Bestäubung durchzuführen. Die besten Pollenspender sind offene Blüten im Stadium 14, bei denen die Blütenblätter in einem Winkel von 90 Grad zum Griffel stehen und eine große Menge Pollen freisetzen. Halten Sie die Blüte an der Basis und direkt über dem Kelch fest, wodurch sich die Blüte öffnet und der Staub freigesetzt wird. Bestäuben Sie das Stigma des vorbereiteten Griffels mit dem Staubbeutel.Nach der Bestäubung ist das Narbenorgan mit gelbem Pollen bedeckt, der leicht unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Nach der Bestäubung aller entmannten Pistillen einer Pflanze wird die Kreuzung mit einem Schmuckanhänger gekennzeichnet. Dabei Datum sowie die Angaben zu weiblichen und männlichen Eltern einschließen.Stellen Sie einen Pflock in den Boden in der Nähe der Pflanze. Befestigen Sie den Stängel der Pflanze mit einem Faden am Pflock und bedecken Sie die bestäubten Griffel mit einer Plastiktüte. Sieben oder acht Tage nach der Bestäubung (DAP) sollten die Samen zur Ernte bereit sein, und zwar im mittleren bis späten Torpedostadium der Embryogenese, und anschließend dissekiert werden.Für Endosperm und Embryo legen Sie eine acht Tage nach der Befruchtung (DAP) alte Salic unter das Stereomikroskop. Halten Sie mit einem Paar Pinzetten die EK-P-Zelle fest und verwenden Sie die Spitze eines weiteren Pinzettenpaares, um die Sohle am Rand, wo sich die beiden Karpelle verbinden, aufzuschieben. Verwenden Sie ein Paar BPS, um ein Samenkorn aufzunehmen und es auf einen Objektträger zu legen.Anschließend einen kleinen Schnitt am Mikropil-Ende machen, um den Embryo herauszuschieben. Das nicht geschnittene Ende zusammendrücken, um den Keimling auszupressen, und diesen von der Samenschale trennen. Danach Embryo und Endosperm in separate Mikroröhrchen geben und in flüssigen Stickstoff überführen.Wiederholen Sie dies, bis genügend Embryo oder Endosperm aus 10 bis 15 CLICs angesammelt wurde. Danach lagern Sie die Röhrchen vor der Bisulfitbehandlung bei minus 80 Grad Celsius ein. Isolieren Sie die genomische DNA aus Endosperm oder Embryo mithilfe einer modifizierten Trimethylammoniumbromid- oder CTAB-Methode.Nachdem die genomische DNA des Endosperms isoliert wurde, verdauen Sie 100 Nanogramm in einer Gesamtvolumenreaktion von 20 Mikroliter mit Restriktionsenzymen, die außerhalb des zu analysierenden Bereichs schneiden. Für den ME-Promotor werden die Restriktionsenzyme XhoI, HindIII und PSTI verwendet. Denaturieren Sie die Restriktionsenzyme, indem Sie die DNA fünf Minuten lang kochen.Anschließend die Reaktion auf Eis abbrechen. Ein Neuntel des Volumens oder 2,2 Mikroliter dreimolare Natronlauge hinzufügen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Lösung in ein 250-Mikroliter-PCR-Gefäß überführen.Als Nächstes stellen Sie eine 6,24 molare Harnstofflösung her, indem Sie 7,5 Gramm Harnstoff in 10 Milliliter steriler, destillierter Wasser unter langsamen Zugabe von 7,6 Gramm Natriummetabisulfit über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden auflösen, während die Lösung erhitzt und gerührt wird. Nach dem vollständigen Lösen wird der pH-Wert mit frisch hergestellter 10-molarer Natriumhydroxidlösung auf 5 eingestellt.Geben Sie sterile destillierte Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 20 Milliliter zu erreichen. Überführen Sie 208 Mikroliter dieser Lösung in 22,2 Mikroliter der denaturierten genomischen DNA aus Endosperm. Fügen Sie anschließend 12 Mikroliter frisch hergestelltes 10 Millimolar Hydrochinon zur DNA hinzu.Führen Sie die Bisulfitbehandlung in einem PCR-Gerät mit 30 Zyklen bei 55 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 95 Grad Celsius für 30 Sekunden, durch. Danach entsalzen Sie die bisulfitbehandelte DNA mithilfe des Wizard-DNA-Reinigungssystems von Promega. Messen Sie gemäß den Herstelleranweisungen das exakte Volumen des TE-Puffers, das nach der Entsalzung von der Säule eluiert wurde.Anschließend Natriumhydroxid auf eine Endkonzentration von 0,3 molaren zugeben. Die Mischung 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation Ammoniumacetat auf eine Endkonzentration von drei molaren, zwei Mikroliter TRNA mit 20 Mikrogramm pro Mikroliter sowie drei Volumina von 100 %igem Ethanol hinzufügen.Mischen Sie die Probe und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 14.000 U/min. Waschen Sie das Pellet einmal mit 70 % Ethanol, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation zur Entfernung des überschüssigen Ethanol. Trocknen Sie das Pellet abschließend fünf Minuten im Speed-Vakuum und resuspendieren Sie es in 25 Mikrolitern TE-Puffer. Die mit Natriumbisulfit behandelte DNA ist nun bereit für die PCR-Analyse. Um den vier Kilobasen langen Madea-Promotor zu sequenzieren, entwerfen Sie mehrere Primer-Sätze und amplifizieren 14 überlappende Fragmente, um die gesamte Region abzudecken. Beginnen Sie damit, einen vorwärtsgerichteten Primer zur Sequenzierung des oberen Strangs zu entwerfen.Wählen Sie zuerst eine guaninreiche Region aus, um eine höhere Annealing-Temperatur zu erreichen, ohne die Nukleotide in den Primern extra lang zu machen. Ändern Sie anschließend Cytosin in Thymin an CG- und CN-G-Stellen. Danach wird jedes andere Cytosin in Thymin umgewandelt.Bei der Konstruktion eines reversen Primers einen cytosinreichen Bereich auswählen. Guanin in Puringuanin an CG- und CNG-Stellen sowie jedes andere Guanin in Adenin umwandeln. Um den unteren Strang erneut zu sequenzieren, zunächst einen vorwärtsgerichteten Primer entwerfen.Wählen Sie einen cytosinreichen Bereich aus und ersetzen Sie Guanin durch Purin in CG- und CNG-Kontexten. Wandeln Sie die übrigen Guanine in Adenin um. Wählen Sie bei der Gestaltung des reversen Primers einen AINE-reichen Bereich.Wandeln Sie Cytosin in Paridin an CG- und CNG-Stellen um und ändern Sie die verbleibenden Cytosine in Thymin. Nachdem die Primer entworfen wurden, bereiten Sie eine PCR-Reaktion unter Verwendung von zwei Mikrolitern der Natriumbisulfit-behandelten DNA als Vorlage für jede PCR-Amplifikation vor. Führen Sie die PCR-Reaktion durch und analysieren Sie das Produkt mittels Gelelektrophorese, um die korrekte Größe des Fragments zu bestätigen.Nächsten Gel. Reinigen Sie das PCR-Produkt und klonen Sie es in den Invitrogen-TOPO-TA-Klonierungsvektor PCR 2.1. Als Insert verwenden und einzelne Klone sequenzieren. Das Prinzip der Bisulfitsequenzierung besteht darin, dass nicht methyliertes Cytosin aufgrund der hydrolytischen Desaminierung durch eine hohe Konzentration von Natriumbisulfit bei pH 5,0 in Uracil umgewandelt wird.Umgekehrt werden fünf Methylcytosin durch Natriumbisulfit nicht modifiziert. Uracil wird im PCR-Produkt als Thymin amplifiziert, während methyliertes Cytosin nach der PCR-Amplifikation als Cytosin erhalten bleibt. Nach Erhalt des Sequenzierungsergebnisses vergleichen Sie dieses mit der strandspezifischen Vorlage, die für die PCR-Amplifikation verwendet wurde.Wenn ein Cytosinrest in der Vorlage im Sequenzierungsergebnis als Thymin gelesen wird, zeigt dies an, dass das Cytosin nicht methyliert ist. Wenn ein Cytokinrest in der Vorlage im Sequenzierungsergebnis ein Cytosin bleibt, bedeutet dies, dass das Cytosin methyliert ist. Der Methylierungsstatus des mütterlichen MEA-Allels in der Region minus 500 Basenpaare des MEA-Promotors für fünf methylierte CPG-Stellen in den sequenzierten Klonen von Columbia, g Clarus gekreuzt mit RLD-Endosperm wird dargestellt; methylierte Cytosine sind durch schwarze ausgefüllte Kreise und unmethylierte Cytosine durch weiße nicht ausgefüllte Kreise gekennzeichnet. Ebenso wird der Methylierungsstatus für das mütterliche Madea-Allel von Columbia, Gladys gekreuzt mit RLD-Embryo dargestellt.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Endosperm isoliert und eine Sulfitemethylierungssequenzierung durchführt, wenn man dieses Verfahren anwendet. Es ist wichtig, daran zu denken, das Protokoll korrekt zu befolgen. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat...

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m5C Modifikation bei Arabidopsis

Die vorliegende Studie beschreibt den Workflow zur Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten, die durch Microarray-Technologien erhalten werden. Das Protokoll veranschaulicht die Schritte von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse. Alle Verfahren werden detailliert beschrieben, und das Video zeigt die wesentlichen Schritte.

Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Erfahren Sie, wie Sie DNA-Methylierung geprägter Gene in Arabidopsis-Endosperm mittels Bisulfit-Sequenzierung bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Analyse epigenetischer Regulation in der Pflanzenfortpflanzung.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Weitere Videos entdecken